JP5364953B2

JP5364953B2 - 新規イソフラボン化合物

Info

Publication number: JP5364953B2
Application number: JP2008204644A
Authority: JP
Inventors: 一寛奈良
Original assignee: カルビー株式会社
Priority date: 2007-08-07
Filing date: 2008-08-07
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2028-08-07
Also published as: JP2009057379A

Description

本発明は、新規なイソフラボン化合物に関する。

イソフラボンはフラボノイドの一種として広く植物界に分布しており、マメ科植物、特に大豆に多く含まれる。現在までに大豆からダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインの3種類のアグリコンとその配糖体を含む12種類の存在が確認されており（非特許文献１）、近年、植物由来の女性ホルモン様物質（フィトエストロゲン）として、更年期女性におけるホルモンバランスの乱れによる骨粗鬆症等の更年期障害に対する改善効果が報告されている。この他、発ガン・ガン細胞増殖抑制、心疾患予防効果、抗酸化作用等の様々な薬理作用が報告されている。特に、ゲニスチンは、ゲニステインをアグリコンに持つ配糖体であり、唾液や小腸粘膜の酵素、あるいは腸内細菌の持つβ-グルコシダーゼにより加水分解されることでゲニステインが生成され、抗酸化作用、発ガン抑制、抗腫瘍、美白効果など多くの機能が期待できることが報告されている。

アピオス（アピオス・アメリカーナ；Apios americana Medik）は、北米原産のマメ科のツル性多年草植物であり、地下に数珠状の実を結び、それを食用としている。一部の農家で強精の効果があることで、疲労時、妊娠時に食べられてきた。ジャガイモやサツマイモに比べてカルシウムが多いなど、非常に栄養価が高い。また、アトピー、高血圧症、腰痛、糖尿病、便秘症の改善や解消、滋養強壮等数多くの効能が報告されており、最近では血圧上昇抑制作用および脂質代謝改善作用を有する可能性も示されている。しかしながら、アピオスの成分についての検討は十分にされておらず、マメ科作物であるにも関わらずイソフラボンについての検索もほとんど行われていない。従って、一般に広く消費される食物の中では大豆がほぼ唯一のイソフラボン供給源である現在の状況において、アピオスを新たなイソフラボン供給源として認識し、さらに新規なイソフラボン化合物を得ることは有用である。

Kudou, S., Y. Fleury, D. Welti, D. Magnolato, T. Uchida, K. Kitamura and K Okubo 1991. Malonyl isoflavone glycosides in soybean seeds(Glycine max Merrill). Agric. Biol. Chem. 55: 2227-2233

本発明は、新規なイソフラボン化合物を提供することを目的とする。

本発明では、新たなイソフラボン供給源としてアピオスに着目し、その抽出物の成分について検討、解析した結果、新規のイソフラボンに至った。
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）の化合物、そのラセミ体または光学異性体を提供する。
また、本発明は上記一般式（Ｉ）の化合物、そのラセミ体または光学異性体を含むラジカル消去剤を提供する。

（式中、
Ｒ¹〜Ｒ²は、それぞれ独立に水素または炭素数１〜３のアシル基を表し、
Ｒ³〜Ｒ⁹は、それぞれ独立に水素または炭素数１〜３のアシル基を表し、
Ｒ¹⁰は、存在しないか、またはハロゲン原子を表す。）

本発明の式（Ｉ）のイソフラボン化合物においては、式中、Ｒ¹〜Ｒ²およびＲ³〜Ｒ⁹は、それぞれ独立に水素または炭素数１〜３のアシル基を表し、前記アシル基としては例えばホルミル基、アセチル基、マロニル基などが挙げられる。Ｒ¹〜Ｒ²およびＲ³〜Ｒ⁹は、好ましくは水素である。Ｒ¹〜Ｒ²およびＲ³〜Ｒ⁹のいずれかの基がアシル基である場合、その基は常法により導入することができる。

上記の表記は、-ＯＲ¹基のオルトまたはパラのいずれかの位置の水素原子がＲ¹⁰により置換されることを意味する（ただし、Ｒ¹⁰が存在する場合）。ここで、Ｒ¹⁰は、存在しないか、またはハロゲン原子を表す。また、本明細書において「Ｒ¹⁰が存在しない」とは、ＯＲ¹基のオルトまたはパラのいずれの位置の水素原子も置換されていないことを意味する。ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などである。ハロゲン原子が存在する場合、それは常法により導入することができる。

式（Ｉ）の化合物は、ゲニステインの基本骨格（アグリコン）に２分子のグルコースが結合した配糖体である。大豆では、同様にゲニステインをアグリコンに持つ配糖体であるゲニスチン（Genistein 7-O-glucoside；グルコース１分子付加）が知られているが、今回アピオスより分離・精製された式（Ｉ）の化合物：Genistein 7-O-gentiobiosideは、現在までに行われた研究報告等にも見られず、初めて分離・精製された成分である。ゲニスチンは、唾液や小腸粘膜の酵素、あるいは腸内細菌の持つβ-グルコシダーゼにより加水分解されることで、ゲニステインが生成され、そのゲニステインは、抗酸化作用、発ガン抑制、抗腫瘍、美白効果など多くの作用の可能性が報告されている。実施例の項で後述するように、本発明の式（Ｉ）のイソフラボン化合物もまた、β-グルコシダーゼにより加水分解されてゲニステインが生成されることが示されており、よって、式（Ｉ）の化合物もまた、β-グルコシダーゼによってアグリコン（ゲニステイン）に変換され、抗酸化作用、発ガン抑制、ガン細胞増殖抑制作用、コレステロールの低下など様々な効果が期待できる成分であることが見込まれる。
さらに、一般にイソフラボンは水に比較的溶けにくい性質であるが、グルコース等の付加した配糖体ではアグリコンに比べ約1000〜10000倍水溶化の程度が高いなど、可溶化の程度にも大きな違いがある。今回分離・精製されたGenistein 7-O-gentiobiosideは、ゲニステインに比べ糖分子が多いことから水溶化しやすいと考えられ、従来のイソフラボン類と比較して有利な生理活性を有すると考えられる。

また、本発明のラジカル消去剤は、上記一般式（Ｉ）の化合物、そのラセミ体または光学異性体を含む。本発明のラジカル消去剤が使用できるラジカルの種類は特に限定はされず、例えば、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、その他にペルオキシラジカル、アルコキシラジカル、ヒドロキシペルオキシドや合成ラジカルである1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル（DPPH）などを有効に消去することができる。また、その使用の形態は特に限定されるものではなく、精製の程度、溶媒の種類、濃度等は当業者が具体的な用途に応じて任意に設定することができる。例えば、後述の実施例に示すような方法により、HPLC解析で確認されたピーク(1)の物質を精製し、その生成物を例えば0.1〜50mg/ml、好ましくは0.5〜10.0mg/mlの濃度で50％エタノール溶液に溶解して使用することができる。本発明のラジカル消去剤は、50％エタノール溶液に溶解したラジカル消去剤の試料50μlと0.1mM DPPH / 50％エタノール溶液150μlとを混合し、室温にて15分間攪拌した場合、ラジカル消去剤の濃度に応じて、例えば10.0mg/mlの試料を使用した場合には540nmの吸光度を基準として測定して40％以上のDPPHラジカルを消去することができる。本発明のラジカル消去剤は、その活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであっても良いし、抽出物を主成分とする栄養補助食品等の用途に有効に利用することができる。
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。

（１）イソフラボン類の抽出および分析
アピオス（生重量：100g）をスライスした後、凍結乾燥し（乾燥重量：43.7g）、ミキサーにて粉末とした。この粉末試料約0.1g（乾燥重量）に10mlの80％エタノールを加え、25℃で1時間振とうした。遠心操作（3,000rpm×10分）により可溶性画分（上清）を回収し、それを0.45μmのメンブランフィルターにて濾過した後、以下の条件でHPLCに供した。なお、260 nmはイソフラボンの吸収スペクトルである。
（HPLC条件）
分析波長： 260 nm
カラム： Inertsil ODS-3 (4.6×250mm, GL Science)
溶媒：

カラム温度： 40℃
流速： 1.0ml/分
HPLC解析の結果、アピオス抽出物にはメインピーク（ピーク(1)）が存在し、その他にもいくつかのピークが認められた（図１）。市販のイソフラボン類（対照サンプル）と比較したところ、ゲニスチンのピークのみが一致したが、ピーク(1)を含むそれ以外のピークは標準品とは一致しなかった。

（２）アピオス抽出物のβ-グルコシダーゼ処理
アピオス抽出物をβ-グルコシダーゼで処理することによるHPLC溶出パターンの変化を解析した。
粉末試料約0.1g（乾燥重量）に10mlのMilli-Q水（ミリポア社製Milli-Qにより製造された純水：MQ水）を加え沸騰した湯浴中で内在性の酵素を失活させた後、25℃1時間振とうした。遠心操作（3,000rpm×10分）により可溶性画分を回収し、その試料1mlに、市販のβ-グルコシダーゼ（β-Glucosidase from Almond、オリエンタル酵母）を5U添加し、45℃で4時間反応させた。その後、沸騰した湯浴中で酵素を失活させ、0.45μmのメンブランフィルターにて濾過した後、HPLCに供した。
酵素反応前後におけるHPLCの溶出パターンを図２に示す。β-グルコシダーゼ処理前には、ピーク(1)がメインピークとして認められ、その他にゲニスチンが含まれていたが、β-グルコシダーゼ処理後では、ピーク(1)およびゲニスチンが認められず、新たにゲニステインが認められた。酵素処理前にメインピークとして認められたピーク(1)が処理後は存在しなかったことから、ピーク(1)は、ゲニステインをアグリコンに持つイソフラボン類であると考えられた。以上の結果を踏まえ、以下に記載するように、続いてアピオス抽出物からピーク(1)を分取、精製して、構造解析を行った。

（３）アピオス抽出物における新規イソフラボン（ピーク(1)）の精製
HPLC解析で確認されるピーク(1)の物質の精製を行った。生のアピオス（皮付き約100g）に3倍量のエタノールを加えてミキサーにて攪拌した（25℃、1分）。磨砕物を吸引ろ過し、不溶性残渣は80％エタノールとともにミキサーで磨砕・ろ過操作をさらに2回繰り返した。ろ液はすべてを回収し、濃縮乾固後、凍結乾燥しアルコール可溶性画分（ASS）とした。ASSをMQ水に溶解し、遠心操作（3,000rpm×10分）にて不溶物を除去し、上清をダイアイオンHP20カラム（三菱化学、2.5×25cm）に供した。まず、MQ水（500ml）で溶出した後、20、40、60および80％エタノール（それぞれの各500ml）にて吸着物を順次溶出させた。ゲニスチンおよびゲニステイン等のイソフラボンを多く含む場合には260nmの吸光度が大きくなることを指標として、分画した各画分の吸光度を測定したところ、40％画分で有意に高いことが確認された（図３）。

次に、イソフラボン類を多く含む画分（40％画分）をHPLCに供し、試験管1本当たり4mlで分画した。
（HPLC条件）
分析波長： 260 nm
カラム： Inertsil PREP-ODS (20×250mm, GL Science)
溶媒： 0.1%酢酸：アセトニトリル＝80：20
流速： 4.0ml/分
分画した結果、いくつかのピークが認められた（図４）。溶出順に画分i〜viに分別して、Inertsil ODS-3カラムに供したところ、画分viにピーク(1)が含まれることが確認され、また、それが単一ピークであることが明らかとなった（図５）。

（４）精製した新規イソフラボン（ピーク(1)）の構造解析
HP20およびHPLCにて精製したピーク(1)をLC/MSに供して分子量を検討した。
（LC/MS条件）
分析波長： 260 nm
カラム： CAPCELL PAK C₁₈ MG (2.0×150mm, 資生堂)
溶媒：

カラム温度： 40℃
流速： 0.4ml/分
検出法：エレクトロスプレーイオン化（ESI）法
LC/MS分析の結果、ゲニステインの分子イオンピーク[M+H]⁺としてm/z 271（270+1）が検出され、さらに、m/z 433（270+162+1）および595（270+162+162+1）が検出された（図６）。したがって、画分viは、ゲニステインに糖が2分子結合したグルコシド配糖体であると考えられた。さらに、¹H-NMRおよび¹³C-NMRによって詳細構造を解析した結果、精製したピーク(1)は、ゲニステインにゲンチオビオース（6-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucose）が結合したGenistein 7-O-gentiobiosideであることが判明した（図７）。

（５）精製した新規イソフラボン（ピーク（１））の1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル（DPPH）ラジカル消去活性
精製した新規イソフラボンを秤量し、50％エタノール溶液にて各種濃度（0.5、1.0、2.0、5.0および10.0mg/ml）に調製した溶液をDPPHラジカル消去活性の試料として用いた。
96穴のマイクロプレートに濃度調製した試料50μlと0.1mM DPPH / 50％エタノール溶液150μlを加え、室温にて15分間攪拌後、マイクロプレートリーダーを用いて540nmの吸光度を測定した(A)。同時に50％エタノール溶液150μlに試料溶液50μlを加えたものをブランク(B)とし、50％エタノール溶液50μlに0.1mM DPPH / 50％エタノール溶液150μl加えたものをコントロール(C)として、各吸光度から、次式によってDPPHラジカル消去率（％）を算出した。
DPPHラジカル消去率（%）＝｛ 1−（A−B）/ C ｝×100
その結果、図１に示すように、精製した新規イソフラボンはラジカル消去作用を有することが確認された。

アピオスの80％エタノール抽出物におけるHPLCの溶出パターンを示す。アピオス抽出物におけるβ-グルコシダーゼ処理前後のHPLCの溶出パターンを示す。 HP20カラムにて分別した各画分における260nmの吸光度を示す。 HP20カラムにて分別した40％画分におけるHPLCの溶出パターンを示す。分取したピーク（１）(画分vi)におけるHPLCの溶出パターンを示す。精製した画分viの質量スペクトルを示す。精製した画分viのNMRによる構造解析を示す。（A）ピリジン-d5中における¹³C-NMRアサインメントを示す。（B）ピリジン-d5中における¹H-NMRアサインメントを示す。精製した新規イソフラボンのDPPHラジカル消去活性を示す。

Claims

一般式（Ｉ）の化合物。

（式中、
Ｒ¹〜Ｒ²は、それぞれ独立に水素または炭素数１〜３のアシル基を表し、
Ｒ³〜Ｒ⁹は、それぞれ独立に水素または炭素数１〜３のアシル基を表し、
Ｒ¹⁰は、存在しないか、またはハロゲン原子を表す。）
式中、Ｒ¹〜Ｒ⁹が水素を表し、かつ、Ｒ¹⁰が存在しない、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項１または２の化合物を含むラジカル消去剤。