CN1483826A - 酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，是用酶水解大豆异黄酮甙糖基，制备大豆异黄酮甙元。包括如下步骤：取能水解大豆异黄酮甙糖基的酶；将酶、大豆异黄酮甙及缓冲液混合反应1－40小时，反应条件为温度4－75℃、pH值3－9；提取大豆异黄酮甙元。克服了现有技术(酸碱水解法)所存在的对甙元破坏性大，污染大，目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，又助于充分水解大豆异黄酮甙甙糖基，更加提高了大豆异黄酮甙元的转化率。不仅可用酶水解单体甙——大豆甙、金雀异黄甙、黄豆甙，变成相应的甙元；也可以用酶水解大豆甙、金雀异黄甙、黄豆甙等混合甙变成大豆素、大豆异黄酮、黄豆素等混合甙元，产品可当作医药和保健品原料。

Description

酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备异黄酮甙元的方法，尤其是一种用酶水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法。
背景技术：
大豆异黄酮在大豆及大豆子叶中含量较高，主要含有三种甙元(大豆素甙元、大豆异黄酮甙元及黄豆素甙元)，统称为大豆异黄酮甙元；还含有三种甙(大豆甙、金雀异黄甙及黄豆甙)，统称为大豆异黄酮甙。其化学结构分别如下：
大豆素(Daidzein)                       大豆异黄酮(Genistein)                  黄豆素(Glycitein)
大豆甙(Daidzin)                                            金雀异黄甙(Genistin)
Figure A0313363700032
黄豆甙(Glycitin)
大豆异黄酮是植物雌激素，可促进性激素、生长因子的分泌，具有改善妇女绝经期综合症、预防骨质疏松和癌症等活性。大豆异黄酮甙元的生理活性远高于大豆异黄酮甙，但是大豆异黄酮中含量较高的却是金雀异黄甙(Genistin)和大豆甙，甙元的含量很低，只有总甙的2-3％。为了得到活性高的大豆异黄酮甙元，曾报道过酸碱水解法(需人生主编，天然物化学，科学出版社，1996，p603-604)，但是对大豆异黄酮甙元破环大，污染也较严重。
发明内容：
本发明为了解决现有技术所存在的技术问题，提供一种酶法水解大豆异黄酮甙的糖基制备其甙元的方法，污染小、目的性强、转化率高。
本发明的技术解决方案是：一种酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，是用酶水解大豆异黄酮甙糖基，制备大豆异黄酮甙元。
包括如下步骤：
a.取能水解大豆异黄酮甙糖基的酶；
b.将酶、大豆异黄酮甙及缓冲液混合反应1-40小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9；
C.提取大豆异黄酮甙元。
所述的a步骤可由微生物发酵制备。
所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液中加入硫酸铵或乙醇提取酶。
所述的微生物为细菌、霉菌、酵母菌、担子菌。
所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。
所述的b步骤的大豆异黄酮甙浓度为总反应物体积的0.1-10％。
所述的大豆异黄酮甙为大豆甙、金雀异黄甙及黄豆甙单体或大豆甙、金雀异黄甙及黄豆甙的混合体。
所述的缓冲液为醋酸或磷酸。
所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。
本发明同现有技术相比，最大的特点是用酶水解大豆异黄酮甙糖基，制备大豆异黄酮甙元。不仅可用酶水解单体甙——大豆甙、金雀异黄甙、黄豆甙，变成相应的甙元；也可以用酶水解大豆甙、金雀异黄甙、黄豆甙等混合甙变成大豆素、大豆异黄酮、黄豆素等混合甙元，克服了现有技术(酸碱水解法)所存在的对甙元破坏性大，污染大，目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解大豆异黄酮甙糖基，更加提高了大豆异黄酮甙元的转化率。大豆异黄酮甙元可为作医药和保健品原料。
具体实施方式：
实施例1：
a.以高温好氧菌Clostridium thermocopriea(文献1)在含3％玉米粉、1％产酶诱导物——大豆浸出物(干物)培养基中，在温度60℃条件下振荡培养30-60小时，离心除菌，往上清液(含酶混合液)中加入65％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，用0.02M、pH5醋酸缓冲液透析，离心除渣，冻干，得到大豆异黄酮甙酶。
b.将2克大豆异黄酮甙酶、30克金雀异黄甙(Genistin)、1500毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)和150毫升乙醇混合均匀，使金雀异黄甙占总反应体积的0.1-10％，在温度75℃条件下搅拌反应1小时。
c.反应後加入6000毫升乙醇，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到24克甙元粗品，用薄层层析法(文献2)检测结果80％以上的甙转化成大豆异黄酮(Genistein)甙元。
用上述b步骤方法处理大豆甙和黄豆甙(Glycitin)，可得到同样的结果。上述酶也可处理大豆异黄酮甙混合体，80-90％变成大豆异黄酮(Genistein)甙元。
上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献3)分离提纯大豆异黄酮酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量(文献4)，酶的分子量为4万。
实施例2：
a.以黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含4％麦芽浸出物、1％产酶诱导物——大豆浸出物的培养基中，在温度28-30℃条件下搅拌通风培养50-100小时，离心除菌、用60-75％饱和度的硫酸铵在上清液(含酶混合液)中沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的磷酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为酶液。
b.将4克大豆金雀异黄甙(Genistin)、100毫升磷酸缓冲液(0.02M，pH5.0)和50毫升上述酶液混合，使金雀异黄甙占总反应体积的0.1-10％，在温度4℃条件下反应40小时。
c.加入1/3总反应体积的正丁醇萃取三次，减压蒸干，得到甙元粗品。用硅胶柱分离方法(文献3)得到1.4克的纯大豆异黄酮甙元。
上述酶处理大豆甙和黄豆甙(Glycitin)，得到同样的结果。
上述酶处理大豆异黄酮甙混合体，80-90％变成大豆异黄酮(Genistein)甙元。
上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献3)分离提纯大豆异黄酮甙酶蛋白，用SDS电泳方法(文献4)测定分子量，酶的分子量为3.5万。
实施例3：
a.以米曲霉菌(Aspegillus oryzae)在含5％麦麸浸出物、0.2％产酶诱导物——大豆异黄酮或者芦丁，或者1％其黄酮类来源植物的浸出物的培养基中，在温度28-30℃条件下搅拌通风培养50-100小时，离心除菌得含酶混合液，加入乙醇至70％沉淀酶蛋白，收集蛋白，冻干，即为酶。
b.同实施例1、实施例2方法处理三种大豆异黄酮甙或混合甙，80％以上转化成甙元。
上述酶经DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献3)分离提纯大豆异黄酮酶蛋白，用SDS电泳方法(文献4)测定分子量，酶的分子量为5.3万。
实施例4：
a.假丝酵母在含10％产酶诱导物——脱脂大豆粉的麦麸培养基(干物1000克)上接种，分装在茄子瓶中30℃固体培养3～6天，收集培养物，在培养基干物中加入6000毫升的生理盐水，浸泡一小时，离心取上清(含酶混合液)，加入饱和度60～75％的硫酸铵，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析除去硫酸铵，离心除渣，即得1000毫升左右的酶液。
b.将上述酶液按实施例1的方法处理大豆异黄酮、提纯和检测酶反应产物的结果：大豆异黄酮转化成甙元，酶的分子量为5万。
实施例5：
a.以大肥菇菌(Agaricus bitorguis)培养在脱脂大豆粉和稻皮各10％的麦麸培养基上，在温度25℃条件下培养6-8天，按实施例4的方法提取酶液，
b.按实施例2、3的方法处理大豆异黄酮、分离提纯和检测酶反应产物，50％
c.的大豆异黄酮转化成甙元。
实施例中所述文献为：
1.Fengxie Jin et al.：J.Int.Syst.Bact，1988，38，279-281.
2.崔洪斌主编，大豆生物活性物质的开发与应用，中国轻工业出版社，2001，p39-40。
3.Hongshan Yu，et al(鱼红闪等)：Chem.Pharm.Bull.，50(2)，175-178.
4.张龙翔等：升华实验方法和技术，高等教育出版社，1997，p100-111。

Claims (10)

1.一种酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：用酶水解大豆异黄酮甙糖基，制备大豆异黄酮甙元。
2.根据权利要求1所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a.取能水解大豆异黄酮甙糖基的酶；
b.将酶、大豆异黄酮甙及缓冲液混合反应1-40小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9；
C.提取大豆异黄酮甙元。
3.根据权利要求2所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的a步骤可由微生物发酵制备。
4.根据权利要求3所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液中加入硫酸铵或乙醇提取酶。
5.根据权利要求3或4所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的微生物为细菌、霉菌、酵母菌、担子菌。
6.根据权利要求3所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。
7.根据权利要求2所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的b步骤的大豆异黄酮甙浓度为总反应物体积的0.1-10％。
8.根据权利要求2或7所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的大豆异黄酮甙为大豆甙、金雀异黄甙及黄豆甙单体或大豆甙、金雀异黄甙及黄豆甙的混合体。
9.根据权利要求2所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的缓冲液为醋酸或磷酸。
10.根据权利要求2所述的酶法水解大豆异黄酮甙糖基制备其甙元的方法，其特征在于：所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。
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Denomination of invention: Method for preparing aglycon of soybean isoflavone glycoside base by enzymatic method hydrolyzing soybean

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Open date: 20040324

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