CN101200744B - 一种大豆异黄酮苷元高效清洁制备方法 - Google Patents

一种大豆异黄酮苷元高效清洁制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大豆异黄酮苷元的清洁高效制备方法，其步骤包括将脱脂大豆粉或大豆豆粕溶解于水或缓冲液配制料液，向该料液中加入β-葡萄糖苷酶进行水解，然后向酶解后的沉淀物加入乙醇进行提取、抽滤去渣，滤液经真空浓缩得到大豆异黄酮苷元产品。本发明以改原有先提取大豆异黄酮后将其生物转化成苷元的两步法，将耐热性β-葡萄糖苷酶用于大豆异黄酮的热提取工艺中，直接利用大豆豆粕或脱脂大豆粉制备大豆异黄酮苷元，使原料中的大豆异黄酮边热抽提边转化，避免初始底物的浓度过高对酶催化的抑制作用，大大加快反应速度，提高酶水解效率，与现有的酶法提取相比，生产周期短、操作简单、收率高、成本低、无污染，所得产品用于食品或药品安全。

Description

一种大豆异黄酮苷元高效清洁制备方法
技术领域
本发明涉及一种功能性大豆异黄酮的制备方法，具体地说涉及一种大豆异黄酮苷元的酶法制备方法，更具体地说是提供一种适合于工业化生产染料木黄酮和黄豆苷元的方法。
技术背景
人们对大豆及其制品的营养作用和保健功效研究的深入，发现大豆除了含有丰富的蛋白质和油脂外，还含有许多有益的生物活性物质，如大豆磷脂、大豆低聚糖、大豆皂苷和大豆异黄酮等。在这些生物活性物质中，大豆异黄酮因具有明显的生物学活性已越来越引起社会和学术界的普遍关注，成为近年来世界各国科学家研究的热点。近期研究结果表明：大豆异黄酮具有较强的生理功能，具有抗肿瘤，尤其是对与激素有关的肿瘤如乳腺癌和前列腺癌有显著的抑制作用，对血管的防护作用、抗氧化活性和预防骨质疏松症，并能治疗和预防心脑血管疾病。大豆异黄酮共有12种异构体，主要以游离型的甙元(aglycon)和结合型的糖苷(glucosides)两种形式存在，天然状态下的大豆异黄酮主要以糖甙形式存在，占总量的97％-98％，甙元占总量的2％-3％。研究发现，糖苷形式的大豆异黄酮不具有最佳的生理活性状态，须在大豆异黄酮糖苷酶的作用下转化成甙元形式才能被吸收而发挥药效。由此可见，把大豆异黄酮糖苷型及糖苷衍生物转化成苷元形式，是提高其生物利用率的前提。
目前制备大豆苷元的方法主要有：化学合成法、酸碱水解方法和酶水解法。其中以代替许多化学转化过程存在的高温、高压、耗水、高污染、苛刻及有害条件、非特异性反应等缺点，前两种存在对甙元破坏性大，污染大，目的性差等缺点；
酶是一种生态型高效催化剂，具有高效、安全、生态和环保等特点，能够在反应条件温和的生态条件下发挥高效、专一、环保、减少设备投资、提高生产效率等作用，实现工业过程，为社会提供更健康、安全、高效、绿色的产品。因此，酶水解法是大豆异黄酮提取及转化的理想途径。
综合目前已有的酶法制备大豆异黄酮苷元方法，其主要包括以下步骤：
(1)以大豆异黄酮粉、脱脂豆粕或大豆糖蜜为原料制备大豆异黄酮糖苷提取物
(2)外加大豆异黄酮糖苷水解酶，所用的大豆异黄酮糖苷水解酶包括葡萄糖苷酶、葡萄糖酸酶、半乳葡萄糖苷酶、生物乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等(Shen，et al 1998：Bryan，BarbaraA et al 2002：Tsuruhami，Kazutakaet al 2003)，大豆β-葡萄糖苷酶以及从天然食用原料(香菇、金针菇、小麦种子、小麦芽、大麦种子或大麦芽)中提取水解酶液；使用的微生物包括黑曲霉、米曲霉、乳克鲁威氏酵母、假丝酵母、大肥菇菌和脆壁克黑曲霉以及高温耗氧霉菌；
(3)在30-75℃下保温1-48小时；
(4)经再进行离心固液分离，沉定物经低温干燥得到大豆异黄酮苷元，或用乙醇、正丁醇、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯或与它们有相近特性的有机溶剂进行萃取，蒸去有机溶剂，真空干燥，得富含染料木黄酮和黄豆苷元干粉产品。
这些方法由于存在着所用酶稳定性差、纯度低、操作复杂、收率低、生产成本较高、有机溶剂残留造成环境污染等问题，因此都未能得到广泛的应用。
科学研究表明：游离形式的大豆异黄酮水溶性最差，基本不溶于水，而葡萄糖苷型一般易溶于水，但大豆中含量最高的染料木苷genistin则难溶于水，但在70-90℃时其溶解度随着温度的升高而显著增加。本发明利用上述溶解特性，开发出一种大豆异黄酮苷元高效清洁制备方法。
发明内容
为了解决现有酶法制备大豆异黄酮苷元的不足，本发明提供了一种高效清洁的制备方法。本发明方法是针对大豆异黄酮糖苷和苷元的溶解特性，将耐高温的β-葡萄糖苷酶用于大豆异黄酮的提取工艺中，即添加耐高温β-葡萄糖苷酶于大豆粉浆且在70-90℃下保温3-5小时，使水溶性大豆异黄酮在从大豆粉溶出的同时被去糖基而转化为不溶性的有效成分苷元，这样用80％乙醇直接提取离心所得沉淀即可得到大豆异黄酮苷元。因耐高温β-葡萄糖苷酶稳定性高，所得残液中酶残余活性和有效成分可回用。由于在从大豆粉溶出的水溶性大豆异黄酮不断地被转化为不溶性的苷元，这样在固相大豆粉与水相间保持一定浓度差而有利于水溶性大豆异黄酮不断从大豆粉溶出。
所述的大豆异黄酮苷元的高效清洁制备方法，其步骤如下：
步骤1：向脱脂大豆粉或大豆豆粕加入适量水或缓冲液配制料液，边搅拌边加热，控制温度在60-90℃，pH5-7；
步骤2：向上述料液中加入β-葡萄糖苷酶，继续保温低速搅拌进行酶水解反应，然后固液分离所得沉淀物备用，上清液用作下批提取的配料用水；
步骤3：向上述沉淀物中加入与大豆异黄酮苷元相似相溶的有机溶剂，边搅拌边提取，然后抽滤去渣，滤液进一步经真空浓缩得到大豆异黄酮苷元产品。
上述方法步骤1中所述大豆豆粕或脱脂大豆粉是来自油厂的下脚料大豆豆粕，也可以是将大豆经粉碎和去油后所得的脱脂大豆粉；为了提高大豆异黄酮收率，脱脂大豆粉经喷射液化处理效果最佳；为了达到较好的效果，所用配料水含有20％乙醇，料水比推荐为1∶3-10(w/v)；本发明所述的缓冲液推荐柠檬酸缓冲液(pH5-7)。
上述方法步骤2中，所述的β-葡萄糖苷酶，可由现有技术制得，本发明推荐使用耐热性β-葡萄糖苷酶，所说的耐热性是指在酶最适温度在60℃以上，优选海栖热袍菌β-葡萄糖苷酶。其水解条件，根据所选用的β-葡萄糖苷酶的特性而定，推荐水解温度控制在60-90℃。酶用量优选500-1000(U/g大豆豆粕或脱脂大豆粉)。
本发明方法中所述步骤3中可以向沉淀物中加入与大豆异黄酮苷元相似相溶的有机溶剂，如乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醚、二氯甲烷，进行萃取，但从产品用于食品或药品安全性考虑，本发明推荐使用乙醇，至于乙醇浓度和用量，推荐使用浓度等于或高于75％的乙醇，用量为沉淀物的3-10倍体积，如果在80℃下提取效果更佳。
本发明针对大豆异黄酮的溶解特性，采取边提取边转化的方法，以改原有先提取大豆异黄酮然后再将其生物转化成苷元的两步法，将高耐热性β-葡萄糖苷酶用于大豆异黄酮的热提取工艺中，直接利用大豆豆粕或脱脂大豆粉制备大豆异黄酮苷元，使原料中的大豆异黄酮边抽提边转化，避免初始底物的浓度过高对酶催化的抑制作用，大大加快反应速度，提高酶水解效率，是目前最直接有效的途径。与现有的酶法提取相比，该法生产周期短、操作简单、收率高、成本低、无污染。
本发明中所说的β-葡萄糖苷酶的制备可以由产β-葡萄糖苷酶的嗜热微生物液体发酵方法制得，例如，海栖热袍菌Thermotoga maritima、Thermotoga maritima FjSS3-B.1、解糖纤维素菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus、嗜热产乙醇菌Thermoanaerobacterethanolicus、嗜热梭菌Clostridium thermocellum等，可从美国菌种收藏中心购买，上述微生物发酵产生的β-葡萄糖苷酶可以经热处理或分子筛及离子交换色谱制备成部分纯化的酶液。
本发明中提及的耐热性β-葡萄糖苷酶还可通过利用基因重组技术将嗜热微生物中的β-葡萄糖苷酶基因表达在适当的宿主细胞构建基因工程菌来制备[参见薛业敏等人.海栖热袍菌极耐热性葡萄糖醛酸酶基因的高效表达和重组酶纯化.生物工程学报，2004，22(4)：554-560和李卫芬等人多粘芽孢杆菌β-葡聚糖酶特性及其基因克隆，浙江大学学报(农业与生命科学版)2004，30(3)：331-335]。
经验证，采用本发明的方法，与未加酶处理的脱脂大豆粉中大豆异黄酮成分相比较，染料木苷和黄豆苷水解效率可达98％以上(见图2、图3)，大豆异黄酮苷元的释放率高，大大提高了生产效率。由于酶法制备大豆异黄酮苷元，具有高效、专一，反应条件温和的优势，因此，整个加工过程作用条件温和，不使用酸碱等化学物质，能耗低，污染小，操作简单易控，同时产物易纯化，产品保持天然品质；由于所用原料为来源广泛的油厂下脚料大豆豆粕，大大降低生产成本，同时酶解后的豆渣仍然可以用于酱油生产原料、饲料蛋白添加剂以及环保材料，整个工艺过程不给环境带来任何污染和废物，具有重要的经济效益和社会效益。
附图说明
图1是制备大豆异黄酮苷元的工艺流程示意图。
图2是未加酶处理的脱脂大豆粉中大豆异黄酮成分的HPLC图谱。
色谱条件：色谱柱：Agilent HC-C18(4.6mm×250mm ID，5μm)；柱温：30℃；流动相：A为0.1％磷酸水溶液，B为乙睛10％-35％；流速：0.8mL/mim检测波长：260nm；进样量为20μL。以保留时间定性，以峰面积定量，以外标法计算。标准样品购于Sigma公司。其中：保留时间12.1min为黄豆苷，保留时间20.0min为染料木苷，保留时间21.0min为丙二酰黄豆苷，保留时间29.0min为丙二酰染料木苷，保留时间33.5min为黄豆素，保留时间46.4min为染料木素。
图3是酶处理后脱脂大豆粉中大豆异黄酮成分的HPLC图谱。色谱条件同上，其中：保留时间32.7min为染料木素，保留时间46.0min为黄豆素。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1：β-葡萄糖苷酶的制备：
本发明中的β-葡萄糖苷酶的制备可以海栖热袍菌Thermotoga maritima(具体操作参考Yu Jiang，Qing Zhou，Kang Wu，Xiangqian Li，and Weilan Shao.A highly efficient methodfor liquid and solid cultivation of the anaerobic hyperthermophilic eubacterium Thermotogamaritima.FEMS Microbiol Lett，2006，259：254-259)在含1.0％葡萄糖，0.5g％酵母粉，2.7％NaCl的培养基中，在温度80℃充CO2和N2条件下静置培养8-10h后收集细胞并破碎，离心取上清液并用65％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，然后用0.02M、pH5.5磷酸缓冲液透析后冻干即得β-葡萄糖苷酶。
实施例2：
如图1所示的流程，具体操作如下：
(1)将无霉变大豆去杂后磨成80目的大豆粉，然后用正己烷抽提去脂肪，获得脱脂大豆粉；
(2)将脱脂大豆粉，按料水比1∶4溶于pH 6.2 100mM磷酸钠缓冲液，边搅拌边加热至温90℃加入800U/g海栖热袍菌β-葡萄糖苷酶，保温并低速搅拌3小时；
(3)所得酶解液经离心分离，沉淀物用10倍体积80％乙醇80℃下提取2h，然后抽滤去渣，滤液进一步经真空冷冻干燥，所得产品采用HPLC高压液相色谱检测其中大豆异黄酮的成分见图3；HPLC分析条件：色谱柱：Agilent HC-C18(4.6mm×250mm ID，5μm)；柱温：30℃；流动相：A为0.1％磷酸水溶液，B为乙睛10％-35％；流速：0.8mL/min；检测波长：260nm；进样量为20μL。以保留时间定性，以峰面积定量，以外标法计算。标准样品购于Sigma和公司。
实施例3：与实施例1基本相同，不同之处在于所用原料为购于国内生物技术公司的大豆豆粕。采用料水比1∶3将豆粕溶于pH 5柠檬酸缓冲液配制料液。
实施例4：与实施例1基本相同，不同之处在于所用原料为酱品厂用作酱油生产的大豆豆粕，磷酸钠缓冲液pH 7。
实施例5：与实施例1基本相同，不同之处在于以大豆异黄酮粉为原料；采用料水比1∶10将豆粕溶于柠檬酸缓冲液配制料液；步骤2所得沉淀物直接低温干燥后即可得到大豆异黄酮苷元。
实施例6：与实施例1基本相同，不同之处在于所用的β-葡萄糖苷酶是解糖纤维素菌Caldicellulosiruptor saccharolyicus β-葡萄糖苷酶，反应温度80℃，pH 5.5下保温5小时，酶量为500U/g。
实施例7：与实施例1基本相同，不同之处在于所用的β-葡萄糖苷酶是多粘芽孢菌Bacillus polymyxa β-葡萄糖苷酶，反应温度60℃，pH 5.0，下保温10小时，酶量为1000U/g。
实施例8：与实施例1基本相同，不同之处在于步骤3中向沉淀物中加入3倍体积的80％乙醇进行提取。
实施例9：与实施例1基本相同，不同之处在于步骤3中向沉淀物中加入8倍体积的75％乙醇进行提取。
实施例10：与实施例1基本相同，不同之处在于步骤3中用乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醚或二氯甲烷进行萃取。

Claims (5)

1.一种大豆异黄酮苷元清洁高效制备方法，包括以下步骤：
步骤1：向脱脂大豆粉或大豆豆粕加入适量水或缓冲液配制料液，料水比为1∶3-10，边搅拌边加热，控制温度在80-90℃，pH5-7；
步骤2：向上述料液中加入耐热性β-葡萄糖苷酶，酶用量为500-1000U/g大豆豆粕或脱脂大豆粉，继续保温低速搅拌进行酶水解反应，然后固液分离，所得沉淀物备用，上清液用作下批提取的配料用水；
步骤3：向上述沉淀物中加入与大豆异黄酮苷元相似相溶的有机溶剂，边搅拌边提取，然后抽滤去渣，滤液进一步经真空浓缩得到大豆异黄酮苷元产品。
2.根据权利要求1所述的大豆异黄酮苷元清洁高效制备方法，其特征在于，其中所述的耐热性β-葡萄糖苷酶是海栖热袍菌β-葡萄糖苷酶。
3.根据权利要求1所述的大豆异黄酮苷元清洁高效制备方法，其特征在于，所述的步骤3中所说的与大豆异黄酮苷元相似相溶的有机溶剂，是乙醇。
4.根据权利要求3所述的大豆异黄酮苷元清洁高效制备方法，其特征在于，所述步骤3中向酶解后的沉淀物加入3-10倍体积乙醇进行抽提。
5.根据权利要求4所述的大豆异黄酮苷元清洁高效制备方法，其特征在于，所述的乙醇是浓度等于或高于75％的乙醇。
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