KR101419217B1

KR101419217B1 - 흑효모를 이용한 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하는 방법

Info

Publication number: KR101419217B1
Application number: KR1020120059941A
Authority: KR
Inventors: 전효곤; 정동민
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2014-07-14
Also published as: KR20130136262A

Abstract

본 발명은 양파에 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 양파에 포함된 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(bioconversion)하는 방법, 양파에 흑효모 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 이소퀘시트린 또는 베타글루칸 함량이 증가된 발효 양파의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 이소퀘시트린 또는 베타글루칸 함량이 증가된 발효 양파 및 흑효모 배양액을 유효성분으로 함유하는, 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

흑효모를 이용한 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하는 방법{Method for bioconversion of quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside in onion to isoquercitrin using Aureobasidium pullulans}

본 발명은 흑효모를 이용한 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하는 방법 및 그에 따른 이소퀘시트린에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 양파에 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 양파에 포함된 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(bioconversion)하는 방법, 양파에 흑효모 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 이소퀘시트린 또는 베타글루칸 함량이 증가된 발효 양파의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 이소퀘시트린 또는 베타글루칸 함량이 증가된 발효 양파 및 흑효모 배양액을 유효성분으로 함유하는, 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하기 위한 조성물에 관한 것이다.

양파의 주요한 플라보노이드(Flavonoid)는 퀘세틴(Quercetin)이다. 양파는 주로 퀘세틴 배당체 형태로 존재하는 반면 아주 소량으로 퀘세틴과 이소퀘시트린(Isoquercitrin)을 함유하고 있다. 퀘세틴의 배당체는 주로 퀘세틴 아글리콘의 4',3,7 위치에 글루코오스가 붙어있는 형태로 존재하며, 주로 퀘세틴 단당체(Quercetin 4'-O-β-D-glucoside)와 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 가지고 있다(도 1). 퀘세틴은 심혈관 질병에 관한 효과, 항암효과, 항면역 반응효과, 항산화제 효과 등 같은 많은 생물학적인 활성을 지니고 있다고 한다. 이러한 유익한 효과들로 인하여 퀘세틴의 연구와 관심은 점점 높아지고 있는 추세이다. 하지만, 퀘세틴의 불용해성으로 인해 인체에 흡수되기가 어렵다고 알려진다.

이소퀘시트린(Isoquercitrin; Quercetin-3-O-β-D-glucoside)은 메밀, 오이, 목화, 토끼풀, 오디 등에 함유된 물질이며, 이소퀘세틴(Isoquecetin)으로도 불리어진다. 그 물질은 항산화성(antioxidative), 색 바램(anti-fading)과 맛 변화(flavor change-inhibiting)에 대한 방지, UV 차단 (UV-blocking), 메탈 킬레이트화(metal chelating actions) 등의 속성을 가지고 있으며, 이뇨제(diuretic), 항염증(anti-inflammatory), 모세혈관 강화(capillary strengthening), 항바이러스(anti-virus) 효과와 같은 약리적인 활성을 지닌 것으로 알려져 있다. 그러므로 이소퀘시트린은 색소 음료의 색바램 방지제(anti-fading agent), 식품의 맛 변화 저해제(flavor change-inhibitor) 뿐만 아니라, 화장품이나 건강식품의 재료로 사용된다. 또한, 퀘세틴의 불용해성과는 달리 용해성이 높으며, 퀘세틴이나 루틴보다 체내 흡수율(bioavailablity)이 좋다고 알려져 있다.

지금까지 알려진 이소퀘시트린의 제조 방법은 화학적인 합성 기법, 루틴(rutin)으로부터 효소 처리에 의한 제조방법, 당화합성효소 (glycosyltransferase)를 이용한 합성기법 등이 알려져 있으나, 이러한 상기 방법들은 고가의 장비, 고가의 화학물질이나 효소의 이용과 장시간의 제조 시간이 필요하며, 대량의 시료를 빠르게 만들기가 어렵다. 따라서 새로운 이소퀘시트린의 제조 방법 구축이 필요한 실정이다.

한편, 베타글루칸은 포도당이 베타 1,3 결합을 중심으로 중합된 천연고분자물질로서, 보리, 밀 등 곡류의 껍질에 함유되어 있을 뿐만 아니라, 버섯류, 효모의 세포벽, 그리고 아그로박테리움 속 미생물이 생산한다고 알려져 있다. 특히 베타글루칸은 동물의 면역기능을 강화시키는 물질로 보고되어 있고, 내성이 없는 천연 면역조절제로서 주목을 받으면서 많은 연구결과를 통해 베타글루칸의 탁월한 효능이 밝혀지고 있으며, 화장품, 면역활성 촉진제, 항암제, 피부재생을 위한 치료제, 식이섬유나 식품첨가제, 사료첨가제 등 다양한 분야에서 응용되고 있다.

이에, 본 발명자들은 저렴성, 단시간의 대량 시료 생산 등의 차별성을 고려한 이소퀘시트린의 제조방법을 구축하기 위해 연구한 결과, 흑효모(Aureobasidium pullulans)를 이용하여 양파에 존재하는 퀘세틴 이당체 (Quercetin-3,4'-O-β-D-glucoside)으로부터 이소퀘시트린(Quercetin-3-O-β-D-glucoside)으로 생물전환하여 이소퀘시트린의 생산을 높임으로써 본 발명을 완성하였다. 아울러, 흑효모 배양과정에서 생성되는 유용성분인 베타글루칸이 포함된 발효 양파를 제조하고자 하였다.

한국공개특허 제2010-0001907호에서는 '아스퍼질러스 나이거 유래의 람노시데이즈를 이용한 루틴에서 쿼세틴-3-글루코사이드를 제조하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1017594호에서는 '퀘르세틴 함량이 증가된 발효 양파 추출물의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 흑효모를 이용한 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하는 방법 및 그에 따른 이소퀘시트린에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 항암 및 항산화 효과가 있는 퀘세틴의 불용해성과는 달리 용해성이 높으며, 퀘세틴이나 루틴보다 체내 흡수율(bioavailablity)이 좋다고 알려진 이소퀘시트린의 제조 방법을 구축하였다.

기존의 이소퀘시트린의 제조는 화학적인 합성 기법, 루틴(rutin)으로부터 효소 처리에 의한 제조 방법, 당화합성효소 (glycosyltransferase)를 이용한 합성기법 등이 알려져 있으나, 이러한 상기 방법들은 고가의 장비, 고가의 화학물질이나 효소의 이용, 장시간의 제조 시간을 필요로 하며, 대량의 시료를 빠르게 만들기가 어려운 단점이 있어, 최근 경제적인 제조방법이 필요한 실정이었다.

본 발명에서는 흑효모(Aureobasidium pullulans)를 이용하여 양파에 함유된 퀘세틴(Quercetin) 또는 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(Bioconversion)하는 이소퀘시트린의 생물학적 제조방법을 구축함으로써, 종래의 이용되고 있는 화학적인 합성 처리, 또는 생물학적인 합성보다도 간편하고, 저가의 비용과 빠른 시간으로 많은 시료를 대량으로 제조할 수 있는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 양파에 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 양파에 포함된 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(bioconversion)하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 양파에 흑효모 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 이소퀘시트린 또는 베타글루칸 함량이 증가된 발효 양파의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 이소퀘시트린 또는 베타글루칸 함량이 증가된 발효 양파를 제공한다.

또한, 본 발명은 흑효모 배양액을 유효성분으로 함유하는, 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 기존의 제조 방법에 비해 간편하고 저가의 비용과 빠른 시간으로 이소퀘시트린을 대량 생산할 수 있는 방법 및 베타글루칸 함량이 증가된 발효 양파의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 특히 이소퀘시트린 또는 베타글루칸을 이용하는 식품, 향미제, 음료, 생약제제, 건강보조식품에서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 퀘세틴 이당체(Q3,4'G; 화학식 I), 퀘세틴 단당체(Q4'G; 화학식 II), 이소퀘시트린(Q3G; 화학식 III) 및 퀘세틴(화학식 IV)의 구조를 나타낸다.
도 2는 흑효모에 의한 퀘세틴 이당체(Q3,4'G)로부터 이소퀘시트린(Q3G)으로의 전환을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양파에 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 양파에 포함된 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(bioconversion)하는 방법을 제공한다.

본 발명의 생물전환(bioconversion)은 생물의 생리적 기능을 이용해 첨가된 물질을 화학적으로 변형된 형태로 전환시키는 과정을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 흑효모 배양액을 이용하여 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 전환시킨 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 발효는 양파 분쇄물과 흑효모 배양액을 27~33℃에서 2~5일 동안 배양할 수 있고, 바람직하게는 30℃에서 2일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 양파는 바람직하게는 양파 분쇄물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 양파 분쇄물은 양파를 갈아 제조된 것이며, 상기 흑효모 배양액은 고체 배지에서 자란 흑효모 콜로니 3~4개를 100ml 액체배지에 접종하여 30℃에서 4일 동안 현탁배양한 것이다. 본 발명의 발효는 양파 분쇄물 100g에 상기 흑효모 배양액 100ml을 첨가하여 발효시키는 방법으로 수행되었고, 양파 분쇄물에 흑효모 배양액을 첨가하는 비율은 이소퀘시트린의 제조 효율에 큰 영향을 미치지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다.

또한, 본 발명은 양파에 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 이소퀘시트린(Isoquercitrin) 또는 베타글루칸(Beta-glucan) 함량이 증가된 발효 양파의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 발효 양파의 이소퀘시트린(Isoquercitrin) 또는 베타글루칸(Beta-glucan) 함량은 발효 전 양파에서보다 증가된 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 이소퀘시트린(Isoquercitrin) 또는 베타글루칸(Beta-glucan) 함량이 증가된 발효 양파를 제공한다. 또한, 상기 발효 양파를 이용하여 다양한 가공식품을 제조할 수 있다는 것을 당업자는 용이하게 인식할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 흑효모 배양액을 유효성분으로 함유하는, 양파에 포함된 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(bioconversion)하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 흑효모 배양액을 양파에 첨가하여 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환시킴으로써 이소퀘시트린을 제조할 수 있는 것이다. 흑효모 배양액을 제조하는 방법은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 흑효모의 생물전환법을 이용한 양파로부터 이소퀘시트린 생산

양파로부터 이소퀘시트린을 생산하기 위해 사용된 흑효모(Aureobasidium pullulans KCTC 6081)는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에서 구입하여 사용하였으며, 흑효모는 Czapek broth(30g 사카로스/L, 3g 소듐 니트레이트/L, 3g 디포타슘 포스페이트/L, 0.5g 마그네슘 설페이트/L, 0.5g 칼륨/L, 0.01g 황산제일철/L) 배지 100mL에 접종하여 배양시켰다. 상기 배양조건은 30℃, 150rpm에서 4일 동안 배양하였다. 그런 다음 상기 100mL의 흑효모 배양액은 양파 배지의 접종원으로 사용되었다.

양파는 껍질을 제거하고 물로 세척하였다. 세척된 양파는 믹서기를 이용하여 즙이 될 때까지 잘 분쇄하였다. 분쇄된 양파는 100g의 무게로 삼각플라스크에 넣었다. 이 100g의 분쇄된 양파는 흑효모 배양액의 양파 배지로 사용되었다.

상기 방법에서 배양된 흑효모 배양액(100mL)은 준비된 양파 배지(100g wet weight)에 접종을 한 후, 30℃, 150rpm에서 배양하였다. 그런 다음 배양시간 0, 12, 24, 36, 48시간에 그 배양물로부터 10ml씩을 샘플링하여 100% 메탄올(10mL)을 첨가함으로써 생장을 정지시켰다. 그런 다음 상기 혼합물(배양물/메탄올)은 퀘세틴 화합물의 추출을 위해 30℃, 150rpm 조건으로 1일 동안 두었다. 그 혼합물은 원심분리 과정(4,000 x g, 5분)을 거친 다음, 상등액을 회수하여 필터(0.2㎛)를 한 후 HPLC로 분석하였다. 본 발명에 사용된 HPLC는 Agilent사의 1200 시리즈로서, 분석조건 중 칼럼은 YMC ODS-AM 칼럼(5 um, 4.6 mm x 250 mm), 유속은 1.0 ml/min, 검출기는 DAD를 이용하여 210, 254, 280, 370nm 파장에서 측정하였다. A 이동상 용매는 증류수(0.1% 개미산), B 이동상 용매는 메탄올을 사용하고, 용매 기울기는 일정한 혼합비율(A : B = 95 : 5, 50 : 50, 및 20 : 80)로 용출시켰다. 시료 주입량은 10㎕로 하였다.

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 배양 2일 후 이소퀘시트린 함량이 최대로 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 흑효모의 생물전환법을 이용하여 양파에서 이소퀘시트린 함량이 증가됨을 알 수 있었다.

흑효모 발효 동안의 양파에 있는 퀘세틴 화합물들의 함량 조사

발효 시간	농도 (ug/g 양파)
발효 시간	Q3,4'G	Q4'G	Q3G	Q
0 시간	1524	2394	0	96
12 시간	1357	1987	200	168
24 시간	1117	1029	415	295
36 시간	718	295	662	503
48 시간	479	112	702	670

Q3,4'G: 퀘세틴 이당체(quercetin-3,4′-O-β-D-glucosides), Q4'G: 퀘세틴 단당체(quercetin-4′-O-β-D-glucosides), Q3G: 이소퀘시트틴(quercetin-3′-O-β-D-glucosides), Q: 퀘세틴(quercetin)

실시예 2. 흑효모를 이용한 퀘세틴 이당체로부터 이소퀘시트린 생산

본 발명자들은 상기 반응을 검증하기 위해 퀘세틴 이당체와 흑효모 배양액을 반응시키는 생물전환 방법을 구축하였다. 구체적으로, 퀘세틴 이당체(Quercetin-3,4'-O-β-D-glucoside; Extrasynthese사, Genay, France)을 100mM 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에서 녹인 후, 최종 농도가 200㎍/mL가 되도록 하였다. 이 용액은 생물전환 방법의 기질액으로 사용되었다. 흑효모(Aureobasidium pullulans)의 콜로니(colony)를 Czapek broth 배지 100 ml에 접종을 하여 배양시켰다. 상기 배양조건은 30℃, 150rpm에서 4일 동안 배양하였다. 그런 다음 상기 흑효모 배양액은 퀘세틴 이당체 기질액의 접종원으로 사용되었다.

상기 방법에서 배양된 흑효모 배양액(1mL)과 퀘세틴 이당체 기질액(1mL)을 섞은 후 30℃, 150rpm 조건으로 17시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 상기 반응액(2mL)은 퀘세틴 화합물의 추출을 위해 100% 메탄올(2mL)을 첨가하고 30℃, 150rpm 조건으로 1일 동안 두었다. 그 반응물은 원심분리 과정(4,000 x g, 5분)을 거친 다음, 필터(0.2㎛)를 한 후 HPLC로 분석하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 반응시간 17시간 후 퀘세틴 이당체가 이소퀘시트틴으로 전환되는 것을 확인하였다. 따라서, 흑효모가 양파에 있는 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 전환한다는 것을 검증할 수 있었다.

실시예 3. 흑효모에 의해 제조된 발효 양파로부터 베타글루칸 생산

본 발명자들은 상기 방법에 의해 제조된 발효 양파에 베타글루칸이 포함된 다는 사실을 검증하기 위해서, 흑효모는 Czapek broth 배지 100mL에 접종을 하였고, 배양조건은 30℃, 150rpm에서 배양하였다. 흑효모 배양액로부터 베타글루칸의 함량을 확인하기 위해서, 4일 동안 배양한 후 원심분리하여 배양 상등액만을 여과하여 회수하였다. 베타글루칸이 포함된 물질을 추출하기 위하여, 그 배양상등액 (100 mL)에 95%(v/v) 에탄올 300mL을 첨가하여 농축하였고, 그 혼합물(배양상등액/에탄올)은 GF/C 필터로 여과하여 105℃에서 항량이 될 때까지 건조하였다. 그 건조된 물질의 무게는 45.5mg이었다. 이 물질 속에 있는 베타글루칸의 함량을 측정하기 위해서, Megazyme 사의 Yeast Beta-glucan kit (Megazyme 사, lreland)를 사용하였다. 그 결과 건조된 물질 속의 베타글루칸의 함량은 16.8mg이었다(표 2). 그리고, 상기의 방법으로 4일 동안 배양된 베타글루칸이 생성된 흑효모 배양액(100 mL)을 양파배지(100g wet weight)에 접종하고 30℃, 150rpm에서 2일 동안 배양하여 발효 양파를 제조하였다. 발효 양파로부터 베타글루칸이 포함된 물질을 추출하기 위해서, 그 배양액을 원심분리하여 배양 상등액만을 여과하여 회수하였다. 그 배양 상등액에 95% (v/v) 에탄올을 1:3(배양 상등액:에탄올) 비율로 첨가하여 농축하였고, 그 혼합물(배양 상등액/에탄올)은 GF/C 필터로 여과하여 105에서 항량이 될 때까지 건조하였다. 그 건조된 물질의 무게는 149.6 mg이었다. 이 물질 속에 있는 베타글루칸의 함량을 측정하기 위해서, Megazyme 사의 Yeast Beta-glucan kit (Megazyme 사, lreland)를 사용하였다. 그 결과, 건조된 물질 속의 베타글루칸의 함량은 19.4 mg이었다(표 2). 그러므로, 흑효모에 의해 제조된 발효 양파에는 베타글루칸이 증가되는 것을 확인하였다.

흑효모 배양액과 발효 양파로부터 추출 건조된 물질 속에 있는 베타글루칸의 함량 조사

	추출건조무게 (mg)	추출건조무게 속에 있는 베타글루칸(mg)
흑효모 배양액	45.5	16.8
발효 양파	149.6	19.4

Claims

양파에 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 양파에 포함된 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(bioconversion)하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 발효는 양파 분쇄물과 흑효모 배양액을 27~33℃에서 2~5일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
양파에 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 이소퀘시트린(Isoquercitrin) 또는 베타글루칸(Beta-glucan) 함량이 증가된 발효 양파의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 발효는 양파 분쇄물과 흑효모 배양액을 27~33℃에서 2~5일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 발효 양파의 제조방법.
제3항 또는 제4항의 제조방법에 의해 제조된 이소퀘시트린(Isoquercitrin) 또는 베타글루칸(Beta-glucan) 함량이 증가된 발효 양파.
흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 유효성분으로 함유하는, 양파에 포함된 퀘세틴 이당체(Quercetin 3,4'-O-β-D-glucoside)를 이소퀘시트린(Isoquercitrin)으로 생물전환(bioconversion)하기 위한 조성물.