KR100346818B1

KR100346818B1 - 어글리콘 이소플라본의 생산 방법

Info

Publication number: KR100346818B1
Application number: KR1020000012454A
Authority: KR
Inventors: 김세규; 김기복; 박명규
Original assignee: 주식회사 유젠바이오
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2000-03-13
Publication date: 2002-07-31
Also published as: KR20010091098A

Abstract

본 발명은 식물체로부터 추출된 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산하는데 있어서, 이소플라본 배당체를 흡착수지 컬럼에 통과시켜 수지에 흡착시키고, 상기 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 연속적으로 순환시켜 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 변환시킨 후 효소액을 회수하고, 상기 컬럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 것을 특징으로 하는 어글리콘 이소플라본의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 이용하면 기존의 방법보다 간단하고 간편한 공정을 통해 경제적으로 고함량의 어글리콘 이소플라본을 얻을 수 있다.

Description

어글리콘 이소플라본의 생산 방법{PROCESS FOR PRODUCING AGLYCONE ISOFLAVONES}

본 발명은 이소플라본(isoflavones)을 함유한 식물로부터 물 또는 알콜 추출에 의해 생산된 이소플라본 유도체 및 배당체를 흡착수지에 흡착시킨 후 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 순환시켜 어글리콘 이소플라본을 생산하는 방법에 관한 것이다.

이소플라본은 콩과식물, 칡 등의 식물종에 존재하는 천연화합물로서 여성호르몬의 일종인 에스트로겐과 유사한 구조를 가지며, 피토에스트로겐(phytoestrogen)과 같은 생리적 기능이 있음이 밝혀졌다. 이는 C₁₅H₁₀O₂의 분자식을 지닌 화합물군으로 제니스테인 (genistein),다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein) 및 이들의 글루코스 배당체, 나아가서는 아세틸화체, 말로닐화체(malonyl)등 합계 12종류가 천연의 상태로 존재하고 있는 이성체로 알려져 있으며 주로 배당체의 형태로 존재하는 물질이다. 또한 이들은 예전에 단순한 색소로만 여겨져 왔으나 최근의 연구들을 통해서 항암효과(Barnes,J. Nutr.,125:777s, 1995; Akiyama et al.,J. Biol. Chem.,262(2):5592, 1987; Molteni et al.,J. Nurt.,125:751s, 1995), 골다공증 예방(Shino et al.,Life Sci.,42(11):1123, 1988), 만성질환 예방(Fotsis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:2690, 1993), 항산화 효과(Naim et al.,J. Agric. Food Chem. 24(6):1174, 1976), 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase) 억제 작용(Keung and Vallee,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:1247, 1993), 전립선 암의 예방(Peterson and Barnes,The Prostate,22:335, 1993)등의 역할이 계속 밝혀지고 있다.

이와 같은 이소플라본은 자연 상태에서는 대부분이 이소플라본 배당체의 형태로 존재하는데, 배당체의 이소플라본은 위산에 의하여 배당체가 분해되지 않아 체내에서 그대로 흡수되지 않고 대장내에 존재하는 미생물에 의해 분비되는 효소의 작용을 받은 후에야 흡수되므로 흡수율이 낮은 단점이 있다(Barnes et al., 미국 특허 제 5,506,211 호). 반면에 어글리콘 형태의 이소플라본은 체내에서 부가적인 변환이 없이 위와 소장에서 직접 흡수가 되는 특성을 갖고 있다.

식물체로부터 이소플라본을 추출하는 종래의 방법으로서, 미국특허 제 5,679,806 호에서는 대두와 칡으로부터 에탄올이나 메탄올을 이용하여 추출, 정제하는 일련의 공정을 거쳐 이소플라본 배당체만을 추출해내는 기술을 제시하였으며, 미국특허 제 4,428,876 호에서는 대두를 가성소다로 추출한 후 일련의 공정을 거쳐 단백질, 올리고당, 사포닌, 이소플라본 배당체 등을 분리하는 방법을 제시하였다.

한편, 이소플라본 배당체를 어글리콘으로 전환시키는데는 크게 두가지 방법이 있다. 첫째는 산을 이용하여 이소플라본 배당체를 가수분해하는 방법인데, 이러한 산가수분해 방법들은 가혹한 조건에서 반응이 이루어지고, 공정 후 발생되는 폐수의 처리가 문제가 되며, 부가적인 정제공정 등의 번거로운 공정이 필요한 단점이 있다.

둘째는 베타글루코시다제를 이용한 효소가수분해 방법이다. 미국특허 제 6,015,785에서는 대두를 물에 넣고 일정량의 효소를 넣은 후 온도 40-60℃, pH 4-5에서 일정시간 반응시켜 어글리콘을 제조하는 방법에 대하여 기술하였다. 최연배 등(한국식품과학회지,Vol.31, No.1, 189-195(1999))은 대두 요구르트 제조시 유산균에 의한 이소플라본 배당체의 가수분해에 관하여 기술하였다. 일본특허 공개 제 11169127 호에서는 콩추출물에 베타글루코시다제를 넣고 25-65℃에서 30분 내지 3시간 정도 반응시켜 어글리콘 이소플라본으로 전환시킨 후 일련의 공정을 거쳐 두유를 제조하는 방법에 관하여 기술하였다. 일본특허 공개 제 11089589 호에서는 미생물에서 유래된 효소를 사용하여 콩배아의 이소플라본을 추출하지 않고 어글리콘으로 전환하는 기술에 대하여 기술하였다.

현재까지 알려진 대부분의 효소에 의한 어글리콘 제조방법에서는 이소플라본을 함유한 식물로부터 열수 혹은 알콜을 이용하여 이소플라본 배당체를 추출한 후,가수분해 효소를 넣어 일정 조건에서 반응시킨 다음 반응물을 흡착수지가 충진된 컬럼 등에 통과시키는 일련의 정제공정을 통하여 어글리콘 이소플라본을 제조하는데, 이 경우 매 추출물의 가수분해 반응시 매번 효소를 첨가하여 반응시킨 후 반응물을 흡착수지에 흘려보내 어글리콘을 흡착시키고 효소는 폐기하는 일련의 공정을 수회 내지 수십 회 반복한 다음 용매를 이용하여 흡착수지로부터 어글리콘을 회수해야하는 번거로움과 어려움이 있다. 또한 어글리콘 이소플라본은 배당체와는 달리 소수성이 강하여 상대적으로 물에 대한 용해도가 매우 낮다. 따라서 이소플라본 배당체를 효소로 가수분해시켜 제조된 어글리콘은 용해도의 저하로 인하여 흡착수지를 사용한 정제 공정시 오히려 수지에 흡착되지 않고 손실된다. 따라서, 추출된 배당체 이소플라본을 효소반응에 의해 어글리콘으로 전환시킨 후 정제하는 기존의 방법은 생산성이 낮을 뿐 아니라 생산비용의 증가 및 복잡한 제조공정 등의 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기의 복잡한 제조공정을 단순화시키고 생산비용을 절감할 수 있는 어글리콘 이소플라본의 효율적인 제조방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 열수 추출된 이소플라본 배당체 용액을 이소플라본 배당체가 충분히 흡착될 정도의 양으로 흡착수지 컬럼에 흘려보내 수지를 이소플라본 배당체로 포화시킨 후 배당체 분해효소인 베타글루코시다제를 일정온도 및 pH를 유지하면서 컬럼을 통해 순환시켜 배당체가 완전히 어글리콘으로 변환되도록 충분히 반응시킨 다음 이소플라본 어글리콘을 회수하는 단계들을 포함하는 어글리콘 이소플라본의 제조 방법을 개발하였다.

본 발명의 목적은 이소플라본 배당체로부터 간편하고 경제적이며 효과적으로 어글리콘 이소플라본을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 방법의 개요를 보여주는 모식도이다.

이소플라본 배당체를 함유한 식물로부터 물 및 알콜 추출에 의해 생산된 추출액의 상당부분을 차지하는 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산하는 본 발명의 방법은, 이소플라본 배당체 추출액을 이소플라본 배당체가 충분히 흡착될 정도의 양으로 흡착수지 컬럼에 흘려보내 수지를 이소플라본 배당체로 포화시키고, 배당체 분해효소인 베타글루코시다제를 일정온도 및 pH를 유지하면서 컬럼을 통해 순환시켜 배당체가 완전히 어글리콘으로 변환되도록 충분히 반응시킨 다음, 흡착수지에 부착된 생리활성이 높은 어글리콘 이소플라본을 회수하는 단계들을 포함한다.

본 발명의 방법의 각 단계를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 이소플라본 배당체를 함유한 추출액은 통상의 방법에 따라 얻을 수 있으며, 예를 들어, 이소플라본 배당체를 포함하는 식물(예: 대두(soybean), 칡, 토끼풀, 자주개자리, 검은콩 등)의 분말 40 내지 120 ㎏을 1.5 톤(t) 탱크(tank)에서 물 0.5 내지 1.2 t에 혼합하고, 열수 추출을 하기 위해 60℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 3시간 정도 스팀 가열한 후, 동일 온도에서 추출액에 4 노르말(N)의 염산을 가해 pH를 3.0 내지 8.0으로 조절한 다음 바로 데칸타(decantor, 연속원심분리기)로 통과시켜 추출액과 슬러지를 분리함으로써 얻을 수 있다. 다른 방법으로는 추출시에 알콜, 예를 들어, 에탄올을 70% 이상의 조건으로 사용하여 식물체를 추출한 후 pH를 조절하고, 원심분리하여 이소플라본 배당체를 함유하는 추출액을 얻을 수도 있다.

상기 방법으로 얻은 추출액을 30 내지 70℃에서 흡착수지가 충진된 칼럼에 유속이 분당 1 내지 4 리터 되게 흘려보내 총 이소플라본 배당체가 수지에 흡착되도록 한다. 이때 흡착수지로는 약간의 극성을 지니고 있거나 비극성인 수지가 바람직하며, 예를 들어, 아크릴릭 에스터(acrylic ester), 폴라메타크릴레이트(polymethacrylate)와 같은 아크릴계열의 수지나 폴리스티렌(polystyrene)과 같은 폴리아로마틱(polyaromatic)계열의 수지 등을 사용할 수 있다. 상용품으로서는 HP20(DIAION사 제품) 혹은 XAD-7(ROHM & HASS사 제품)을 예로 들 수 있다.

이소플라본 배당체를 함유한 식물 추출액을 모두 통과시킨 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한다. 한편으로 베타글루코시다제(β-glucosidase) 효소를 물에 넣고 수산화칼슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨 등의 산을 사용하여 pH 4.0 내지 8.0으로 조절하여 제조한 효소액을 컬럼에 연결된 순환 장치, 예를 들어, 온도 조절이 가능한 순환펌프가 달린 탱크, 온도조절이 가능한 칼럼 또는 온도를 유지할 수 있는 칼럼 등에 넣은 후, 25 내지 80℃에서 1시간 내지 72시간 동안 상기 컬럼을 통해 효소액을 순환시켜서 배당체 이소플라본이 어글리콘 이소플라본으로 전환되도록 효소반응을 시킨다. 이때 칼럼의 수지가 효소액속에 잠길정도로 효소액을 넣는데 효소액은 레진보다 약 10 cm 정도 더 높게 투입하는 것이 바람직하다. 또한, 효소액의 유속은 15 ㎖/분 내지 200 ㎖/분의 범위내에서 조절할 수 있다. 상기 효소반응에서 베타글루코시다제로서는 락타아제 에프(Lactase F, Amano사), 락토자임(Lactozyme, Novo사) 등의 상용품을 사용할 수 있으며, 효소의 양은 투여된 식물 분말을 기준으로 하여 0.01 % 내지 2 %의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

효소반응이 끝난 후, 효소액을 탱크에 회수하고 수지를 증류수로 세척한 후, 적절한 용출액을 컬럼에 흘려보내 컬럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수한다. 이때 용출액으로서는 에탄올, 메탄올 등을 사용할 수 있고, 70 % 이상의 에탄올이 바람직하며, 95% 에탄올이 가장 바람직하다. 회수의 종료는 260 nm에서 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 흡광도가 일정수준 이하일 때, 예를 들어, 흡광치가 0.01 이하로 내려갈 때를 기준으로 한다. 회수된 용출액을 40 내지 80℃에서 감압 농축하여 농축물을 얻고, 이 농축물을 30 내지 80℃에서 감압 건조함으로써 옅은 미황색의 어글리콘 이소플라본을 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 장치는 도 1에 예시된 바와 같은 구조를 가질 수 있으며 밸브를 통해 어글리콘 이소플라본을 회수할 수 있다. 또한, 사용이 끝난 효소는 재사용을 위해 순환장치에 회수되며, 효소의 활성이 감소된 경우 적절한 양을 추가로 보충할 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉

콩(대두) 분말 50 ㎏을 1.5 t 탱크에서 물 1.0 t에 혼합한 뒤 95℃에서 1시간정도 스팀 가열을 하여 열수 추출하였다. 80℃에서 추출액에 4 N 염산을 가하여 pH를 4.0으로 조절한 뒤 바로 데칸타(decantor)로 통과시켜 추출액과 슬러지를 분리하였다. 55℃에서 바로 추출액을 수지인 HP20(DIAION사 제품) 400 ℓ 칼럼에 분당 2 ℓ의 유속으로 흘려보내 총 이소플라본 배당체가 수지에 흡착되도록 하였다.

이어서, 총 이소플라본 배당체가 흡착된 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한 후, 40℃로 온도가 맞추어진 열교환 순환 탱크에서 락타아제 에프(Lactase F, Amano사) 효소를 콩 분말 중량의 0.5 %의 양으로 물에 넣고 수산화칼슘을 가하여 pH를 6.0으로 조절하여 제조된 효소액 180 L를 60 시간 동안 컬럼을 통해 순환시켜 배당체 이소플라본을 어글리콘 이소플라본으로 변환시킨 후 효소액을 회수하였다. 에탄올(95 %)을 흘려보내 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하고 HPLC(영린기기)에서 260 nm 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 약 80 % 이상의 배당체 이소플라본이 어글리콘으로 변환됨을 확인하였다. 회수의 종료 확인도 위와 같은 방법으로 하여 흡광치가 0.01 이하로 내려갈 때를 기준으로 하였다.

회수된 에탄올 용출액을 60℃에서 감압 농축하여 농축물을 얻었으며, 이 농축물을 65℃에서 감압 건조하여 옅은 미황색의 건조물 500 g을 얻었다. 이 중 총 이소플라본은 200 g이었다.

〈실시예 2〉

수지로서 XAD-7(ROHM & HASS사 제품) 400 ℓ가 충진된 칼럼을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 실시하여 콩 분말 50 ㎏으로부터 어글리콘 이소플라본을 함유하는 건조물 550 g을 얻었으며 이 중 총 이소플라본은 230 g이었다.

〈실시예 3〉

콩 배아 분말 50 kg을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 실시하여 어글리콘 이소플라본을 함유하는 건조물 540 g을 얻었으며 이 중 총 이소플라본은 220 g이었다.

〈실시예 4〉

콩 배아 분말 50 ㎏ 및 수지로서 XAD-7(ROHM & HASS사 제품) 400 ℓ가 충진된 칼럼을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 실시하여 어글리콘 이소플라본을 함유하는 건조물 570 g을 얻었으며 이 중 총 이소플라본은 240 g이었다.

〈실시예 5〉

콩 배아 분말 50 ㎏을 1.5 t 탱크에서 물 1.0 t에 혼합한 뒤 95℃에서 1시간정도 스팀 가열을 하여 열수 추출하였다. 80℃에서 추출액에 4 N 염산을 가하여 pH를 4.0으로 조절한 뒤 바로 데칸타로 통과시켜 추출액과 슬러지를 분리하였다. 55℃에서 바로 추출액을 수지인 HP20(DIAION사 제품) 400 ℓ 칼럼에 분당 2 ℓ의 유속으로 흘려보내 총 이소플라본 배당체가 수지에 흡착되도록 하였다.

이어서, 총 이소플라본 배당체가 흡착된 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한 후, 50℃로 온도가 맞추어진 열교환 순환 탱크에서 락토자임(Lactozyme, Novo사)효소를 콩 배아 중량의 약 1.0 %의 양으로 물에 넣고, 수산화칼슘을 가하여 pH를 7.0으로 조절하여 제조된 효소액 180 L를 60 시간 동안 컬럼을 통해 순환시켜 배당체 이소플라본을 어글리콘 이소플라본으로 변환시킨 후 효소액을 회수하였다. 에탄올(95 %)을 흘려보내 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하고 HPLC(영린기기)에서 260 nm 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 약 80 % 이상의 배당체 이소플라본이 어글리콘으로 변환됨을 확인하였다. 회수의 종료 확인도 위와 같은 방법으로 하여 흡광치가 0.01 이하로 내려갈 때를 기준으로 하였다.

회수된 에탄올 용출액을 60℃에서 감압 농축하여 농축물을 얻었으며, 이 농축물을 65℃에서 감압 건조하여 건조물 400 g을 얻었다. 이 중 총 이소플라본은 160 g이었다.

〈실시예 6〉

수지로서 XAD-7(ROHM & HASS사 제품) 400 ℓ가 충진된 칼럼을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 5의 방법과 동일하게 실시하여 콩 배아 분말 50 ㎏으로부터 어글리콘 이소플라본을 함유하는 건조물 500 g을 얻었으며 이 중 총 이소플라본은210 g이었다.

〈실시예 7〉

칡 분말 100 ㎏을 1.5 t 탱크에서 물 1.0 t에 혼합한 뒤 95℃에서 1시간정도 스팀 가열을 하여 열수 추출하였다. 80℃에서 추출액에 4 N 염산을 가하여 pH를 4.0으로 조절한 뒤 바로 데칸타로 통과시켜 추출액과 슬러지를 분리하였다. 55℃에서 바로 추출액을 수지인 XAD-7(ROHM HASS사 제품) 400 ℓ 칼럼에 분당 2 ℓ의 유속으로 흘려보내 총 이소플라본 배당체가 수지에 흡착되도록 하였다.

이어서, 총 이소플라본 배당체가 흡착된 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한 후, 60℃로 온도가 맞추어진 열교환 순환 탱크에서 락토자임(Lactozyme, Novo사)효소를 칡 중량의 약 1.5 %의 양으로 물에 넣고, 수산화칼륨을 가하여 pH를 7.0로 조절하여 제조된 효소액 180 L를 60 시간 동안 컬럼을 통해 순환시켜 배당체 이소플라본을 어글리콘 이소플라본으로 변환시킨 후 효소액을 회수하였다. 에탄올(95 %)을 흘려보내 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하고 HPLC(영린기기)에서 260 nm 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 약 80 % 이상의 배당체 이소플라본이 어글리콘으로 변환됨을 확인하였다. 회수의 종료 확인도 위와 같은 방법으로 하여 흡광치가 0.01 이하로 내려갈 때를 기준으로 하였다.

회수된 에탄올 용출액을 60℃에서 감압 농축하여 농축물을 얻었으며, 이 농축물을 65℃에서 감압 건조하여 건조물 1.05 kg을 얻었다. 이 중 총 이소플라본은 260 g이었다.

〈실시예 8〉

두부순물 5.0 t에 4 N 염산으로 pH를 4.0으로 조절한 뒤 수지인 XAD-7(ROHM HASS사 제품) 400 ℓ 칼럼에 분당 2 ℓ의 유속으로 흘려보내 총 이소플라본 배당체가 수지에 흡착되도록 하였다. 한편 총 이소플라본 배당체가 흡착된 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한 후, 50℃로 온도가 맞추어진 열교환 순환 탱크에서 락토자임(Lactozyme, Novo사)효소를 두부순물의 약 0.01 %의 양으로 물에 넣고, 수산화나트륨을 가하여 pH를 7.0으로 조절하여 제조된 효소액 180 L를 60 시간 동안 컬럼을 통해 순환시켜 배당체 이소플라본을 어글리콘 이소플라본으로 변환시킨 후 효소액을 회수하였다. 에탄올(95 %)을 흘려보내 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하고 HPLC(영린기기)에서 260 nm 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 약 80 % 이상의 배당체 이소플라본이 어글리콘으로 변환됨을 확인하였다. 회수의 종료 확인도 위와 같은 방법으로 하여 흡광치가 0.01 이하로 내려갈 때를 기준으로 하였다.

회수된 에탄올 용출액을 60℃에서 감압 농축하여 농축물을 얻었으며, 이 농축물을 65℃에서 감압 건조하여 건조물 300 g을 얻었다. 이 중 총 이소플라본은 110 g이었다.

본 발명의 방법은 기존의 어글리콘화 방법보다 간단하고 간편한 공정을 통해 고함량의 어글리콘 이소플라본을 생산할 수 있게 하며 효소의 연속적인 활용이 가능하므로 매우 경제적이다.

Claims

이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산하는데 있어서, (a) 이소플라본 배당체를 포함하는 용액을 아크릴계열의 수지 또는 폴리아로마틱(polyaromatic)계열의 수지를 갖는 흡착수지 컬럼에 통과시켜 이소플라본 배당체를 수지에 흡착시키고, (b) 상기 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 연속적으로 순환시켜 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 변환시킨 후 효소액을 회수하고, (c) 상기 컬럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 것을 특징으로 하는 어글리콘 이소플라본의 생산 방법.
삭제
제1항에 있어서,

상기 (b) 단계에서 효소액을 25 내지 80℃에서 15 ㎖/분 내지 200 ㎖/분의 유속으로 1 내지 72 시간 동안 순환시키는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,

상기 (b) 단계에서 효소액의 pH를 4.0 내지 8.0으로 조절하는 방법.
제1항에 있어서,

(a) 단계의 이소플라본 배당체를 포함하는 용액이 이소플라본을 함유하는 식물체를 물 또는 알콜로 추출하여 얻어진 추출액 또는 두부순물인 방법.