KR101561505B1 - 대두 배아로부터 이소플라본 아글리콘의 생산방법 - Google Patents

대두 배아로부터 이소플라본 아글리콘의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대두 배아 추출 농축액에 조효소 추출액 넣어 반응시키고, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종시켜 발효시키는 단계를 포함하는 높은 수율의 고순도 이소플라본 아글리콘을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생산방법은 대두 배아 내 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 전환하기 위한 최적화 조건을 구현함으로써, 현장 공정에서의 스케일 업하여 제조하는 경우에도 추출 용매의 사용량과 제조비용을 줄이고 발효 공정의 안정화를 실현시킬 수 있다.

Description

대두 배아로부터 이소플라본 아글리콘의 생산방법{Method for producing isoflavones aglycone from soybean embryo}
본 발명은 대두 배아로부터 이소플라본 아글리콘을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 대두 배아 농축추출물에 조효소 추출액을 반응시키고 발효 균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 넣어 발효시켜 대두 배아 내에 배당체(glucosides)로 존재하는 이소플라본(isoflavones) 성분을 생체 내 흡수능이 우수한 아글리콘(aglycone)의 형태로 전환함으로써, 다량의 이소플라본 아글리콘을 생산하면서 공정 향상 및 비용 절감의 장점도 갖는 고기능성 이스폴라본 아글리콘의 생산방법에 관한 것이다.
대두는 우수한 영양원으로서 한국, 일본을 중심으로 중국, 동남아시아 지역에서 전통적인 식품으로 섭취되어 왔으며, 간장, 된장, 청국장, 납두, 템뻬(Tempeh) 등의 발효식품 외에도 두부, 두유 등 그 이용의 형태가 매우 다양하다. 최근 대두에 함유된 단백질, 올리고당, 레시틴(Lecithin), 사포닌(Saponin) 및 이소플라본(Isoflavones) 등 대두에 함유된 각종 성분의 인체에 대한 다양한 생리활성이 밝혀짐에 따라 그 기능성이 전세계적으로 주목받고 있다. 특히 콩과식물에 특이적으로 존재하는 이소플라본에 대한 관심 재고와 기능성 소재로써의 개발은 더욱 빠르게 진행되고 있다.
문헌에 따르면 이소플라본은 여성 호르몬인 에스트로겐(Estrogen)과 유사한 작용기작을 가지고 있어 피토에스트로겐(Phytoestrogen)이라 불리며, 골다공증의 예방작용, 유방암과 전립선암 등에 대한 항암작용, 콜레스테롤 저하작용 및 항산화 작용 등 다양한 생리활성 기능이 있는 것으로 보고되고 있다[Toda, T. et al., Function of soybean isoflavone and its application, Food and Development, 31(6), 44-47, 1996; Murphy, P. A. Phytoestrogen contenr it of processed soybean products, Food Technol., 36, 60-64, 1982; Adlercreutz, C. H. et al., Soybean phytoestrogen intake and cancer risk, J. Nutr., 125(3S), 757-770, 1995].
대두 이소플라본의 상기와 같은 항암작용은 호르몬과 유사한 활성뿐만 아니라, 티로신 키나아제(Tyrosine kinase)의 저해작용, 토포이소머라아제(Topoisomerase)의 저해작용, 항산화 작용 등이 관여하는 것으로 보고되고 있으며[Ishimi, Y., Functionality of soy isoflavones, Foods and Development, 34(7), 3-7, 1999], 특히 대두의 대표적인 이소플라본인 제니스테인(Genistein)은 에스트로겐 대사에 관여하는 P450을 유도하여 에스트로겐의 합성을 억제하거나 성호르몬과 결합하는 글로블린(Globulin)의 합성을 촉진하여 유리 에스트로겐을 감소시켜 작용을 억제하는 기능이 있는 것으로 보고되고 있다.
대두에 함유된 이소플라본은 아글리콘과, 배당체가 있는데, 아글리콘은 제니스테인(Genistein), 다이드제인(Daidzein), 글리시테인(Glycitein)의 3가지가 있고, 배당체는 상기 아글리콘 각각에 대하여 3종씩 있어, 모두 12종의 이소플라본 화합물이 존재하는 것으로 알려져 있다.
선행문헌에 따르면 대두 종자에는 약 0.3%의 이소플라본 성분이 대부분 일반 배당체(Glucosides) 또는 말로닐배당체 (Malonylglucosides)의 형태로 존재하며, 아세틸배당체(Acetylglucosides) 및 아글리콘은 매우 적게 함유되어 있으며, 말로닐배당체는 대두 가공시 열에 의해 쉽게 말로닐잔기가 분해되어 일반 배당체로 변환되는 것으로 보고되고 있다[Wang, H. et al., Isoflavone content in commercial soybean foods, J. Agric. Food Chem., 42, 1666-1673,1994; Izumi, T. et al., An efficient preparation of acetyl isoflavone gucosides, Chem. Pharm. Bull., 45, 1593-1595, 1997].
한편 이소플라본은 일반적으로 배당체 보다는 아글리콘(aglycone)의 형태가 흡수능이 우수하여 생리적 활성이 높은 것으로 보고되고 있다. 대두의 부위별 이소플라본 함량은 선행문헌에 따르면 대두 배아 부분이 약 1.0 ∼ 1.5%로 가장 높은 것으로 알려져 있으며, 특히 글리시테인은 배아 부위에만 함유되어 있기 때문에 대두 종자 전체의 이소플라본 화합물의 조성과는 크게 다른 것으로 보고되고 있다[Takamatsu, K. Function of soy isoflavone as high degree application of soybean and its application to foods, New Food Industry, 40(8), 9-14, 1998].
상기의 연구와 특허들은 대두/대두 배아로부터 이소플라본 화합물을 제조하는 방법, 이소플라본 배당체에 산/알칼리를 처리하여 아글리콘을 제조하는 방법, 알파-1,4-글루코시드 결합(α-1,4-glucosidic bond)을 절단할 수 있는 효소들을 처리하여 일반 배당체로부터 아글리콘을 생산하는 방법들에 관한 것이다.
한편 본 발명의 선행 발명인 한국 등록특허 제2002-32078호는 대두 배아로부터 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 발효를 통한 고순도 이소플라본 아글리콘의 생산방법으로서, 대두 배아로부터 미생물을 이용한 생물학적인 발효법을 통해 생체 내 흡수능이 우수한 형태인 이소플라본 아글리콘으로 전환시키는 방법과 95% 이상의 고순도 천연 이소플라본 화합물을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 하지만 이를 이용하여 대두 이소플라본 아글리콘을 대량 생산하는 경우, 추출 용액의 사용량이 많아 생산 비용이 많이 들고 발효 공정의 안정화를 실현하는데 제한성이 있다.
이에 대두 배아 내에 존재하는 이소플라본 아글리콘을 제조하는 방법에 있어서 대량 생산 공정에 맞게 경제성을 고려한 실용화 연구가 필요한 실정이다.
1 : 한국 공개특허 제2002-32078호
이에 본 발명자는 기존의 선행 발명인 한국 등록특허 제114166호에서 한국의 전통 재래식품인 청국장으로부터 분리ㆍ동정한 바실러스 리케니포미스 CK 11-4(KCCM 10042)를 이용하여 대두 배아를 발효시키면 상기 균주가 이소플라본 배당체의 당부분과 아글리콘 부분을 연결하는 알파-1,4-글루코시드 결합을 절단하는 글루코시다아제(β-glucosidase)의 활성이 우수하여 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 용이하게 전환하는 점과, 한국 공개특허 제2002-32078호에서 개시된 대두 배아로부터 발효를 통한 고순도 이소플라본 아글리콘의 생산방법을 이용하여, 현장 공정에서 적용하기에 보다 적합하고 경제성 있는 대두 속 이소플라본 아글리콘을 생산하는 방법을 연구하던 중, 대두 배아 추출농축액에 조효소 추출액을 혼합하여 반응시키고 여기에 바실러스 리케니포미스 CK 11-4(KCCM 10042) 균주를 이용하여 발효시키는 경우 대두 배아 속 이소플라본 배당체가 아글리콘으로 높은 효율로 전환된다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 현장 공정에서 보다 경제성이 있게 대두 배아로부터 고순도, 고회수율로 아글리콘을 생산할 수 있는 이소플라본 아글리콘의 생산방법을 제공하는데 있다.
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 대두 배아 추출농축액에 조효소 추출액 넣어 반응시키고, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종시켜 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이소플라본 아글리콘의 생산방법은 대두 배아 내 이소플라본 배당체를 현장 공정에서 경제적이고 효율적으로 이소플라본 아글리콘으로 전환하는 방법으로 생물학적으로 매우 안정된 미생물 발효법을 통해 체내 흡수능이 우수한 이소플라본 아글리콘으로 전환시키는 장점이 있다.
또한 종래 발명을 개선하여 이소플라본 아글리콘을 생산함에 있어서 용매 및 조건을 최적화하여 생산 비용을 절감시키는 효과가 있고, 다공성 흡착 수지를 이용한 분획 공정을 통해 고순도 이소플라본 아글리콘을 제조함으로써 산업적으로 활용범위가 넓다는 장점이 있다.
또한 본 발명은 산업 부산물인 대두 배아로부터 고부가가치인 이소플라본 아글리콘을 생산한다는 점에서 산업 경쟁력이 있다.
도 1은 대두 배아 내 이소플라본 배당체 및 이소플라본 아글리콘의 HPLC 그래프이다(A:이소플라본 배당체, B:이소플라본 아글리콘).
도 2는 실험예 5를 통해 제조된 이소플라본 아글리콘의 HPLC 그래프이다(A:이소플라본 배당체, B:이소플라본 아글리콘).
이하에서 본 발명을 하나의 구현예로서 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 대두 배아로부터 이소플라본 아글리콘의 생산방법은, 대두 배아 추출농축액에 조효소 추출액 넣어 반응시키고, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종시켜 발효시키는 단계를 포함한다.
도 1은 대두 배아 내 이소플라본 배당체 및 이소플라본 아글리콘의 HPLC 그래프로서, 대두 배아에는 이소플라본 배당체가 다량으로 함유되어 있음을 알 수 있으며, 상기 이소플라본 배당체를 아글리콘으로 전환시키기 위한 방법을 이하 상세하게 설명한다.
먼저 본 발명에서 사용하는 대두 배아 추출농축액은 대두 배아 추출액으로부터 제조되는 것으로, 대두 배아로부터 유효성분이 많이 함유되어 있는 추출액을 제조하는 것이 선행되어야 한다.
구체적으로 대두 배아 1 중량부에 대해 60 ~ 80% 농도의 에탄올 용매를 8 ~ 10 중량부를 첨가하여 50 ~ 70℃ 온도 조건에서 2 ~ 24 시간 동안 추출하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 60% 농도의 에탄올 용매를 8 중량부를 넣어 24 시간 동안 추출하는 것이다.
상기 에탄올 용매의 농도가 60% 미만인 경우 대두 배아 수용성 성분의 과다 용출로 여과 공정에 어려움이 있고, 80% 초과인 경우 에탄올 농도 70%에 비해 유효성분 추출 수율에 큰 차이가 없고, 공정비용 상승에 영향을 주므로 80% 초과할 필요가 없으며, 상기 온도가 50℃ 미만인 경우 추출 시간을 더 늘려야 하는 문제가 있고, 70℃ 초과인 경우 에탄올 용매 가열로 인한 안전상 문제가 있으며, 2 시간 미만인 경우 이소플라본 배당체의 추출 효율이 낮은 문제가 있으며, 24 시간 초과인 경우 공정비용이 증가하는 문제가 있기에 상기 범위 내에서 추출하는 것이 좋다.
다음으로 상기 대두 배아 추출물을 감압 농축하여 대두 배아 추출농축액을 제조한다. 대두 배아 추출액을 대두 배아 추출농축액으로 제조하는 것은 이소플라본 배당체의 함량을 높이기 위한 과정이며 60 ~ 80℃ 온도에서 감압 농축기로 농축하여 30 ~ 60 브릭스(brix)의 대두 배아 추출농축액을 제조한다.
상기 감압 농축 온도가 60℃ 미만인 경우 농축시간이 길어지는 문제가 있으며, 80℃ 초과인 경우 열변성의 문제가 있기에 상기 범위 내에서 수행하는 것이 바람직하다. 또한 농축액의 브릭스가 30 ~ 60일 때 에탄올이 완전히 제거되며, 농축액 품질 유지에 좋으므로 상기 범위 내로 농축한다.
본 발명은 상기 방법에 의해 준비된 대두 배아 추출농축액에 조효소 추출액을 혼합하여 반응시키는 단계를 거친다. 이는 이소플라본 배당체를 생체내 흡수능이 우수한 이소플라본 아글리콘으로 전환시키며 미생물의 영양액 역할을 위해 수행되는 과정이다.
이때 본 발명에서의 조효소 추출액이라 함은 피질 또는 전분질을 함유하는 것을 원료로 하여 증자하거나 날것 그대로 살균한 다음 당화효소생성균을 배양시킨 조효소제에 정제수를 투입한 후 20 ~ 40℃ 온도 조건에서 1 ~ 3 시간 동안 150 ~ 200 rpm으로 추출 한 후 원심분리를 통해 얻어진 상등액을 의미하며, 이는 이소플라본 배당체를 아글리콘으로 전환시키는 β-glucosidase 역할을 하고, 본 발명에서는 당화력이 4000 ~ 60000 sp인 조효소 10 중량부에 대해 정제수를 80 ~ 100 중량부로 넣고 20 ~ 40℃ 온도 조건에서 1 ~ 3 시간 추출하여 획득한 조효소 추출액을 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기 조효소 추출액은 대두 배아 추출농축액 1 중량부에 대해 8 ~ 10 중량부로 혼합하는 것이 바람직하다. 조효소 추출액이 8 중량부 미만인 경우 배당체의 아글리콘 전환율이 낮은 문제가 있으며, 10 중량부 초과인 경우 아글리콘 전환율은 좋으나 제조 공정비용 문제가 있기에 상기 범위 내에서 사용하는 것이 바람직하다.
아울러 상기 추출액은 20 ~ 40℃ 온도 조건에서 1 ~ 3 시간 동안 추출하여 얻는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 온도가 20℃ 미만인 경우 효소의 추출 수율이 낮은 문제가 있고, 40℃ 초과인 경우 효소 이외의 물질이 용출되는 문제가 있으며, 반응 시간이 1 시간 미만인 경우 효소 추출이 불충분 하며, 공정비용을 감안하여 3 시간 이내로 추출을 수행하는 것이 좋다.
다음으로 본 발명은 상기 대두 배아 추출농축액과 조효소 추출액과의 반응 후 대두 배아 추출농축액과 조효소 추출액이 포함된 반응액에 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 넣어 발효시킨다. 이는 이소플라본 배당체를 생체내 흡수능이 우수한 이소플라본 아글리콘으로 전화시키는 과정이다.
이때 상기 반응액에 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액은 흡광밀도(optical density) 1.0 기준으로, 대두 배아 추출농축액 1 중량부에 대해 0.05 ~ 0.08 중량부를 접종하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.05 ~ 0.07 중량부이다. 상기 전배양액의 사용량이 0.05 중량부 미만인 경우 배당체의 아글리콘 전환율이 저하되는 문제가 있고, 0.08 중량부 초과인 경우 전환 효율은 좋으나 발효 부산물로 인한 여과 문제가 있기에 상기 범위 내에서 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기 발효를 위해, 반응액에 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종 후 30 ~ 50℃ 온도 조건에서 5 ~ 36 시간 동안 교반하면서 발효시키는 것이 바람직하다. 상기 온도가 30℃ 미만인 경우 균주의 활성이 떨어져 아글리콘 전환 부족의 문제가 있으며, 50℃ 초과인 경우 균주가 열에 의한 영향으로 인해 활성이 낮아질 문제가 있으며, 반응 시간이 5 시간 미만인 경우 균주 증식 부족의 문제가 있으며, 36 시간 초과인 경우 공정 비용의 과잉 문제가 있기에 상기 범위 내에서 수행하는 것이 좋다.
이처럼 상기 단계를 거침으로써 대두 배아 내 이소플라본 배당체는 이소플라본 아글리콘으로 높은 효율로 전환이 되며, 본 발명에서는 고순도의 이소플라본 아글리콘을 얻을 위해 상기 단계를 거친 후에 추가적으로 상기 발효물을 다공성 흡착 수지로 충진된 컬럼을 이용하여 분획물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로 대두 배아 추출농축액에 조효소 추출액 넣어 반응시키고, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종시켜 발효시킨 발효물을 다공성 흡착 수지로 충진된 컬럼을 이용하여 분획물을 제조하는 단계로서, 발효물을 다공성 흡착 수지로 충진된 컬럼에 충진시킨 후 발효물 1 중량부 대비 정제수 10 ~ 20 중량부를 첨가하여 1차 세척한 다음, 발효물 1 중량부 대비 10% 에탄올 수용액 5 ~ 10 중량부를 첨가하여 2차 세척한다. 그런 다음, 발효물 1 중량부 대비 50 ~ 95% 에탄올 수용액 5 ~ 10 중량부를 첨가하여 용출하고, 이 용출물을 60 ~ 80℃의 온도에서 감압농축하여 이소플라본 아글리콘의 순도가 30% 이상인 분획물을 제조한다. 이때, 이소플라본 아글리콘의 회수율은 90% 이상이었다.
이때 상기 에탄올 수용액을 5 중량부 미만으로 첨가하면 유효성분이 충분히 용출되지 않아 바람직하지 않으며, 10 중량부를 초과하여 과량으로 첨가하면 제조비의 상승으로 경제적으로나 산업적으로 바람직하지 않다.
또한 용출 시 용매의 유속조건은 10 ~ 100 ㎖/min이 바람직하며, 유속이 100 ㎖/min를 초과할 경우 흡착된 이소플라본 아글리콘을 용출해 내는 시간이 충분하지 않아 수율이 저하되는 반면, 유속이 10 ㎖/min 미만일 경우 공정시간이 과도하게 길어져 바람직하지 않다. 또한 본 발명에서는 상기 다공성 흡착 수지로 스티렌계 공업용 흡착 수지를 사용할 수 있다.
이렇게 본 발명에 따라 제조된 이소플라본 아글리콘은 생물학적으로 안정하고, 산업적으로 경제성이 우수하며, 건강 보조 식품 및 기능성 식품 등에 광범위하게 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 대두 배아 추출 용매 조건 실험
대두 배아로부터 이소플라본 배당체를 추출하기 위한 실험을 실시하였다. 실험은 생산 공정에서 적용 할 수 있는 범위 내에서 실험을 진행하였다. 대두 배아 100 g을 60%, 75% 에탄올 8배(800 g), 10배(1000 g) 조건, 추출 온도는 60℃, 추출 시간은 2, 4, 24 시간으로 하여 비교하였으며 그 결과는 아래와 같다.
주정함량 용매 배수 추출시간 배당체 아글리콘
60% 8배 2hr 13,130.5 74.0
4hr 13,490.6 66.6
24hr 15,134.6 83.4
10배 2hr 13,375.1 25.5
4hr 13,274.3 30.4
24hr 14,377.7 2,686.9
75% 8배 2hr 13,356.8 2,282.9
4hr 13,597.5 2,193.8
24hr 13,980.4 2,279.0
10배 2hr 13,271.1 23.4
4hr 13,370.8 2,827.1
24hr 14,735.1 2,906.4
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 이소플라본 배당체 추출량은 실험 조건 60%에탄올 용매 8배수(800 g)로 24 시간 조건일 때 이소플라본 배당체가 1.5%로 가장 많이 추출되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 접종균주 ( Bacillus licheniformis CK 11-4) 전배양액의 최적농도 선정 실험
대두 배아를 실험예 1에서 선정한 조건으로 추출하여 감압농축 하여 얻은 농축액 10 g에 멸균수 40 ㎖를 첨가하고 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 농도로 접종균주 전배양액을 첨가하여 37℃의 온도에서 100 rpm으로 교반하면서 24 시간 동안 발효시켰다. 발효 후 균주를 불활성화 시킨 후 발효물을 50% 아세토나이트릴 용액에 희석하여 HPLC를 사용하여 이소플라본 함량을 분석하고 배당체와 아글리콘의 비율을 측정하였다.
접종균주 전배양액
(OD 1.0)의 중량부		 비율(%)
배당체 아글리콘
0 97.8 2.2
0.01 76.6 23.4
0.02 48.4 51.6
0.03 34.5 65.5
0.04 15.8 84.2
0.05 15.3 84.7
0.06 15.2 84.8
0.07 15.1 84.9
상기 표 2에 나타낸 결과를 통해, 접종균주 전배양액(OD 1.0)을 0.05 중량부 이상 사용하여 발효시켰을 때, 이소플라본 배당체로부터 아글리콘으로 전환되는 효율이 가장 높음을 알 수 있었다. 발효공정에서 유래되는 이소플라본의 손실율 등을 고려할 때, 0.05 ∼ 0.07 중량부를 사용하는 것이 바람직하다.
실험예 3 : 조효소제 선정 및 조효소 추출 조건 실험
상기 실험예 2의 대두 배아 추출농축액을 균주를 활용해 발효할 때 이소플라본 배당체가 아글리콘으로 전환되는 것이 부족한 부분이 있어 이를 보완하기 위해 조효소제를 첨가하여 전환율을 높이고자 실험하였다. 조효소제는 천연 첨가물로 등재되어 있는 것으로 당화력이 4,000 ~ 6,000 제품을 사용하였다.
이소플라본 아글리콘으로 전환능이 우수한 조효소제를 선정하기 위해, 대두 배아 5 g에 정제수 50 ㎖를 투입하여 100℃에서 살균 한 후 조효소제를 투입하여, 50℃에서 150 rpm으로 교반하면서 24 시간 반응시킨 후, 60% 에탄올로 추출하여 이소플라본 배당체와 아글리콘 함량 비율을 측정하였다.
조효소 투입량 비율(%)
배당체 아글리콘
조효소제 11) 0.5g 10.2 97.8
1g 9.5 98.1
1.5g 8.0 98.4
조효소제 22) 0.5g 7.9 98.4
1g 7.5 98.5
1.5g 6.5 98.7
조효소제 33) 0.5g 9.3 98.2
1g 6.5 98.7
1.5g 6.5 98.7
조효소제 44) 0.5g 10.9 97.7
1g 9.1 98.2
1.5g 8.5 98.3
각주
1) 조효소제 1: 당화력 5000 이상
2) 조효소제 2: 당화력 6000 이상
3) 조효소제 3: 당화력 4000 이상
4) 조효소제 4: 조효소 2:조효소 3 = 50:50
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 조효소제 종류에 따른 이소플라본 아글리콘 전환율 차이는 크게 나타나지 않았다. 그 중 조효소제 3을 1 g 투입하였을 때 아글리콘 전환율이 가장 높게 나타나 조효소제 3을 선정하였다.
선정된 조효소제 3을 대두 배아 추출농축액과 반응시키기 위해서는 고체형태의 조효소에서 효소를 추출하여 적용해야 하므로, 다음과 같이 실험하였다.
선정된 조효소제 10 g에 정제수를 4 ~ 10배수 투입하고, 30℃에서 150 rpm으로 1 시간 동안 추출한 후, 8,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리를 하여 추출 적성 및 이소플라본 아글리콘 전환율을 확인하였다.
조효소 중량 정제수(ml) 비율(%)
배당체 아글리콘
10g 20 35.4 64.6
40 30.9 69.1
60 24.2 75.8
80 15.4 84.6
100 15.5 84.5
상기 표 4에 나타낸 결과를 통해, 조효소 10 중량부 대비 정제수를 80 ~ 100 중량부로 추출한 조효소 추출물을 사용한 경우 아글리콘 전환율이 높음을 확인하였다.
실험예 4 : 대두 배아 추출농축액과 조효소 추출액 최적 반응 조건 선정 실 험
상기 실험예 1에서 선정된 조건으로 추출한 대두 배아 추출농축액에 실험예 3에서 선정된 조건으로 추출한 조효소 추출액을 사용하여 최적 반응 조건을 실험 하였다.
아래 표 5와 같이 농축액 5 g에 조효소 추출액을 0.5 ~ 13 배수를 투입하였고, 50℃에서 150 rpm으로 5 시간과 24 시간 반응하였다. 반응이 종료된 후 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 이소플라본의 함량을 분석하였다.
농축액 반응시간 조효소 추출액(ml) 배당체(ppm) 아글리콘(ppm)
5g 0 0 27657.4 814.2
5g 5 2.5 22363.6 3900.0
5 19201.4 5812.5
10 14363.0 8515.1
20 11324.8 11129.5
30 8451.6 12226.5
40 7182.5 13497.3
60 4517.5 10199.8
80 3141.6 12705.8
24 2.5 18710.3 5315.0
5 14557.1 7782.5
10 11391.0 10122.9
20 7213.0 13056.5
30 4667.6 13731.3
40 3395.7 14175.5
60 2011.1 14241.8
80 1853.9 13895.8
상기 표 5에 나타낸 결과를 통해서 볼 때, 조효소 추출액이 많이 투입될수록 이소플라본 아글리콘 전환량이 늘어남을 알 수 있으며, 반응 시간은 24 시간 반응할 때 이소플라본 아글리콘 전환량이 많음을 알 수 있었다.
실험예 5 : 대두 배아 추출농축액과 조효소 추출액, 균주 발효 실험
상기 실험예 1 ~ 4에서 선정된 조건을 종합하여 하기 표 5에 나타낸 함량에 비율에 따라, 대두 배아 추출농축액의 이소플라본 배당체를 아글리콘으로 전환시키기 위한 최적 조건을 실험하였다. 그리고 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 이소플라본의 추출량 및 추출효율을 측정하여 그 결과를 하기 표 6 및 도 1, 2에 나타내었다.
농축액 접종균주 전배양액(0D 1.0) 조효소액 정제수 배당체(ppm) 아글리콘(ppm) 아글리콘
전환효율
5g - - - 27,657.4 814.2 -
0.25 - 20 2,533.4 2,960.8 7.7%
- 40 1,631.2 23,484.5 81.9%
20 - 754.3 25,468.3 89.1%
40 - 125.6 26,484.9 92.8%
상기 표 6에 나타낸 결과를 통해, 대두 배아 추출농축액에 균주와 조효소액 40 ml를 반응시킨 경우 가장 이소플라본 아글리콘 전환량이 많음을 확인할 수 있었다. 또한 도 1 및 2에서 A는 이소플라본 배당체, B는 이소플라본 아글리콘을 나타낸 것으로, 도 1은 아무런 처리하지 않은 대두 배아 속 이소플라본의 함량을 나타낸 것으로 대부분 일반 배당체의 형태인 반면, 도 2는 실험예 5의 미생물 발효법을 거친 대두 배아 속 이소플라본을 나타낸 것으로 대부분 아글리콘의 형태로 전환되어 있음을 알 수 있다.
실시예 : 순도 30% 이상의 이소플라본 아글리콘의 제조
실험예 1에서 얻은 대두 배아 추출액을 10 브릭스의 대두 배아 추출농축액으로 제조하고 여기에 조효소 추출액과 상기 균주를 넣어 발효물을 제조하였다. 상기의 발효물 10 g를 스티렌계 공업용 흡착수지로 충진된 칼럼(60 × 450 ㎜)에 충전시킨 후, 정제수 200 ㎖를 사용하여 용출유속 50 ㎖/min로 컬럼을 통과시켜 세척한 후, 다시 10 % 에탄올 수용액 100 ㎖를 사용하여 동일한 방법으로 세척하였다. 여기 다시 95 % 에탄올 수용액 100 ㎖를 동일한 방법으로 컬럼에 통과시켜 이소플라본 아글리콘이 함유된 용출 분획물을 얻은 후, 각각의 용출 분획물을 감압농축하여 건조 고형분을 제조하였다.
그리고 상기 실험예 1에서 명시한 HPLC법을 이용하여 각 고형분내 이소플라본 아글리콘의 순도와 회수율 측정하였고, 결과를 다음 표 7에 나타내었다.
구분
분획물		 건조 고형분 이소플라본 아글리콘
중량(mg) 회수율(%) 순도(%) 회수율(%)
정제수 25647.5 86.6 0 0
10% 에탄올 수용액 2948.8 10.0 0.05 0.15
95% 에탄올 수용액 1012.5 3.4 31.15 90.8
따라서, 본 발명에 따른 이소플라본 아글리콘의 생산방법을 통해 대두 배아 내 이소플라본 배당체가 높은 효율로 이소플라본 아글리콘으로 전환되었음을 확인할 수 있었으며, 이러한 최적화한 조건에서의 반응은 현장 공정에 적용함에 있어 추출 용매의 사용량과 금액을 줄이고 발효 공정의 안정화를 실현시킬 수 있다.

Claims (6)

  1. 당화효소생성균을 배양시킨 것으로 당화력이 4000 ~ 6000 sp인 조효소제를 정제수로 추출하여 조효소 추출액을 얻고,
    상기 조효소 추출액을 대두 배아 추출농축액에 넣어 반응시키고 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종시켜 발효시키는 단계;
    를 포함하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 대두 배아 추출농축액은 대두 배아 추출물을 60 ~ 80℃의 온도 조건에서 감압 농축기를 이용하여 30 ~ 60 브릭스(brix)의 농축물로 수득된 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조효소 추출액은 조효소제 10 중량부에 대해 정제수를 80 ~ 100 중량부로 넣고 20 ~ 40℃ 온도 조건에서 1 ~ 3 시간 추출하여 획득한 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조효소 추출액은 대두 배아 추출농축액 1 중량부에 대해 8 ~ 10 중량부로 넣는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액은 흡광밀도(optical density) 1.0 기준으로, 대두 배아 추출농축액 1 중량부에 대해 0.05 ~ 0.08 중량부로 접종시키는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 발효는 30 ~ 50℃ 온도에서 5 ~ 36 시간 동안 교반하여 발효되는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
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