CN102994583A

CN102994583A - 一种生产大豆异黄酮苷元的方法

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Publication number: CN102994583A
Application number: CN2012105337830A
Authority: CN
Inventors: 齐崴; 王梦凡; 苏荣欣; 何志敏; 郭建; 鹿洋
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明涉及一种生产大豆异黄酮苷元的方法，以碱性乙醇水溶液为浸提剂，经β-葡萄糖苷酶酶解转化，高效获得大豆异黄酮苷元；进一步，采用高纯度乙醇沉淀低聚糖，乙酸乙酯萃取，去离子水水洗的方法精制大豆异黄酮苷元，得到高纯品，该方法可有效提高提取率，降低制备成本。整套工艺中未使用对人体有毒有害的有机溶剂，无碱性和酸性废液排出，使整个生产流程绿色高效、成本较低，具有很好的应用价值。

Description

一种生产大豆异黄酮苷元的方法

技术领域

本发明涉及一种从脱脂豆粕粉中提取精制大豆异黄酮苷元的方法，特别是一种适合工业化生产的绿色且高效的制备高纯度大豆异黄酮苷元的方法。

技术背景

流行病学调查研究发现长期食用大豆的东南亚人群中，癌症、心血管等疾病的发病率明显低于西方。大豆和豆制品具有广泛的生物活性，如防治癌症、降低血脂、抗动脉粥样硬化、抗骨质疏松、抗老年痴呆、改善妇女更年期综合症等，研究表明这些功效均与其中含有的活性物质异黄酮有关。

大豆异黄酮是一类大豆生长过程中形成的非固醇类物质，主要由12种化合物组成，可分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类，异黄酮以各种形式的糖苷为主存在于大豆及豆制类食品中，而研究表明，异黄酮却以苷元的形式在人体内发挥其生物活性，苷元型异黄酮比糖苷型异黄酮更具生物效用，所以生产制备高纯度苷元型异黄酮已成为大豆异黄酮的一个重要研究方向。

目前大豆异黄酮的提取工艺主要包括：（1）溶剂萃取法：通常采用乙醇水溶液，甲醇水溶液，丙酮，乙酸乙酯，弱碱性水溶液等有一定极性的溶剂萃取。这些常用萃取剂尚存在一些问题，例如弱碱性水溶液，提取液中糖类和蛋白等杂质含量增多，增加了后续分离工艺的难度，所得产品纯度低，环保成本高，不适宜工业化生产；若在工艺中使用甲醇等有毒溶剂，则产品中的残留将限制产品的应用；综合考虑多种因素，大多数企业采用乙醇水溶液提取豆粕中的大豆异黄酮，但提取速率偏低，耗时耗能；（2）超临界流体萃取法（专利公开号CN1570125A）此方法虽然具有提取率高，产品纯度好，流程简单，无有机溶剂残留等优点，但对设备要求较高，装置复杂，造价昂贵；（3）超声波萃取法（专利公开号CN101845077A）和微波萃取法：可显著提高提取效率，但多作为辅助提取手段，耗能大，成本高，阻碍了进一步的推广应用。

大豆异黄酮糖苷转化为苷元的工艺主要有：酸水解法（专利公开号CN101085768B）和碱水解法，其中碱水解法得到的大豆异黄酮苷元不稳定容易降解，目前多采用酸水解的手段制取大豆异黄酮苷元，但是酸水解需要较高的温度和强酸，对生产设备要求较高；酶水解条件温和，多采用弱酸性缓冲溶液，且大豆异黄酮苷元不易变性，但β-葡萄糖苷酶价格较高，经济效益低。

大豆异黄酮精制的方法主要有如下几种：超滤膜法（专利公开号CN1733926C），吸附法，柱层析法，高效液相色谱法，石油醚重结晶法（专利公开号CN1824661C）和溶剂萃取等方法，这些方法大都存在成本较高，有毒有机溶剂残留等缺陷，存在食品安全隐患。

发明内容

针对上述背景，本发明提供了一种新型、高效、绿色的生产高纯度大豆异黄酮苷元的方法。本方法以脱脂豆粕粉为原料，以碱性乙醇水溶液为浸提剂，经β-葡萄糖苷酶酶解转化，高效获得大豆异黄酮苷元；进一步，采用高纯度乙醇沉淀低聚糖，乙酸乙酯萃取，去离子水水洗的方法精制大豆异黄酮苷元，得到高纯品，该方法可有效提高提取率，降低制备成本。工艺流程图如图1所示。

具体步骤如下：

（1）将脱脂豆粕粉碎，过60~80目筛，获得脱脂豆粕粉；

（2）将脱脂豆粕粉溶于70%的乙醇溶液，固液比（脱脂豆粕粉:70%乙醇溶液（g/ml）=1:10~1:20），用碱调节pH=8~10后，将该体系置于温度为50℃~70℃的恒温水浴中进行萃取，提取1~4h，过滤除去滤渣，得到大豆异黄酮的碱性乙醇水提液；

（3）向步骤（2）所得大豆异黄酮碱性乙醇水提液中，加入盐酸调节pH为4.5~5.0，加入β-葡萄糖苷酶（1.5~2.0U/g豆粕粉），将该体系置于温度为40℃~60℃的恒温水浴中进行反应，酶解3h~5h，过滤除去沉淀，得到大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液；

（4）将步骤（3）中得到的大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液经减压蒸发除去乙醇水，得到大豆异黄酮苷元的粗品；在得到的异黄酮粗品中加入无水乙醇沉淀大豆低聚糖，同时萃取大豆异黄酮苷元，沉淀1~1.5h，离心得到大豆异黄酮苷元的乙醇溶液；

（5）将步骤（4）中得到的大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液减压蒸发除去乙醇，加入乙酸乙酯和水进行两相萃取，分液，取乙酸乙酯层，减压蒸发除去乙酸乙酯，得到异黄酮苷元粗品；

（6）将步骤（5）中的异黄酮苷元粗品用去离子水水洗，离心，冻干，得到纯度85%以上的苷元型大豆异黄酮。

注：U为β-葡萄糖苷酶酶活单位，定义为：pH7.0、37°C条件下，每分钟转化“对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷”生成1μmol“对硝基苯酚”所需的酶量。

本发明具有以下优点：

（1）采用碱性乙醇水溶液进行提取，较相同条件下的乙醇水溶液提取速率提高近80%，而且避免了弱碱性水溶液提取异黄酮的各种缺点，如：提取过程中不会有过多的蛋白和糖类被浸提出来，异黄酮占提取液的比重增加，有利于异黄酮的精制；采用Ca（OH）₂调节pH，价格低廉，并可明显提高提取速率。

（2）酶解过程中所用β-葡萄糖苷酶为GC220，此酶安全、环保，在温和的条件下即可发挥高效作用，酶解效率接近100%，容易实现工业化生产，较酸水解、碱水解具有明显优势。

（3）精制过程中采用多次溶剂萃取和去离子水水洗相结合的方法制得高纯度异黄酮苷元，每一步使用的萃取溶剂和去离子水均可回收利用，有效地降低了生产成本；同时，整套工艺中未使用对人体有毒有害的有机溶剂，无碱性和酸性废液排出，使整个生产流程绿色高效、成本较低，具有很好的应用价值。

附图说明

图1工艺流程图；

图2(a)大豆异黄酮酶解前色谱图；

图2(b)大豆异黄酮酶解后色谱图；

图3终产品大豆异黄酮苷元色谱图。

具体实施方式

实施例1:

（1）碱性乙醇水溶液浸提

将脱脂豆粕粉碎，过60~80目筛。取10g 60~80目脱脂豆粕粉，溶于100ml 70%的乙醇溶液中，Ca（OH）₂调节pH9.0，将该体系置于温度为70℃的恒温水浴中进行萃取，搅拌提取2h，提取完成后，抽滤，除去滤渣，取上清液备用。

（2）大豆异黄酮的酶解

用质量分数15%的HCl调节第（1）步中所得上清液的pH至4.8，加入GC22014.9U，将该体系置于温度为50℃的恒温水浴中进行反应，持续酶解4h，静置，过滤，除去沉淀，得到大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液，减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的水浓缩液，以6000r/min的转速离心10min，取沉淀，得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为1.4%。大豆异黄酮酶解前后色谱图对比如图2所示。

（3）除糖

在得到的异黄酮粗品中加入无水乙醇50ml，搅拌10min，静置，以6000r/min的转速离心10min，除去沉淀（大豆低聚糖粗品），减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元粗品，纯度13.2%。

（4）乙酸乙酯萃取

在大豆异黄酮苷元的水溶液中加入30ml乙酸乙酯和20ml水进行两相萃取，搅拌4h，分液，取乙酸乙酯层，减压蒸发，除去乙酸乙酯（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为67.4%。

（5）去离子水水洗

在所得大豆异黄酮苷元的粗品中加入约5ml去离子水水洗两次，得到大豆异黄酮苷元产品19.5mg，纯度87.5%。终产品大豆异黄酮苷元色谱图如图3所示。

实施例2:

（1）碱性乙醇水溶液浸提

将脱脂豆粕粉碎，过60~80目筛。取10g 60~80目脱脂豆粕粉，溶于150ml 70%的乙醇溶液中，Ca（OH）₂调节pH8.0，将该体系置于温度为60℃的恒温水浴中进行萃取，搅拌提取1h，提取完成后，抽滤，除去滤渣，取上清液备用。

（2）大豆异黄酮的酶解

用质量分数15%的HCl调节第（1）步中所得上清液的pH至4.5，加入GC22020.1U，将该体系置于温度为45℃的恒温水浴中进行反应，持续酶解4.5h，静置，过滤，除去沉淀，得到大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液，减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的水浓缩液，以6000r/min的转速离心10min，取沉淀，得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为1.5%。.

（3）除糖

在得到的异黄酮粗品中加入无水乙醇50ml，搅拌10min，静置，以6000r/min的转速离心10min，除去沉淀（大豆低聚糖粗品），减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元粗品，纯度13.8%。

（4）乙酸乙酯萃取

在大豆异黄酮苷元的水溶液中加入30ml乙酸乙酯和20ml水进行两相萃取，搅拌4.5h，分液，取乙酸乙酯层，减压蒸发，除去乙酸乙酯（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为69.6%。

（5）去离子水水洗

在所得大豆异黄酮苷元的粗品中加入约5ml去离子水水洗两次，得到大豆异黄酮苷元产品19.8mg，纯度89.1%。

实施例3:

（1）碱性乙醇水溶液浸提

将脱脂豆粕粉碎，过60~80目筛。取10g 60~80目脱脂豆粕粉，溶于200ml 70%的乙醇溶液中，Ca（OH）₂调节pH10.0，将该体系置于温度为50℃的恒温水浴中进行萃取，搅拌提取2h，提取完成后，抽滤，除去滤渣，取上清液备用。

（2）大豆异黄酮的酶解

用质量分数15%的HCl调节第（1）步中所得上清液的pH至5.0，加入GC22018.6U，将该体系置于温度为60℃的恒温水浴中进行反应，持续酶解3h，静置，过滤，除去沉淀，得到大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液，减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的水浓缩液，以6000r/min的转速离心10min，取沉淀，得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为1.3%。

（3）除糖

在得到的异黄酮粗品中加入无水乙醇50ml，搅拌10min，静置，以6000r/min的转速离心10min，除去沉淀（大豆低聚糖粗品），减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元粗品，纯度12.9%。

（4）乙酸乙酯萃取

在大豆异黄酮苷元的水溶液中加入30ml乙酸乙酯和20ml水进行两相萃取，搅拌3h，分液，取乙酸乙酯层，减压蒸发，除去乙酸乙酯（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为66.5%。

（5）去离子水水洗

在所得大豆异黄酮苷元的粗品中加入约5ml去离子水水洗两次，得到大豆异黄酮苷元产品19.3mg，纯度86.3%。

实施例4:

（1）碱性乙醇水溶液浸提

将脱脂豆粕粉碎，过60~80目筛。取5kg 60~80目脱脂豆粕粉，溶于50L 70%的乙醇溶液中，Ca（OH）₂调节pH9.0，将该体系置于温度为70℃的恒温水浴中进行萃取，搅拌提取4h，提取完成后，抽滤，除去滤渣，取上清液备用。

（2）大豆异黄酮的酶解

用质量分数15%的HCl调节第（1）步中所得上清液的pH至4.8，加入GC2207450U，将该体系置于温度为40℃的恒温水浴中进行反应，持续酶解5h，静置，过滤，除去沉淀，得到大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液，减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的水浓缩液，以6000r/min的转速离心10min，取沉淀，得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为1.2%。.

（3）除糖

在得到的异黄酮粗品中加入无水乙醇25L，搅拌10min，静置，以6000r/min的转速离心10min，除去沉淀（大豆低聚糖粗品）,取上清液，减压蒸发除去乙醇（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度12.8%。

（4）乙酸乙酯萃取

在大豆异黄酮苷元的水溶液中加入15L乙酸乙酯和10L水，搅拌5h，分液，取乙酸乙酯层，减压蒸发，除去乙酸乙酯（回收备用），得到大豆异黄酮苷元的粗品，纯度为65.1%。

（5）去离子水水洗

在所得大豆异黄酮苷元的粗品中加入约2.5L去离子水水洗两次，得到大豆异黄酮苷元产品94.5g，纯度85.7%。

本发明提出的一种生产大豆异黄酮苷元的方法，已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims

1.一种生产大豆异黄酮苷元的方法，其特征是步骤如下：

（1）将脱脂豆粕粉碎，过60~80目筛，获得脱脂豆粕粉；

（2）将脱脂豆粕粉溶于70%的乙醇溶液，固液比g/ml=1:10~20，用碱调节pH=8~10后，将该体系置于温度为50℃~70℃的恒温水浴中进行萃取，提取1~4h，过滤除去滤渣，得到大豆异黄酮的碱性乙醇水提液；

（3）向步骤（2）所得大豆异黄酮碱性乙醇水提液中，加入盐酸调节pH为4.5~5.0，加入β-葡萄糖苷酶1.5~2.0U/g豆粕粉，将该体系置于温度为40℃~60℃的恒温水浴中进行反应，酶解3h~5h，过滤除去沉淀，得到大豆异黄酮苷元的乙醇水溶液；

2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤（2）所用的碱为Ca（OH）₂或NaOH。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤（5）所用的乙酸乙酯为分析纯。