KR102418705B1

KR102418705B1 - 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 방법

Info

Publication number: KR102418705B1
Application number: KR1020220052835A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 김대욱; 신경철; 나채선; 오유진
Original assignee: 한국수목원정원관리원
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2022-07-07

Abstract

본 발명은 Thermoproteus uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제로 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물에 포함된 다이드진과 제니스틴을 다이드제인과 제니스테인로 변환 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제 효소는 지금까지 보고된 효소 중 다이드제인과 제니스테인 모두에서 가장 높은 생산성을 나타낸다.

Description

이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 방법{Method for biotransformation of isoflavone aglycone from isoflavone glycoside}

본 발명은 Thermoproteus uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제로 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물에 포함된 다이드진과 제니스틴을 다이드제인과 제니스테인로 변환 생산하는 방법에 관한 것이다.

콩과 식물에서 가장 풍부한 식물 화학 물질 중 하나인 이소플라본은 암 [비특허1], 심혈관 질환 [비특허2], 골다공증 [비특허3], 갱년기 증상 [비특허4]에 대한 활성으로 주목을 받아았다. 이소플라본의 생물학적 활성은 탈당화 되어 형성된 아글리콘(aglycones)에 의해 증진되는데, 아글리콘은 낮은 분자량과 더 나은 소수성으로 인해 장에 더 빨리 흡수된다.[비특허5,6].

그러나 콩과 식물에는 이소플라본 아글리콘이 저농도로 존재한다. 따라서 많은 연구가 다이드진, 제니스틴, 글리시틴과 같은 이소플라본 배당체의 해당 이소플라본 아글리콘으로서, 다이드제인, 제니스테인, 글리시테인으로의 생물변환에 초점을 맞추고 있다.

이들 이소플라본 아글리콘은 바실리우스 서브틸리스, 엔테로코커스 듀란스, 락토바실러스 파라플란타룸, 리조푸스 올리고스포루스, 스트렙토코커스 살리바리우스, 와이셀라 콘푸사(Bacillus subtilis, Enterococcus durans, Lactobacillus paraplantarum, Rhizopus oligosporus, Streptococcus salivarius, and Weissella confusa)를 포함한 미생물의 가수분해 활성을 통해 얻어져 왔다.[비특허7-9] 그러나 미생물 가수분해는 낮은 생산성, 낮은 수율, 부산물 생산 등 몇 가지 단점이 있다.

따라서 효소가 높은 특이성, 생산성 및 수율 때문에 이소플라본 글리코시드의 가수분해에 일반적으로 사용되어 왔다. 다양한 미생물 및 식물 유래 글리코시다아제가 사용되었지만, Dictyoglomus turgidum [비특허10], Microbulbifer thermotolarans [비특허11], Neosartorya fischeri [비특허12], Pyroccus fuiosus [비특허13], Sulfolobomy talarficus [비특허14] 및 Thermotoga maritima [비특허17]를 포함한 호열성 미생물로부터 유래된 내열성 글리코시다아제가 이소플라본 배당체에 대해 높은 가수분해 활성을 보였다.

한편, 극호열성 Thermoproteus uzoniensis는 Uzon 칼데라(SW of Kamchatka pen.)의 온천과 토양에서 발견되는 막대 모양의 고세균이다.[비특허18] 이 균주로부터 유래된 글리코시다아제는 이전 연구에서 진세노사이드(인삼 사포닌)에 대한 높은 가수분해 활성을 나타내었기 때문에 이소플라본 배당체의 가수분해에 적용할 수 있는 강력한 후보이다.[비특허19] 그러나 이 효소는 아직 특정화되지 않았다.

한편, 콩과의 대표적인 식물인 대두(Glycine max (L.) Merr.)에는 이소플라본이 풍부하게 함유되어 있다. 그러나 대두의 총 이소플라본 함량은 재배 국가 또는 지역에 따라 상당한 차이가 있는 것으로 알려져 있다.[비특허20]. 이에 비해, 재배되는 대두의 조상인 야생대두(Glycine soja Siebold & Zucc.)는 재배 과정에서 사라진 높은 수준의 유전적 다양성을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. [비특허21]. 따라서 기존에 의도하지 않은 선별로 인해 대두의 이소플라본 함량이 야생대두에 비해 높지 않다고 제시되었고[비특허22], 국내산 야생대두가 이소플라본의 높은 함량을 보유하고 있다고 보고되었다. [비특허23,24].

한편, 글로벌 CWR(Crop Wild Relatives) 프로젝트는 농업을 기후 변화에 적응시키는 것을 목표로 2011년에 시작되었다. 혹독한 환경에서 살아남기 위해 진화한 작물의 야생 동류는 종종 유용한 특성을 포함하고 있다. 그러한 특성은 기후 변화에 더 탄력적인 작물을 개발하는 데 도움이 될 수 있다. 대두는 이 프로젝트의 주요 대상종 중 하나이며, 야생 대두는 대두의 중요한 CWR이다. 따라서 대두 작물의 세계적 중요성을 고려할 때, 야생 대두에 있는 이소플라본의 아글리콘으로의 효소적 전환은 매우 중요하다.

대한민국 공개특허공보 10-2021-0075690 (2021.06.23 공개) 대한민국 등록특허공보 10-1602630 (2016.03.07 등록)

해결과제는, 이소플라본 배당체를 해당 이소플라본 아글리콘으로 변환시키는 방법 및 제제를 제공하는 것이다. 또한, 야생 대두에 포함된 이소플라본 배당체를 해당 이소플라본 아글리콘으로 변환시키는 방법 및 제제를 제공하는 것이다. 또한, Thermoproteus uzoniensis 균주에서 β-갈락토시다아제를 제조하는 방법 및 제제를 제공하는 것이다. 또한, Thermoproteus uzoniensis 균주 유래 β-갈락토시다아제로 이소플라본 배당체를 해당 이소플라본 아글리콘으로 변환시키는 방법 및 제제를 제공하는 것이다. 또한, Thermoproteus uzoniensis 균주 유래 β-갈락토시다아제로 야생 대두의 이소플라본 배당체를 해당 이소플라본 아글리콘으로 변환시키는 방법및 제제를 제공하는 것이다. 또한, Thermoproteus uzoniensis 균주 유래 β-갈락토시다아제로 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물에 포함된 다이드진과 제니스틴을 다이드제인과 제니스테인로 변환 생산하는 방법 및 제제를 제공하는 것이다.

해결수단은,

Thermoproteus uzoniensis 로부터 β-갈락토시다아제를 제조하는 단계; 및

상기 β-갈락토시다아제를 이소플라본 배당체와 반응시켜 이소플라본 아글리콘으로 생물전환하는 단계;를 포함하는, 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 방법이다.

상기에서, β-갈락토시다아제는, 113kDa의 동종 이량체로서,

pH 5.0 및 90℃에서 46시간의 반감기와 1,103 μmol/min/mg의 최대 특이 활성을 보유하는 것을 특징으로 한다.

해결수단은,

Thermoproteus uzoniensis 유래의 β-갈락토시다아제를 포함하는, 이소플라본 배당체의 가수분해 제제이다.

상기에서, β-갈락토시다아제는, 113kDa의 동종 이량체로서,

해결수단은,

상기 β-갈락토시다아제를 다이드진 및 제니스틴과 반응시켜, 상기 다이드진 및 제니스틴을 다이드제인 및 제니스테인으로 각각 생물변환하는 단계;를 포함하는, 다이드진 및 제니스틴을 다이드제인 및 제니스테인으로 변환하는 방법이다.

상기에서, 상기 생물변환하는 단계는,

pH 5.0, 90℃에서, 2mM 기질 및 최소 0.2mg/mL β-갈락토시다아제 조건에서 수행하는 단계인 것을 특징으로 한다.

해결수단은,

상기 β-갈락토시다아제를 야생 대두(Glycine soja) 추출물과 반응시켜, 상기 야생 대두 추출물에 포함된 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 단계;를 포함하는, 야생 대두의 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 방법이다.

상기에서, 생물변환하는 단계는,

20%(w/v) 종자 또는 뿌리 추출물 및 최소 0.4 mg/mL β-갈락토시다아제를 사용하여 pH 5.0 및 90℃ 조건에서 수행하는 단계인 것을 특징으로 한다.

해결수단은,

Thermoproteus uzoniensis 유래의 β-갈락토시다아제를 포함하는, 이소플라본 배당체의 생물변환 제제이다.

상기에서, β-갈락토시다아제는, 113kDa의 동종 이량체로서,

본 발명에 따른, T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 특이 활성(specificity)은 daidzin과 genistin에 대해서는 지금까지 최고의 활성을 갖고 있던 P. furiosus 유래 β-글루코시다아에 비해 각각 1.69배, 1.23배 높은 효과를 보유하고 있다.

또한, A. oryzae 유래 β-글루코시다아제를 이용하여 생산된 daidzein과 genistein의 수준은, 한국산 야생 대두의 뿌리 추출물에 대하여 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제를 이용하여 생산한 daidzein과 genistein의 수준보다 각각 19배 및 42배 낮은 수준을 보인다.

본 발명에 따른 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제 효소는 지금까지 보고된 효소 중 다이드제인과 제니스테인 모두에서 가장 높은 생산성을 나타낸다.

도 1 내지 도 9는 본 발명의 실험예에 따른 결과를 설명하기 위한 그래프 또는 표를 도시한 도면이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실험예, 실시예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명에서, 발명자들은 T. uzoniensis에서 열안정성 β-갈락토시다아제를 복제하고, 분자량, pH, 온도, 열안정성 및 기질 특이성과 같은 특성을 특성화했다. 이 효소는 한국산 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물에서 다이드진과 제니스틴을 다이드제인과 제니스테인로 변환하여 생산하는 데 사용되었다.

실험예 1. 실험재료 및 실험방법

1. 실험재료

아릴-글리코시드, p-니트로페닐(pNP)-β-D-글루코피라노시드, pNP-β-D-갈락토피라노시드, pNP-β-D-자일로피라노시드, pNP-α-L-아라비노피라노시드, pNP-α-L-람노피라노시드, oNP-β-D-글루코피라노시드, 및 oNP-β-D-갈락토피라노시드; 및 daidzin, daidzein, genistin, genistein, 글리시틴 및 글리시테인을 포함한 이소플라본은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다.

백두대간 야생식물종자은행에서 한국산 야생 대두을 공급받았다. 유전자 클로닝에 사용된 모든 효소는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA) 또는 New England Biolabs(Hertfordshire, UK)에서 구입했다.

2. 박테리아 균주, 플라스미드 및 유전자 클로닝

β-갈락토시다아제(galactosidase) 유전자(GenBank accession no. AEA12778) 클로닝을 위한 DNA 주형 및 발현 벡터와 숙주 균주는, 각각 T. uzoniensis DSM 5263(DSMZ, Braunschweig, Germany), pET-29b(+) 벡터(Novagen, Darmstadt, Germany) ) 및 대장균 BL21(DE3) 균주이다.

β-갈락토시다아제 유전자는 1단계 등온 DNA 조립 방법을 사용하여 클로닝되었다[비특허25]. DNA 단편의 증폭을 위해 다음 프라이머가 사용되었다:

β-갈락토시다아제 유전자에 대한 정방향 프라이머, AGC AGC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGA CAT ATG CGG AAG TTC CCA AGC GGA TTC AGA TGG;

β-갈락토시다아제 유전자에 대한 역방향 프라이머, ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TTA AAG CGA TCT GAG GCC CCT CAA GAC CTC;

벡터용 정방향 프라이머, GAG GTC TTG AGG GGC CTC AGA TCG CTT TAA CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA GAT; 및

벡터용 역방향 프라이머, CCA TCT GAA TCC GCT TGG GAA CTT CCG CAT ATG TCC CTG AAA ATA CAG GTT TTC GCT GCT.

β-갈락토시다아제 유전자 및 벡터의 DNA 단편은 PCR에 의해 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 합성되었다. 합성된 DNA 단편을 Master Mix for Gibson Assembly(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 결찰하고 결찰된(ligated) DNA를 E. coli BL21로 형질전환시켰다.

3. β-갈락토시다아제의 제조

T. uzoniensis 유래 β-galactosidase를 함유한 대장균 세포를 37 ℃에서 50 μg/mL 카나마이신이 함유된 Luria-Bertani 배지 500 mL를 함유한 2 L 플라스크에서 배양하였다. 200 rpm으로 쉐이킹하였다. 재조합 대장균 세포 600nm의 광학밀도가 0.6에 이르렀을 때, 100mM IPTG를 첨가하여 T. uzoniensis의 β-galactosidase 발현을 유도하며, 150rpm으로 흔들면서 16°C에서 14시간 동안 추가 배양하였다.

세포를 10,000 x g에서 원심분리하여 수확 후, 1 mg/mL 라이소자임을 함유하는 Ni-NTA 용해 완충액에 현탁하고, 얼음 위에서 20분 동안 초음파 처리하여 파쇄했다. 세포 파편과 파괴되지 않은 세포를 4 ℃에서 13,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 제거하고, 상층액을 조 추출물(crude extract)로 사용했다.

조(crude) 효소 용액을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)의 His-Trap HP 친화성 컬럼(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에 적용했다. 결합된 단백질은 후속적으로 1mL/분의 유속으로 250mM 이미다졸을 함유하는 20mM 포스페이트 완충액으로 용리되었다. 가수분해 활성이 있는 수집된 분획을 4℃에서 12시간 동안 pH 5.0에서 50mM 시트레이트/인산염 완충액(CPB)에 대해 투석했다. 생성된 용액을 정제된 β갈락토시다아제로 사용하였다.

4. SDS-PAGE 및 겔 여과 크로마토그래피

β-갈락토시다아제 소단위체의 분자 질량은 미리 염색된 단백질 사다리(MBI Fermentas, Hanover, MD)를 레퍼런스로 이용하여 SDS-PAGE에 의해 조사하였다. 세포 잔해, 조추출물, 정제효소를 1 mg/mL 농도로 사용하여 정제 정도를 평가하였다. 모든 단백질 밴드는 시각화를 위해 Coomassie blue 염료로 염색되었다. HiPrepTM 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 재조합 β-갈락토시다아제의 총 분자량을 결정했다. 재조합 β-갈락토시다아제를 컬럼을 통해 옮기고, 효소 결합 컬럼을 0.5mL/min의 유속 상태에서 150mM NaCl이 포함된 50mM CPB(pH 5.0)로 용출시켰다.

T. uzoniensis로부터 유래된 β-갈락토시다아제의 머무름 시간(migration length)은 ferritin(440 kDa), catalase(232 kDa), aldolase(158 kDa), conalbumin(75kDa) 및 ovalbumin(43kDa) 같은 참조 단백질들을 이용하여 용출 프로세스동안 측정되었다. T. uzoniensis에서 유래한 β-갈락토시다아제의 총 분자량은 머무름 시간(이동 길이)과 참조 단백질의 머무름 시간을 비교하여 계산했다.

5. 야생 대두 추출물의 제조

국립백두대간수목원에서 재배된 한국산 야생 대두를 종자, 줄기 및 뿌리 추출물을 제조하는 데 사용했다. 한국산 야생 대두의 각 부분을 전기 그라인더를 사용하여 분쇄했다. 40℃에서 24시간 동안 메탄올 1L를 사용하여 미세 분말(100g)을 추출하였다.

각 추출물을 여과하고 회전 증발기를 이용하여 메탄올을 완전히 제거한 후 잔류물을 증류수 2L에 녹였다. 70 ℃ 이상의 온도에서 T. uzoniensis의 β-갈락토시다아제와 유리당의 Maillard 반응을 방지하기 위해, Diaion HP20 수지(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국)로 채워진 컬럼을 이용하여 추출물의 유리당을 제거하였다.

각 추출물을 컬럼에 로딩하고, 이소플라본이 흡착된 레진을 증류수로 세척하였다. 그런 다음 흡착된 이소플라본을 0.5mL/분의 유속으로 2L의 메탄올로 용출시켰다. 용리액 중 메탄올을 완전히 증발시키고 잔류물을 증류수 1L에 재용해하였다. 생성된 추출물은 이소플라본 함량 또는 다이드제인 및 제니스테인 생성 분석에 사용되었다.

6. 가수분해 활성

달리 언급되지 않는 한, 효소 반응은 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제 0.005 mg/mL 및 1 mM pNP-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside)로 10분 동안 수행하였다.

T. uzoniensis 유래β-갈락토시다아제의 가수분해 활성에 대한 pH와 온도의 영향을 평가하기 위해, pH는 70 ℃에서 50mM CPB를 사용하여 4.0에서 7.0까지 변화시켰고, 온도는 pH 5.0에서 65 ℃에서 95 ℃까지 변화시켰다. T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 안정성에 대한 온도의 영향은 상이한 온도(75, 80, 85, 90 및 95 ℃)에서 50mM CPB(pH 5.0)에서 효소 용액을 인큐베이션함으로써 인큐베이션 시간의 함수로 모니터링되었다. 인큐베이션 후, 효소 용액을 1mM pNP-β-D-글루코피라노시드를 함유하는 50mM CPB(pH 5.0)에서 90℃에서 10분 동안 분석하였다.

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 특이적 활성(specific activity)은, p-니트로페닐(pNP)-β-D-글루코피라노시드, pNP-β-D-갈락토피라노시드, pNP-β-D-자일로피라노시드, pNP-α-L-아라비노피라노시드, pNP-α-L-람노피라노시드, oNP-β-D-글루코피라노시드, 및 oNP-β-D-갈락토피라노시드를 포함하는 아릴-글리코시드와 daidzin, genistin 및 글리시틴을 포함하는 이소플라본들을 이용하여 결정되었다. 반응은 T. uzoniensis의 유래 β-갈락토시다아제 0.005-0.05mg/mL 와 1mM aryl-glycoside 또는 0.2mM isoflavone을 함유하는 50mM CPB(pH 5.0)에서 90 ℃ 에서 10분 동안 수행되었다.

7. 이소플라본의 생물변환(biotransformation)

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제에 의한 isoflavones의 생체변형에 대한 시간 경과에 따른 반응은 시약 등급 daidzin과 genistin, 그리고 한국산 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물을 기질로 사용하여 평가되었다.

시약 등급 daidzin 또는 genistin의 daidzein 또는 genistein으로의 생물학적 형질 변환(생물변환 또는 생체변형)은 각각 0.2mg/mL의 효소 및 3mM 이소플라본을 포함하는 50mM CPB(pH 5.0)에서 90 ℃ 에서 100분 또는 90분 동안 수행되었다.

다이드제인 및 제니스테인은 한국산 야생 대두의 종자 또는 뿌리 추출물에포함된 다이드진 및 제니스틴으로부터 각각 생성되었는데, 0.4 mg/mL의 효소와 20%(w/v) 종자 또는 뿌리 추출물을 포함하는 50 mM CPB(pH 5.0)에서 각각 90 ℃에서 100분 또는 200분 동안 생성되었다.

8. HPLC 분석

이소플라본은 254 nm의 UV 검출기와 4.6 × 150 mm 크기의 C18 컬럼(YMC, Kyoto, Japan)이 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템(Agilent 1100Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 분석되었다. 컬럼을 1.0mL/min의 유속으로 35°C에서 40분 동안 용매 A(물 중 3% 아세트산)/용매 B(아세토니트릴 중 3% 아세트산)(v/v ): 5분 동안 90/10에서 85/15; 5분 동안 85/15에서 80/20; 5분 동안 80/20에서 75/25; 5분 동안 75/25에서 70/30; 5분 동안 70/30에서 65/35; 5분 동안 65/35에서 10/90; 10분 동안 10/90에서 90/10 용출하였다.

다이드진, 다이드제인, 제니스틴, 제니스테인, 글리시틴, 글리시테인의 머무름 시간은 각각 6.2, 14.0, 9.3, 18.5, 7.5, 15.8분이었다. 반응 시료의 이소플라본은 표준 이소플라본의 머무름 시간과 동일한 것으로 확인되었다.

국내산 야생 대두 추출물 및 반응 시료의 이소플라본 정량 분석은 이소플라본 표준물질의 농도에 따른 피크 면적의 선형 검량선을 사용하여 수행되었다.

실험예 2. 실험결과

1. T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 클로닝, 정제 및 분자량 측정

GenBank(수탁 번호, AEA12778; 유전자 이름, TUZN_RS06265)에서 동일한 서열을 갖는 T. uzoniensis DSM 5263의 배당체 가수분해효소 패밀리 1(GH1) 단백질을 인코딩하는 1482 bp 유전자는 E. coli BL21(DE3)에서 용매성 형태로(soluble form) 클로닝 및 발현되었다.

발현된 효소의 아미노산 서열은 Sulfolobus shibatae(AAA79030)[비특허26] , S. solfataricus (AAA72843)[비특허27], Sulfolobus acidocaldarius (AAY81155) [비특허28] 및 P. furiosus (AAL80197)[비특허29] 유래의 GH1 글리코시다아제의 서열과 62.1%, 61.9%, 56.9% 및 55.2%의 서열 동일성을 나타내었다.

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제는 HisTrap 친화성 크로마토그래피를 사용하여 10.5배 정제, 21%의 최종 수율 및 1,103μmol/min/mg의 pNP-β-D-갈락토피라노시드에 대한 특이적 활성의 결과를 갖는 가용성 단백질로 정제되었다.

정제된 효소의 분자량은 SDS-PAGE에서 약 57kDa였으며(도 1 좌측), 이는 6개의 히스티딘 잔기와 결합된 493개 아미노산을 기준으로 계산된 값 57,131 Da와 일치했다. 천연 효소는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 113 kDa의 분자량을 갖는 동종이량체(homodimer)로 결정되었다(도 1 우측) (도 1. Molecular mass determination of β-galactosidase from T. uzoniensis. (좌측) SDS-PAGE analysis. Lane 1, molecular weight size marker; lane 2, cell debris; lane 3, crude extract; and lane 4, purified enzyme. (우측) Determination of native molecular mass using gel-filtration chromatography. The reference proteins ferritin (440 kDa), catalase (232 kDa), aldolase (158 kDa), conalbumin (75 kDa), and ovalbumin (43 kDa), and purified β-galactosidase from T. uzoniensis are represented by filled circles and open circle, respectively.)

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제에 대한 높은 서열 동일성(>50%)을 갖는 S. shibatae, S. solfataricus, S. acidocaldarius 및 P. furiosus 유래의 GH1 글리코시다아제의 결합형태는 사량체인 반면, 낮은 서열 동일성(<30) %)을 갖는 Caldicellulosiruptor owensensis [비특허30], Caldicellulosiruptor saccharolyticus [비특허31], Thermotoga petrophila [비특허32]는 이량체로 존재한다.

이러한 결과는 GH1 패밀리 내에서 서열 동일성 수준이 연관 형태를 결정하는 데 중요하지 않음을 나타낸다.

2. T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 가수분해 활성에 대한 pH 및 온도의 영향

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 가수분해 활성은 pH 4.0~7.0 범위에서 조사되었으며, 최대 활성은 pH 5.0에서 관찰되었다(도 2 좌측). pH 4.5 및 6.0에서 가수분해 활성은 최대값의 약 70%였다.

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다제의 가수분해 활성에 대한 온도 영향을 조사하기 위해 온도를 pH 5.0에서 65~95°C로 변화시켰으며 활성은 90°C에서 최대였다(도 2 우측)

M. thermotolerans [비특허11], T. leycettanus [비특허15], N. fischeri [비특허12], D. turgidum [비특허10], T. pendens [비특허16], S. solfataricus [비특허14] 및 P. furiosus [비특허13] 유래 호열성 β-글루코시다아제들이 이소플라본 배당체의 가수분해에 적용되었으며, 50, 65, 80, 85, 90, 90 및 95 °C 에서 각각 최대 활성을 나타냈다.

(도 2. Effects of pH and temperature on the activity of β-galactosidase from T. uzoniensis. (좌측) Effect of pH. The reactions were performed at the indicated pH values with 1 mM pNP-β-D-glucopyranoside and 0.005 mg/mL of enzyme at 70℃ for 10 min. (우측) Effect of temperature. The reactions were performed at different temperatures in 50 mM CPB (pH 5.0) containing 1 mM pNP-β-D-glucopyranoside and 0.005 mg/mL of enzyme for 10 min. Data represent the means of three separate experiments, and error bars represent the standard deviation.)

효소의 열적 안정성이 75-95 °C의 온도 범위에서 조사되었다. 열 불활성화에 대한 1차 동역학이 조사되었고, T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다제의 반감기는 75, 80, 85, 90 및 95°C에서 각각 235, 122, 68, 46 및 26시간이었다. (도 3).

이소플라본 배당체(글리코시드)의 가수분해에 적용되는 효소 중 P. furiosus[비특허13] 및 S. solfataricus [비특허14] 유래의 β-글루코시다아제들이 각각, 75, 80, 85, 90, 95 °C에서 각각 476, 307, 181, 96, 59 시간과 80, 51, 31, 18, 10 시간의 반감기를 보여 가장 높은 열적 안정성을 보였다.

90 °C에서 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 반감기는 P. furiosus와 S. solfataricus의 β-글루코시다아제보다 각각 2.1배 낮고 2.6배 높았다.

(도 3. Thermal inactivation of β-galactosidase from T. uzoniensis. The enzyme was incubated at 75 (closed triangle), 80 (open square), 85 (closed square), 90 (open circle), and 95 ℃ (closed circle) in 50 mM CPB (pH 5.0) for different time periods and the residual activity was determined. Data represent the means of three separate experiments, and error bars represent the standard deviation.)

3. 아릴 배당체 및 이소플라본 배당체에 대한 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 기질 특이성

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 특이 활성(specific activity)은 aryl glycoside와 isoflavone glycoside를 이용하여 조사하였다.

효소는 아릴-글리코시드를 기질로 하여 oNP-β-D-갈락토피라노시드 > pNP-β-D-갈락토피라노시드 > pNP-β-D-글루코피라노시드 > oNP-β-D-글루코피라노시드 > pNP -β-D-자일로피라노사이드 순서로 특이적 활성을 나타냈다. (도 4. Substrate specificity of β-galactosidase from T. uzoniensis^a). 그러나, pNP-α-L-arabinopyranoside 및 pNP-α-L-rhamnopyranoside에 대해서는 활성이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 이 효소가 β-1,4결합에 대한 것보다 β-1,2결합에 대한 특이성 활성이 더 높은 β-갈락토시다아제임을 보여준다.

이소플라본 배당체에 대한 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제의 기질 특이성은 genistin > daidzin > ononin > glycitin의 순서를 따랐다. (도 4)

Dalbergia cohinchinensis [비특허33], D. turgidum [비특허10], P. furiosus [비특허13], Paecilomyces thermophila [비특허34], T. leycettanus [비특허15], T. maritima [비특허17] 유래 대부분의 다른 글루코시다아제들도, 기질인 daidzin에 비해 genistin에 대해 더 높은 비활성을 보였다. 반대로, N. fischeri[비특허12]의 β-글루코시다아제의 기질 특이성은 genistin보다 daidzin에서 더 높았다.

이소플라본 배당체의 가수분해에 사용된 효소 중 N. fischeri 유래 β-글루코시다아제가 pNP-β-D-글루코피라노시드에 대해 가장 높은 특이 활성(2189 μmol/min/mg)을 나타냈다[비특허12]. 그 다음은 특이 활성이 912 μmol/min/mg인 P. furiosus의 β-글루코시다아제였다[비특허13]. 이들 특이 활성은 각각 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제에 비하여 2.14배 높고, 1.12배 낮았다.

그럼에도 불구하고 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제 특이 활성은 daidzin과 genistin에 대해서는 지금까지 최고의 활성을 갖고 있던 P. furiosus 유래 β-글루코시다아제[비특허 13]에 비해 각각 1.69배, 1.23배 높았다. 이러한 결과는 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제가 isoflavone glycoside의 가수분해에 적합한 효소임을 나타낸다.

4. T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제에 의한 시약 등급의 이소플라본 배당체의 이소플라본 아글리콘으로의 전환

대두에 많이 발현되는 isoflavone glycosides인 daidzin 및 genistin의 daidzein 및 genistein으로의 전환을 위한 시간 경과 반응은 pH 5.0, 90°C, 2mM 기질 및 0.2mg/mL T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제 조건에서 수행되었다.

2mM 시약 등급 daidzin 또는 genistin에 대해 0.05에서 1mg/mL로 효소 농도를 60분 동안 변화시켜 전환을 조사했다. daidzein 또는 genistein의 생산은 효소 농도가 0.2mg/mL까지 증가함에 따라 증가하고 그 농도 이상에서는 정체기에 도달했다.(데이터는 표시되지 않음). 따라서 2mM 시약 등급 daidzin 또는 genistin에 대한 최적의 효소 농도는 0.2mg/mL였다.

효소는 각각 90분 및 80분 이내에 2mM 시약 등급 daidzin 및 genistin을 daidzein 및 genistein으로 완전히 가수분해했다(도 5 좌측 및 우측).daidzin 및 genistin의 daidzein 및 genistein으로의 전환에 대한 HPLC 프로필은 도 6에 나와있다.

daidzin과 genistin의 생산성은 각각 1.33 및 1.50mM/h에 해당하여 P. furiosus 유래 β-글루코시다아제가 대두 가루 추출물로부터 이소플라본 아글리콘으로 전환시키는 생산성 [비특허 13] 보다 각각 3.1배, 2.5배 높았다.

따라서 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제를 한국산 야생 대두 추출물로부터 isoflavone aglycones를 생산하는 것에 추가로 적용하였다.

(도 5. Time-course reactions for the biotransformation of reagent grade daidzin and genistin into daidzein and genistein by β-galactosidase from T. Uzoniensis. (좌측) Biotransformation of daidzin (open circle) into daidzein (closed circle). (우측) Biotransformation of genistin (open square) into genistein (closed square). 도 6. HPLC profiles for the biotransformation of daidzin and genistin into daidzein and genistein. The reactions were performed at 90 ℃ in 50 mM CPB (pH 5.0) containing 2 mM isoflavone substrate and 0.2 mg/ml enzyme. Data represent the means of three separate experiments, and error bars represent the standard deviation.)

5. T. Uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제에 의한 한국산 야생 대두 종자 및 뿌리 추출물의 isoflavone glycosides로부터 isoflavone aglycones 생산

국내산 야생 대두의 종자, 줄기, 뿌리에서 이소플라본을 추출하여 이소플라본의 함량을 측정하였다(도 7. Isoflavone contents in 10% (w/v) seed, stem, and root extracts of Korean wild soybean ^a ). 다량의 daidzin(20,580 mg/g)과 genistin(3,600 mg/g)이 뿌리 및 종자 추출물에서 발견된 반면, 어떤 추출물에서도 글리시틴이 발견되지 않았다.

뿌리 추출물은 종자 추출물에 비해 이소플라본 배당체 함량이 1.7배 높았을 뿐만 아니라 daidzein 7,560mg/g, genistein 1,770mg/g 을 포함한 isoflavone aglycones 함량도 높았다. 이에 반해 줄기 추출물은 daidzin이 없는 isoflavone glycoside로 genistin만을 함유하였고, 그 양은 종자 추출물에 함유된 genistin의 약 16%에 불과하였다.

따라서 T. Uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제를 국내산 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물의 daidzin 및 genistin으로부터 daidzein 및 genistein 생산에 적용했다.

60분 또는 90분 동안 20%(w/v) 종자 또는 뿌리 추출물에 대해 효소 농도를 0.1에서 2 mg/mL로 변화시켜 생산을 조사했다. 그리고 생산된 다이드제인 또는 제니스테인 수율은 효소 농도가 0.4mg/mL까지 증가함에 따라 증가했고, 생산된 다이드제인 또는 제니스테인의 증가는 0.4mg/mL보다 높은 효소 농도에서 상당히 감소하였다.(데이터는 표시되지 않음) 따라서 20%(w/v) 종자 또는 뿌리 추출물에 대한 최적 효소 농도는 0.4 mg/mL였다.

추출물의 daidzin과 genistin으로부터 daidzein과 genistein의 생산을 위한 시간 경과 반응은 20%(w/v) 종자 또는 뿌리 추출물 및 0.4 mg/mL β-갈락토시다아제를 사용하여 pH 5.0 및 90°C에서 수행하였다.

20%(w/v)의 종자 및 뿌리 추출물은 기질로서 각각 6.62mM 및 11.56mM 이소플라본 배당체(2.77mM daidzin 및 3.85mM 제니스틴, 및 9.89mM daidzin 및 1.67mM 제니스틴)를 함유하고, 각각 0.53mM 및 6.08mM aglycones (0.26 mM daidzein 및 0.27 mM genistein, 및 5.95 mM daidzein 및 0.13 mM genistein) 함유하였다.

종자 추출물의 Daidzin 및 genistin은 각각 1.86 및 3.30mM/h의 생산성에 해당하는 80분 및 70분 이내에 daidzein 및 genistein으로 완전히 가수분해되었다.

Daidzein과 genistein은 뿌리 추출물의 daidzin과 genistin에서 각각 180분과 30분 후에 각각 3.30 및 3.36mM/h의 더 높은 생산성과 100%의 수율로 생산되었다(도 8).

(도 8. Time-course reactions for the production of daidzein (closed circle) and genistein (closed square) from daidzin (open circle) and genistin (open square), respectively, in the (좌측) seed and (우측) root extracts of Korean wild soybean by β-galactosidase from T. uzoniensis. The reactions were performed at 90℃ in 50 mM CPB (pH 5.0) containing 0.4 mg/ml enzyme and 20% (w/v) seed or root extracts of Korean wild soybean. Data represent the means of three separate experiments, and error bars represent the standard deviation.)

복합 기질로부터 글리코시다아제에 의한 다이드제인 및 제니스테인의 생산은 도 9에 요약되어 있다. (도 9. Production of daidzein and genistein from complex substrates by glycosidases)

생산되는 다이드제인 및 제니스테인의 최고 농도는 대두 가루 추출물과 함께 사용된 Aspergillus oryzae 유래 β-글루코시다제를 사용하여 각각 8.40 및 4.09 mM이었다.[비특허35]. 이 값은 국내산 야생 대두 뿌리 추출물과 종자 추출물에서 추출한 daidzein과 genistein에 비해 각각 1.18배 낮았고, 1.07배 높았다.

그러나 A. oryzae 유래 β-글루코시다아제를 이용하여 생산된 daidzein과 genistein의 수준은 한국산 야생 대두의 뿌리 추출물에 대하여 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제를 이용하여 생산한 daidzein과 genistein의 수준보다 각각 19배 및 42배 낮은 수준을 보였다.

대두 가루 추출물에 대하여 Gongronella sp. 유래 β-글루코시다아제를 사용하여 daidzein과 genistein에 대해 얻은 이전 최고 생산성은 1.50 및 1.23 mM/h였다 [비특허36]. 이들 값은 본 발명에서 국산 야생 대두의 뿌리 추출물을 사용하여 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제를 사용하여 얻은 값보다 각각 2.2배 및 2.7배 낮다.

T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제는 국내산 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물에 함유된 daidzin과 genistin을 daidzein과 genistein으로 완전 가수분해하여 생산성이 가장 높은 것으로 조사되었다.

따라서 T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제는 isoflavone aglycones 생산을 위한 강력한 효소라고 할 수 있다.

결론적으로, T. uzoniensis로부터 열안정성 β-갈락토시다아제가 클로닝 및 특성화되었고, 이를 한국산 야생 대두의 종자 및 뿌리 추출물의 daidzin 및 genistin으로부터 daidzein 및 genistein 생산에 적용되었다. 우리가 아는 한, 이 효소는 지금까지 보고된 효소 중 다이드제인과 제니스테인 모두에서 가장 높은 생산성을 나타낸다. 이러한 결과는 T. uzoniensis의 β-갈락토시다아제가 isoflavone glycoside의 가수분해에 산업적으로 유용할 수 있으며 야생 대두가 isoflavone aglycone 생산에 유용한 재료임을 나타낸다.

실시예 1. 이소플라본 배당체를 해당 이소플라본 아글리콘으로 변환시키는 방법 및 제제

상기 실험예들을 통해서 다음과 같이 실험과정 및 실험결과를 개략적으로 정리할 수 있다. [한국 야생 대두의 이소플라본 전환에 잠재적으로 적용하기 위해 극호열성 Thermoproteus uzoniensis 유래 열안정성 β-갈락토시다아제를 복제하고 특성화했다. 정제된 재조합 효소는 His-trap 크로마토그래피에 의해 pH 5.0 및 90°C에서 46시간의 반감기에서 1,103 μmol/min/mg의 최대 특이 활성을 나타내도록 정제되었다. 이 천연 효소는 113kDa의 동종 이량체로서 존재한다.

아릴-글리코사이드 효소의 가수분해 활성은 아릴 배당체 중 p-니트로페닐(pNP)-β-D-갈락토피라노시드에 대한 활성이 가장 높았고, 가수분해된 이소플라본 배당체의 경우 genistin > daidzin > ononin > glycitin의 순서로 나타났다.]

본 발명에 따른 이소플라본 배당체를 해당 이소플라본 아글리콘으로 변환시키는 방법 및 제제에 대해서 정리하면 다음과 같다.

1. Thermoproteus uzoniensis 로부터 β-갈락토시다아제를 제조한다.

2. 상기의 β-갈락토시다아제는 상기의 특성을 갖는다

3. 상기의 β-갈락토시다아제를 이소플라본 배당체와 반응시켜 이소플라본 아글리콘으로 생물전환한다.

실시예 2. 다이드진 및 제니스틴을 다이드제인 및 제니스테인으로 변환시키는 방법 및 제제

상기 실시예 1에 기재된 사항 및 실험예에 근거한다.

3의 단계는 다음과 같이 수행한다.

[isoflavone glycosides인 daidzin 및 genistin의 daidzein 및 genistein으로의 전환을 위해 pH 5.0, 90°C에서, 2mM 기질 및 최소 0.2mg/mL T. uzoniensis 유래 β-갈락토시다아제 조건에서 수행한다]

실시예 3. 다이드진 및 제니스틴을 다이드제인 및 제니스테인으로 변환시키는 방법 및 제제

상기 실시예 1에 기재된 사항 및 실험예에 근거한다.

3의 단계는 다음과 같이 수행한다.

[추출물의 daidzin과 genistin으로부터 daidzein과 genistein의 생산을 위하여 20%(w/v) 종자 또는 뿌리 추출물 및 최소 0.4 mg/mL β-갈락토시다아제를 사용하여 pH 5.0 및 90°C에서 수행한다.]

실시예 4. Thermoproteus uzoniensis 유래의 β-갈락토시다아제를 포함하는, 이소플라본 배당체의 가수분해 제제.

실시예 5. Thermoproteus uzoniensis 유래의 β-갈락토시다아제를 포함하는, 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 제제.

Claims

Thermoproteus uzoniensis 로부터 β-갈락토시다아제를 제조하는 단계; 및
상기 β-갈락토시다아제를 이소플라본 배당체와 반응시켜 이소플라본 아글리콘으로 생물전환하는 단계;를 포함하고,
상기 β-갈락토시다아제는 113kDa의 동종 이량체로서, pH 5.0 및 90℃에서 46시간의 반감기와 1,103 μmol/min/mg의 최대 특이 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는,
이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 방법.
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Thermoproteus uzoniensis 로부터 β-갈락토시다아제를 제조하는 단계; 및
상기 β-갈락토시다아제를 다이드진 및 제니스틴과 반응시켜, 상기 다이드진 및 제니스틴을 다이드제인 및 제니스테인으로 각각 생물변환하는 단계;를 포함하고,
상기 β-갈락토시다아제는 113kDa의 동종 이량체로서, pH 5.0 및 90℃에서 46시간의 반감기와 1,103 μmol/min/mg의 최대 특이 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는,
다이드진 및 제니스틴을 다이드제인 및 제니스테인으로 변환하는 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 생물변환하는 단계는,
pH 5.0, 90℃에서, 2mM 기질 및 최소 0.2mg/mL β-갈락토시다아제 조건에서 수행하는 단계인 것을 특징으로 하는,
다이드진 및 제니스틴을 다이드제인 및 제니스테인으로 변환시키는 방법.
Thermoproteus uzoniensis 로부터 β-갈락토시다아제를 제조하는 단계; 및
상기 β-갈락토시다아제를 야생 대두(Glycine soja) 추출물과 반응시켜, 상기 야생 대두 추출물에 포함된 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 단계;를 포함하고,
상기 β-갈락토시다아제는 113kDa의 동종 이량체로서, pH 5.0 및 90℃에서 46시간의 반감기와 1,103 μmol/min/mg의 최대 특이 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는,
야생 대두의 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 방법.
청구항 7에서,
상기 생물변환하는 단계는,
20%(w/v) 종자 또는 뿌리 추출물 및 최소 0.4 mg/mL β-갈락토시다아제를 사용하여 pH 5.0 및 90℃ 조건에서 수행하는 단계인 것을 특징으로 하는,
야생 대두의 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 생물변환하는 방법.
Thermoproteus uzoniensis 유래의 β-갈락토시다아제를 포함하고,
상기 β-갈락토시다아제는 113kDa의 동종 이량체로서, pH 5.0 및 90℃에서 46시간의 반감기와 1,103 μmol/min/mg의 최대 특이 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는, 생물변환 제제.
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