KR101898397B1

KR101898397B1 - 컬럼 추출 기술을 이용한 고함량의 대두 이소플라본 추출물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101898397B1
Application number: KR1020170166900A
Authority: KR
Inventors: 주영운; 이동선
Original assignee: 다당앤(주)
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2018-09-12

Abstract

본 발명은 물을 추출용매로 사용하거나, 유기용매를 최소화하는 방식으로 대두로부터 고함량의 이소플라본 추출물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명에 따르면 추출대상 원료를 추출용 컬럼에 넣고 추출용매를 일정한 유속으로 용출시키면서 온도, 추출용매의 조성에 따라 원료에서 추출되는 성분의 패턴이 달라지는 현상을 활용하여 추출과 동시에 고함량으로 부분정제를 할 수 있는 특징이 있으므로, 고함량의 대두 이소플라본 추출물을 효율적으로 제조할 수는 뛰어난 효과가 있다.

Description

컬럼 추출 기술을 이용한 고함량의 대두 이소플라본 추출물 및 그 제조방법{Soybean isoflavone extracts using a Column Extraction Technology and preparation method of the same}

본 발명은 컬럼 추출기를 이용하여 대두로 부터 고함량의 이소플라본 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1차로 단백질, 당성분을 포함한 수용성 성분을 물추출로 제거한 후 연속적으로 에탄올을 사용하여 순차추출함으로써 대두 이소플라본을 농축후 분말화하여 고함량의 대두 이소플라본 추출물을 별도의 정제공정없이 단번에 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

대두(Glycine max)는 단백질, 불포화지방, 탄수화물 뿐만 아니라 비타민, 미네랄 등 다양한 생리활성 성분들을 함유하고 있어 대두의 섭취가 유방암, 전립선암, 대장암, 골다공증 폐경기 증후군 및 관산심장질환등의 질병의 발병 위험률을 감소시킨다고 알려져 있다. 최근 기능성 화장품, 기능성 식품의 관심도가 증가하면서 천연식물로부터 새로운 건강 기능성을 가지는 소재를 발굴하려는 시도가 증가하고 있으며 대두에 있는 이소폴라본이 주목받고 있다.

이소폴라본은 자연계에 존재하는 천연 식물성 호르몬중에 하나로 콩과 식물, 칡, 클로버 및 기타 식물에 많이 존재한다. 이 중 대두에 있는 이소플라본은 에스트로겐 활성(estrogenic), 항산화 활성(antioxidative), 항골다공(antiosteoporetic), 항암활성(carcinogenic)등 다양한 생리활성을 가지고 있다고 알려져 있다. 대두에 있는 이소플라본은 주로 당이 결합된 배당체 형태인 6'-malonylglucoside와 6'-acetylglucoside로 존재하고 비배당체 형태는 미량 존대한다. 이들 이소플라본은 유방암, 전립선암, 피부암 및 결장암 등의 예방 및 치료에 효과가 있다고 보고 되고, 골다공증을 포함하는 폐경기완 관련된 다양한 증상도 감소시키거나 예방할 수 있다.

일반적으로 이소플라본의 제조는 이소플라본이 함유되어 있는 식물들을 수성 유기용매등을 이용하여 용이하게 추출할 수 있다. 수성 유기용매로는 에탄올, 메탄올, 또는 저급알코올 및 아세톤 등을 예로 들 수 있다(미국 특 허 제5679806호, 미국특허 제6004558호). 또한, 열수, 가성소다를 이용한 알칼리 수용액, 또는 금속산화물 수용 액 등을 이용한 이소플라본의 추출방법 등이 제시 되어 있다(미국 특허 제4428876호, 미국 특허 제6458406호, 대한민국 특2001-0060419호). 그러나 상기 방법 중 유기용매 추출법은 추출율이 높아 식물체의 대부분의 이소플 라본을 효과적으로 회수할 수 있지만 추출에 이용되는 유기용매의 종류에 따라 추출된 이소플라본의 안전성에 영향을 줄 수 있으며 이 물질의 추출로 그 순도가 현저히 떨어지는 단점이 있다.

이렇게 추출된 이소플라본의 순도를 높이기 위해서는 여러 단계의 여과 정제 과정을 거쳐야만 하고 추출용매의 가격이 비싸 용매의 회수를 위한 별도의 공정이 필요로 하는 등 제조 비용이 다소 높 아지는 문제가 있다. 또한 이소플라본이 식품, 화장품 등으로 활용범위가 확대되고 있는 실정에서 유기용매에 의한 추출방법은 바람직하지 못한 방법으로 평가되고 있다. 그리고, 열수 및 다양한 수용액을 이용한 추출방법 은 그 수율이 상당히 낮은 편이며 고농도의 이소플라본 분리를 위해 적당한 수지가 충진된 컬럼을 사용하는 등 의 분리공정을 거쳐야 하고 투입된 보조 물질의 제거를 위해 별도의 여과 정제 공정이 필요하다는 단점이 있다. 따라서 유기용매를 사용을 최소화하고 간단한 공정으로 이소플라본을 추출하는 방법의 개발은 이소플라본 뿐만이 아 니라 천연 식물성 호르몬 유사체들의 산업적 활용도를 증대시킬 것으로 기대된다.

이소플라본의 제조에 관해서는 이미 여러 가지 방법이 공지되어 있으며, 특히 콩으로부터 이소플라본의 제조방법은 많은 특허와 문헌에 보고되어 있다. 콩으로부터 이소플라본을 추출하는 방법으로는 유기산 및 유기 용매를 이용하는 방법, 흡착 수지를 이용하는 방법 및 베타-글루코시다제 효소를 이용하는 방법이 알려져 있다.

유기산 및 유기 용매를 이용하는 방법은, 빙초산 또는 젖산에서 선택된 유기산과 아세톤, 에틸 아세테이트에서 선택된 유기 용매를 이용하여 콩으로부터 추출물을 층 분리시키고, 분리된 유기 용매에 함유된 이소플라본 비배당체를 여과 정제시키는 방법이다.

흡착 수지를 이용하는 방법은, 대두 배아를 실온에서 알칼리 수용액으로 추출하여 섬유질을 제거하고 섬유질이 제거된 추출액에서 단백질을 제거한 후, 흡착 수지에 통과시켜 이소플라본과 사포닌을 흡착시키고, 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성 용매를 흘려보내 이소플라본과 사포닌을 탈착 원적외선 로에 감압 건조하여 이소플라본과 사포닌 혼합물을 얻는다. 이를 아세톤을 이용한 추출법에 의하여 사포닌 및 이소플라본을 각각 분리한 후, 원적외선 로에서 감압 건조하여 이소플라본을 얻는 방법이다.

베타-글루코시다제를 이용하는 방법은, 발효 균주인 바실러스리케니포미스 (Bacillus Licheniformis) CK-14를 사용하여 대두 배아를 발효시키고, 이로부터 생성되는 베타-글루코시다제를 이용하여 대두 배아 내에 주로 배당체 형태로 존재하는 이소플라본 성분을 생체내 흡수능이 우수한 비배당체 형태로 전환하는 방법이다.

한편, 지금까지 밝혀진 이소플라본의 소재는 완숙한 콩류 (수확기의 완숙한 열매), 갈근, 그리고 황기 등인 것으로 보고되고 있다. 또 대한민국특허출원 제 1984-2655호에는 콩과 식물에서 사포닌류 및 플라본류의 제조방법 및 그의 용도에 대하여, 그리고 대한민국 특허출원 제 2001-60419호에는 이소플라본 중의 제니스테인 유도체를 보다 많이 얻기 위해 콩 배아와 두부 순물을 혼합하여 이소플라본을 분리하기 위하여, 콩배아 및 콩배아와 두부순물의 혼합액으로부터 열수추출에 의한 이소플라본의 제조방법이 개시되어 있다. 그리고 대한민국특허출원 제 2001-16220호에는 대두 배아로부터 생리활성 물질인 이소플라본의 분리정제방법이 기재되어 있고, 특허출원 제 2002-32078호에는 대두 배아의 발효를 통한 고순도 이소플라본아글리콘의 생산방법이 기재되어 있으며, 대한민국 특허출원 제 2001-89863호에는 콩추출액을 산성화한 다음, 슬러지와 분리하여 흡착성 수지가 충진된 칼럼에 통과시켜, 추출액 중의 이소플라본을 상기 수지에 흡착시키는 이소플라본의 제조방법이, 등록특허 제10-0823611호에는 초음파를 이용하여 콩으로부터 이소플라본을 물 또는 알코올 용매하에서 추출한 후 그 추출된 여과액을 분취하여 불순물을 제거하는 전처리 단계; 및 상기 분취한 여과액을 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 초음파를 이용한 이소플라본을 추출하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기 특허문헌 어디에도 컬럼 추출기를 이용하여 물과 에탄올을 순차적용하여 연속적으로 대두 이소플라본을 추출/분리/정제를 수행하는 컬럼추출기술이 개시되거나 암시된 바 없다.

본 발명은 대두 이소플라본을 효과적으로 추출함과 동시에 고함량의 대두 이소플라본 추출물을 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명은 대두 원료를 추출기에 넣고 추출용매를 용출시키면서, 유속, 온도, 추출용매의 조성에 따라 원료에서 추출되는 성분의 패턴이 달라진다는 사실에 기초하여 추출과 동시에 고함량의 플라보노이드 추출물을 제공할 수 있음을 발명하였다. 이는 컬럼내부의 수지에 흡착된 물질이 이동상을 통해 용출되는 현상과 유사하므로 본 발명자들은 사용된 컬럼 추출기술로 명명하였다. 본 발명의 컬럼추출 기술의 또 다른 특징은 추출후, 추출액과 잔류물을 별도의 분리공정이 필요 없이 단번의 추출공정으로 추출/분리/정제를 동시에 수행할 수 있는 효율적인 제조방법을 제공하는데 있다.

따라서, 본 발명은 컬럼 추출 기술을 이용하여 최근 소비자 경향을 반영하여 유기용매사용을 최소화하고, 인체에 무해하며 고함량의 대두 이소플라본 추출물의 친환경적 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 다른 목적은 고함량의 대두 이소플라본 추출이 진행되는 과정에서 이소플라본 성분이 산화/분해되는 현상을 최소화 할 수 있는 이른바 온화한 추출조건 (mild extraction condition) 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 물을 추출용매로 주로 사용하고 여기에 유기용매 사용을 최소화하는 방식을 채택하여 대두부터 고함량의 인체에 무해하고 친환경적인 이소플라본 추출물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 대두 원료물질을 추출용 컬럼에 충진한 후 물을 이용하여 수용성 성분을 1차 추출제거하는 단계화; 상기 1차 추출단계에서 얻은 수용성 성분을 제거한 잔사에 다시 에탄을을 사용하여 대두 이소플라본을 2차 추출하는 단계화; 상기 단계에서 얻은 2차 추출물을 회수하여 농축한 후 분무건조하는 단계로 이루어지고 수득한 대두 이소플라본 추출물을 평가함으로써 달성하였다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 컬럼 추출 기술을 이용하여 대두 이소플라본을 제조함에 있어서, 추출 공정이 개선되어 종래의 유기용매를 이용한 교반 추출방식에 비해 추출 효율을 높이고 순도는 현저히 증가되는 효과가 있을뿐만 아니라, 유기용매 사용량의 감소를 통하여 추출시간의 단축은 물론 제조 원가를 저감할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 방법에서 이용된 컬럼 추출장치를 나타낸 것이다.

실시예 1 : 1단계 수용성 성분제거를 위한 추출온도 최적화

1kg의 대두배아를 121℃에서 15분간 습윤고압 처리 후 건조하였다. 건조한 대두배아50g씩을 추출기에 넣고 정제수를 750mL 로 추출하였다. 추출온도는 각각 5℃, 15℃, 25℃, 40℃, 60℃ 온도 조건에서, 2시간 동안 교반추출하였다. 추출액을 회수하여 13500rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 샘플링하여 각각의 brix 및 이소플라본 함량을 측정하였다. Brix는 refractometer를 이용하여 측정하였고, 이소플라본 함량은 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin), 제니스틴(genistin)을 HPLC로 각각의 함량을 측정하고 그 합을 총 이소플라본 함량으로 분석하였다. 상기 HPLC 정량 분석시, 칼럼은 Sunfire(C18, 5um), 내경 4.6mm, 길이250mm를 사용하였으며, 검출유속은 1mL/min에 주입량은 10uL으로 용리액은 아세토나이드릴과 0.1%초산(Acetic acid)으로 하였으며, 검출 파장은 280nm로 사용하였다.

추출되는 수용성 물질의 양은 brix측정을 통해 확인할 수 있고, 이때 손실되는 이소플라본량은 추출액의 이소플라본 함량을 통해 확인하였다.

실험결과, 수용성 성분을 효과적으로 제거하는 동시에 이소플라본의 손실을 최소화 할 수 있는 추출온도는 5~40℃범위이다. 40℃ 이상에서는 수용성 성분 의 제거가 더 잘 이루어지나, 이소플라본 손실 정도도 증가하는 경향을 나타내어 40℃이하에서 수용성 성분을 제거하는 것이 효과적이었다 (표 1).

온도에 따른 수용성 성분제거 및 이소플라본 손실 정도 비교
추출온도	5℃	15℃	25℃	40℃	60℃
birx	1.0	1.2	1.6	1.9	2.3
총 이소플라본 (ppm)	100	105	114	152	224

실시예 2 : 1단계 수용성 성분제거를 위한 추출pH 최적화

상기 실시예 1에서 얻은 건조한 대두배아50g씩을 추출기에 넣고 정제수를 750mL 로 추출하였다. 25℃에서 추출하였고, 3N HCl을 사용하여 추출용매의 pH를 각각 3.0, 4.0, 4.5, 5.0 ,5.5, 6.0, 7.0, 8.0조정하면서 2시간 동안 교반추출하였다. 추출액을 회수하여 13500rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 샘플링하여 각각의 brix 및 이소플라본 함량을 측정하였다.

실험결과, 수용성 성분을 효과적으로 제거하는 동시에 이소플라본의 손실을 최소화 할 수 있는 추출pH는 4.0~7.0 범위였다. pH 7.0이상에서는 에서는 수용성 성분이 더 잘 추출되나, 이소플라본 손실 정도도 증가하는 경향을 나타내어 pH7.0이하에서 수용성 성분을 제거하는 것이 효과적이었다. pH가 낮아질 수록 이소플라본 손실이 줄어드는 경향이 있으나, pH4.0이하 부터는 미미하다는 것이 확인되었다 (표 2).

pH에 따른 수용성 성분제거 및 이소플라본 손실 정도 비교
추출pH	3.0	4.0	4.5	5.0	6.0	7.0	8.0
birx	0.9	0.9	0.7	0.9	1.0	1.7	2.1
총 이소플라본 (ppm)	70	72	73	92	112	114	312

실시예 3 : 2단계 고순도 이소플라본 추출물 제조를 위한 추출용매의 에탄올 함량 결정

1kg의 대두를 분쇄하여 10mesh를 통과한 파우더를 60℃에서 4시간 열풍 건조한 후 시료로 사용하였다. 시료 50g을 넣고, 추출용매를 각각 750mL을 첨가하여 60℃ 온도에서 200rpm으로 진탕교반하여 1시간동안 추출하였다. 추출용매는 정제수, 30%에탄올, 50%에탄올, 70%에탄올, 95%에탄올을 각각 사용하였다. 추출액을 0.45um 시린지 필터로 여과하여 이소플라본 함량을 HPLC로 정량분석하였다.

실험결과, 이소플라본을 추출하기 위한 추출용매로서 30~70% 에탄올을 사용하여 추출할 때 추출 수율이 높아지며 에탄올 함량이 70%일때 최대 추출수율을 나타내는 것을 확인하였다. 에탄올 함량이 70% 이상 또는 30%이하에서는 추출 수율이 현저히 떨어졌다 (표 3).

에탄올 함량에 따른 이소플라본 추출 정도 비교
에탄올 함량	물	30% 에탄올	50% 에탄올	70% 에탄올	95% 에탄올
총 이소플라본 (ppm)	224	314	312	319	76

실시예 4 : 대두배아로 부터 교반추출, 컬럼추출 의해 제조된 추출물의 이소플라본 함량 비교

<실험예 1> 컬럼추출에 의한 대두배아 이소플라본 추출물 제조

상기 실시예 1에 따라 건조한 대두배아200g을 도 1의 컬럼추출기에 충진하였다. 수용성 성분을 1차 추출하여 제거하는 단계로 25℃ 에서 조건에서 추출용매로 정제수를 원료대비 10배를로 사용하였으며 펍프에서 20mL/min 속력으로 정제수를 이송하여 수용성 성분을 제거하였다. 1차 추출이 종료된 후 추출용매를 70%에탄올로 바꾸어 2차 추출을 진행하였다. 추출pH를 4.0~4.5로 조정하기 위해 3N HCl를 70%에탄올에 첨가하였다. 2차 추출시 60℃ 온도에서 추출용매를 20배를 사용하였고, 20mL.min 속력으로 추출하였다. 2차 추출용액 0~5배, 5~10배, 10~20배 용출 시점에서 얻어진 추출액을 3500rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 60℃ 감압 농출하여 분말화 하였다.

<실험예 2> 교반추출에 의한 대두배아 이소플라본 추출물 제조(대조군)

대조군은 대두배아 50g을 2L 용기에 넣고 70% 에탄올 1000mL을 투입하여 제조하였다. 60℃에서 160rpm으로 교반하면서 1시간동한 추출하였다. 여과망을 이용하여 추출액을 분리한 후 3500rpm으로 20분간 원심분리하였다. 상등액을 60℃ 감압 농축하여 분말화 하였다.

<실험예 3> 이소플라본 함량 분석

이소플라본 함량은 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin), 제니스틴(genistin)을 HPLC로 각각의 함량을 계산하고 그 합을 총 이소플라본 함량으로 분석하였다. 상기 HPLC 정량 분석시, 칼럼은 Sunfire(C18, 5um), 내경 4.6mm, 길이250mm를 사용하였으며, 검출유속은 1mL/min에 주입량은 10uL으로 용리액은 아세토나이드릴과 0.1%초산(Acetic acid)으로 하였으며, 검출 파장은 280nm로 사용하였다.

실험결과, 교반추출시, 이소플라본 함량은 3.0% 이며, 컬럼추출시 6.3~17.7%수준의 고함량 이소플라본 추출물을 제조할 수 있었다. 이는 대조군에 비해, 2~5.9배로 높은 고함량의 이소플라본 추출물을 별도의 정제 공정없이 추출공정만으로 제조할 수 있음을 의미한다 (표 4).

대두배아에서 교반추출, 컬럼추출시 추출물의 이소플라본 함량 비교
	교반추출	컬럼추출
		0-5	5-10	10-20
총 이소플라본 함량(%)	3.0	6.3	9.8	17.7

실시예 5 : 대두종실로부터 교반추출, 컬럼추출 의해 제조된 추출물의 이소플라본 함량 비교

<실험예 4> 컬럼추출에 의한 대두이소플라본 추출물 제조

실시예 3에 따라 대두를 분쇄하여 10mesh를 통과한 파우더를 60C℃서 4시간 열풍 건조하여 사용하였다. 건조한 대두분말 250g을 도 1의 컬럼추출기에 충진하였다. 수용성 성분을 1차 추출하여 제거하는 단계로 15℃ 조건에서 추출용매로 정제수를 원료대비 10배 사용하였으며 펍프에서 20mL/min 속력으로 정제수를 이송하여 수용성 성분을 제거하였다. 1차 추출이 종료된 후 추출용매를 70%에탄올로 바꾸어 2차 추출을 진행하였다. 추출pH를 4.0~4.5로 조정하기 위해 3N HCl를 70%에탄올에 첨가하였다. 2차 추출시 60℃ 온도에서 추출용매를 20배를 사용하였고, 20mL.min 속력으로 추출하였다. 2차 추출용액 0~5배, 5~10배, 10~20배 용출 시점에서 얻어진 추출액을 3500rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 60℃ 감압 농출하여 분말화 하였다.

<실험예 5> 교반추출에 의한 대두이소플라본 추출물 제조(대조군)

대조군은 건조한 대두분말 50g을 2L 용기에 넣고 70% 에탄올 1000ml을 투입하여 제조하였다. 60℃에서 160rpm으로 교반하면서 1시간동한 추출하였다. 여과망을 이용하여 추출액을 분리한 후 3500rpm으로 20분간 원심분리하였다. 상등액을 60℃ 감압 농축하여 분말화 하였다.

실험결과, 교반추출시, 이소플라본 함량은 1.3% 이며, 컬럼추출시 4.3~22.3%수준의 고함량 이소플라본 추출물을 제조할 수 있었다. 이는 대조군에 비해, 3.3~17.2배로 높은 고함량의 이소플라본 추출물을 별도의 정제 공정 없이 추출공정만으로 제조할 수 있음을 의미한다 (표 5).

대두종실에서 교반추출, 컬럼추출시 추출물의 이소플라본 함량 비교
	교반추출	컬럼추출
		0-5	5-10	10-20
총 이소플라본 함량(%)	1.3	4.3	10.8	22.3

이상 발명의 상세한 설명을 통하여 명백한 바와 같이 본 발명은 대두로부터 고함량의 이소플라본 추출물을 별도의 정제공정 없이 컬럼 추출기술만으로도 단번에 고효율로 제조할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 식품소재산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

이소플라본 원료물질을 추출용 컬럼에 충진한 후 물을 이용하여 수용성 성분을 1차 추출하여 제거하는 단계와; 상기 1차 추출단계에서 수용성 성분을 제거한 잔사에 다시 에탄올을 처리하여 대두 이소플라본을 2차 추출하는 단계와; 상기 2차 추출단계에서 얻은 추출물을 회수하여 농축한 후 분무건조하는 단계로 이루어진 것이 특징인 대두 이소플라본 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 이소플라본 원료물질은 대두, 탈지배아, 탈지대두 또는 탈지 대두배아 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 1차 추출단계의 추출 온도는 5~40℃, pH는 4.0~7.0이고 원료물질 대비 물은 5~20배(W/V)를 사용하여 수용성분을 추출제거하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 2차 추출단계의 에탄올의 조성은 30~70 용량%, 추출온도 25~60℃, pH는 4.0~6.0 및 원료 대비 상기 에탄올 5~20배(W/V)인 것이 특징인 방법.