KR102204450B1 - 도라지 잎을 이용한 플라티코딘d의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법에 관한 것으로, 도라지(Platycodon grandiflorum) 잎 추출물로부터 기질을 준비하는 기질준비단계; β-글라이코시데이즈(β-glycosidase)를 준비하는 효소준비단계; 및 상기 기질에 상기 β-글라이코시데이즈(β-glycosidase)를 처리하는 생전환단계를 포함하여 구성된다.
이에 따라 플라티코딘D를 생성하기 위해 호열성 박테리아인 Caldicellulosiruptor owensensis로부터 β-글라이코시데이즈를 클로닝하고 특성화하여 적용하였고, 길경의 제조 과정에서 버려지나 많은 함량의 플라티코사이드E를 함유하는 도라지 잎을 원료로 사용함으로써 경제적이고, 생산성이 높으며, 안정적으로 플라티코딘D를 생산할 수 있다.

Description

도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법 {Production method of platycodin D using Platycodon grandiflorum leaf}

본 발명은 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 도라지(Platycodon grandiflorum) 잎 추출물로부터 준비된 기질에 β-글라이코시데이즈(β-glycosidase) 처리함으로써 경제적이면서 생산 효율이 높은 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법에 관한 것이다.

도라지(Platycodon grandiflorum)는 동북 아시아에서 기관지염, 결핵, 천식, 당뇨병 및 기타 염증성 질환을 치료하기 위한 건강식품 및 전통적인 의약품으로 알려져 있다.

지난 10년 동안 도라지의 사포닌(saponin)인 플라티코사이드(platycoside)에 대한 관심은 그의 다양한 약리학적 활성으로 인해 증가했다. 그 중 도라지(Platycodon grandiflorum)의 뿌리(Platycodi radix)에 있는 주요 플라티코사이드인 플라티코딘D(platycodin D)는 항 종양[비특허문헌 1,2], 항염증제[비특허문헌 3,4], 항 알레르기 [비특허문헌 5, 6], 항비만[비특허문헌 7,8]과 같은 다양한 약학적 효과가 있다고 알려져 있다.

플라티코딘D는 펜타사이클릭 트리터펜 아글리콘(pentacyclic triterpene aglycone), C-3에서 하나의 글루코스를 갖는 two-sided sugar 및 C-28에서 아라비노스(arabinose)-람노스(rhamnose)-자일로스(xylose)-아피오스(apiose)로 이루어지는 올리고사카라이드 잔기로 구성된다. 플라티코딘D는 플라티코사이드E와 플라티코딘D3의 탈당화(deglycosylation, 도 1 참조)에 의해 변환될 수 있으며, 이는 길경(platycodi radix)의 총 플라티코사이드 중 약 20%와 3%를 차지하며 각각 C-3에 2개 이상의 포도당 분자가 있다[비특허문헌 9].

사포닌의 탈당화는 결과적으로 더 작은 분자량, 세포막을 통과하는 더 나은 투과성 및 더 높은 생체 이용률로 인하여 생물학적 활성을 향상시킨다[비특허문헌 10,11].

따라서, 사포닌 탈당화에 대한 다양한 방법이 시도되었고, 그 중에서 효소 전환(enzymatic conversion)은 우수한 선택성 및 최고의 생산성을 나타냈다. 플라티코사이드 탈당화의 경우, Aspergillus usamii[비특허문헌 12], Aspergillus niger[비특허문헌 13], snailase[비특허문헌 14], laminarinase[비특허문헌 15] 및 cellulase[16]로부터 유래된 β-글라이코시데이즈(β-glycosidase) 뿐만 아니라, Caldicellulsiruptor bescii[비특허문헌 17]와 Dictyoglomus turgidum[비특허문헌 18]으로부터 유래된 β-글라이코시데이즈와 같은 호열성생물(thermophile) 유래 재조합 효소가 사용되었다. 재조합 효소는 높은 효소 발현 속도로 인해 산업적으로 유용하다; 호열성생물로부터 유래된 것들은 산업 생산에 유리한 높은 안정성 및 활성을 갖는다.

종래의 플라티코딘D 생산은 원료로서 길경 추출물(platycodi radix extract, PRE)을 사용하였고, 효소로서 셀룰레이즈, 스네일레이즈(snailase), Cyberlindnera fabianii 유래 조효소(crude enzyme), A. usamii 유래 β-글라이코시데이즈, C. bescii 유래 β-글라이코시데이즈 등을 사용하였다. 이 중 C. bescii 유래 β-글라이코시데이즈가 최고의 농도와 생산성으로 플라티코딘D를 생산하는 것으로 알려져 있다.

비특허문헌 1. Choi, C.Y.; Kim, J.Y.; Kim, Y.S.; Chung, Y.C.; Hahm, K.S.; Jeong, H.G. Augmentation of Macrophage Functions by an Aqueous Extract Isolated from Platycodon grandiflorum. Cancer Lett. 2001, 166, 17-25. 비특허문헌 2. Li, W.; Tian, Y.H.; Liu, Y.; Wang, Z.; Tang, S.; Zhang, J.; Wang, Y.P. Platycodin D Exerts Anti-Tumor Efficacy in H22 Tumor-Bearing Mice Via Improving Immune Function and Inducing Apoptosis. J. Toxicol. Sci. 2016, 41, 417-428. 비특허문헌 3. Kim, J.Y.; Hwang, Y.P.; Kim, D.H.; Han, E.H.; Chung, Y.C.; Roh, S.H.; Jeong, H.G. Inhibitory Effect of the Saponins Derived from Roots of Platycodon grandiflorum on Carrageenan-Induced Inflammation. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70, 858-864. 비특허문헌 4. Ye, Y.; Pei, L.; Ding, J.; Wu, C.; Sun, C.; Liu, S. Effects of Platycodin D on S100a8/A9-Induced Inflammatory Response in Murine Mammary Carcinoma 4t1 Cells. Int. Immunopharmacol. 2019, 67, 239-247. 비특허문헌 5. Halliwell, B. Oxidative Stress and Neurodegeneration: Where Are We Now? J. Neurochem. 2006, 97, 1634-1658. 비특허문헌 6. Zhang, T.; Yang, S.; Du, J.; Jinfu, Y.; Shumin, W. Platycodin D Attenuates Airway Inflammation in a Mouse Model of Allergic Asthma by Regulation Nf-Kappab Pathway. Inflammation 2015, 38, 1221-1228. 비특허문헌 7. Zhao, H.L.; Harding, S.V.; Marinangeli, C.P.; Kim, Y.S.; Jones, P.J. Hypocholesterolemic and Anti-Obesity Effects of Saponins from Platycodon grandiflorum in Hamsters Fed Atherogenic Diets. J. Food Sci. 2008, 73, H195-H200. 비특허문헌 8. Lin, Y.C.; Lin, Y.C.; Kuo, W.W.; Shen, C.Y.; Cheng, Y.C.; Lin, Y.M.; Chang, R.L.; Padma, V.V.; Huang, C.Y.; Huang, C.Y. Platycodin D Reverses Pathological Cardiac Hypertrophy and Fibrosis in Spontaneously Hypertensive Rats. Am. J. Chin. Med. 2018, 46, 537-549. 비특허문헌 9. Yoo, D.S.; Choi, Y.H.; Cha, M.R.; Lee, B.H.; Kim, S.J.; Yon, G.H.; Hong, K.S.; Jang, Y.S.; Lee, H.S.; Kim, Y.S.; et al. Hplc-Elsd Analysis of 18 Platycosides from Balloon Flower Roots (Platycodi Radix) Sourced from Various Regions in Korea and Geographical Clustering of the Cultivation Areas. Food Chem. 2011, 129, 645-651. 비특허문헌 10. Park, C.S.; Yoo, M.H.; Noh, K.H.; Oh, D.K. Biotransformation of Ginsenosides by Hydrolyzing the Sugar Moieties of Ginsenosides Using Microbial Glycosidases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87, 9-19. 비특허문헌 11. Shin, K.C.; Oh, D.K. Classification of Glycosidases That Hydrolyze the Specific Positions and Types of Sugar Moieties in Ginsenosides. Crit. Rev. Biotechnol. 2016, 36, 1036-1049. 비특허문헌 12. Ahn, H.J.; You, H.J.; Park, M.S.; Johnston, T.V.; Ku, S.; Ji, G.E. Biocatalysis of Platycoside E and Platycodin D3 Using Fungal Extracellular Beta-Glucosidase Responsible for Rapid Platycodin D Production. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2671. 비특허문헌 13. Wie, H.J.; Zhao, H.L.; Chang, J.H.; Kim, Y.S.; Hwang, I.K.; Ji, G.E. Enzymatic Modification of Saponins from Platycodon grandiflorum with Aspergillus niger. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 8908-8913. 비특허문헌 14. Li, W.; Zhao, L.C.; Wang, Z.; Zheng, Y.N.; Liang, J.; Wang, H. Response Surface Methodology to Optimize Enzymatic Preparation of Deapio-Platycodin D and Platycodin D from Radix Platycodi. Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 4089-4100. 비특허문헌 15. Jeong, E.K.; Ha, I.J.; Kim, Y.S.; Na, Y.C. Glycosylated Platycosides: Identification by Enzymatic Hydrolysis and Structural Determination by Lc-Ms/Ms. J. Sep. Sci. 2014, 37, 61-68. 비특허문헌 16. Ha, I.J.; Ha, Y.W.; Kang, M.; Lee, J.; Park, D.; Kim, Y.S. Enzymatic Transformation of Platycosides and One-Step Separation of Platycodin D by High-Speed Countercurrent Chromatography. J. Sep. Sci. 2010, 33, 1916-1922. 비특허문헌 17. Kil, T.G.; Kang, S.H.; Kim, T.H.; Shin, K.C.; Oh, D.K. Enzymatic Biotransformation of Balloon Flower Root Saponins into Bioactive Platycodin D by Deglucosylation with Caldicellulosiruptor bescii Beta-Glucosidase. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3854. 비특허문헌 18. Kang, S.H.; Kim, T.H.; Shin, K.C.; Ko, Y.J.; Oh, D.K. Biotransformation of Food-Derived Saponins, Platycosides, into Deglucosylated Saponins Including Deglucosylated Platycodin D and Their Anti-Inflammatory Activities. J. Agric. Food Chem. 2019, 67, 1470-1477.

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 원료로서 사용되는 길경 추출물 외에 경제적으로 손쉽게 구하거나 재활용할 수 있는 원료를 이용하여 플라틴코딘D를 효율적으로 생산할 수 있는 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 생전환에 사용되는 효소인 β-글라이코시데이즈를 공급하는 새로운 균주를 이용하여 플라틴코딘D를 효율적으로 생산할 수 있는 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법을 제공하는 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법은 도라지(Platycodon grandiflorum) 잎 추출물로부터 기질을 준비하는 기질준비단계; β-글라이코시데이즈(β-glycosidase)를 준비하는 효소준비단계; 및 상기 기질에 상기 β-글라이코시데이즈(β-glycosidase)를 처리하는 생전환단계를 포함하여 구성되는 것을 기술적 특징으로 한다.

본 발명에 따른 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법은 플라티코딘D를 생성하기 위해 호열성 박테리아인 Caldicellulosiruptor owensensis로부터 β-글라이코시데이즈를 클로닝하고 특성화하여 적용하였고, 길경의 제조 과정에서 버려지나 많은 함량의 플라티코사이드E를 함유하는 도라지 잎을 원료로 사용함으로써 경제적이고, 생산성이 높으며, 안정적으로 플라티코딘D를 생산할 수 있다.

구체적으로 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈는 C. bescii 유래 β-글라이코시데이즈보다 플라티코딘D의 농도 및 생산성에 있어 각각 3.5 배 및 1.8 배 더 높다.

도 1은 플라티코사이드E에서 플라티코딘D로의 탈탕화 경로를 나타내는 모식도(빨간색은 펜타사이클릭 트리터펜 아글리콘에서의 탄소수를 나타내는 것임).
도 2는 C. owensensis로부터의 β-글라이코시데이즈의 SDS-PAGE 및 겔-여과 크로마토 그래피. (a)C. owensensis로부터의 β-글라이코시데이즈에 대한 SDS-PAGE의 분석. 1 레인, 분자량 크기 마커(molecular weight size marker); 2 레인, 세포 파편(cellular debris); 3 레인, 미정 제 효소 추출물(crude enzyme extract); 및 레인 4, C. owensensis 유래 정제된 β-글라이코시데이즈. (b) 겔-여과 크로마토그래피를 사용하여 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈에 대한 분자량의 결정(C. owensensis 유래 참조 단백질 및 정제된 β-글라이코시데이즈는 각각 채워진 원 및 열린 원으로 표시됨).
도 3은 pH 및 온도의 변화에 따른 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 활성. (a)pH의 영향. (b)온도의 영향(데이터는 3중 실험수단으로 표시되고 표준 편차는 오차 막대로 표시됨).
도 4는 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 열에 의한 불활성화. 효소를 서로 다른 시간 동안 50mM CPB(pH 5.0)에 넣고, 70℃(닫힌 삼각형), 75℃(열린 사각형), 80℃(닫힌 사각형), 85℃(열린 원) 및 90℃(닫힌 원)의 온도에서 활성을 확인(데이터는 3중 실험수단으로 표시되고 표준 편차는 오차 막대로 표시됨)
도 5는 BFLE로부터 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈에 의한 플라티코딘D 생산의 최적의 효소 및 원료 농도. (a) 최적의 효소 농도. (b) 최적의 원료 농도. 생성된 플라티코딘D 및 몰 전환 수율의 농도는 각각 닫힌 원과 열린 사각형으로 표시(데이터는 3중 실험수단으로 나타내며 표준 편차는 오차 막대로 표시됨).
도 6은 C. owensensis의 β-글라이코시데이즈에 의한 BFLE로부터의 플라티코딘D 생산에 대한 시간 경과 반응. 닫힌 원은 플라티코사이드E; 닫힌 정사각형은 플라티코딘D3; 개방형 원은 플라티코딘D(데이터는 3중 실험수단으로 나타내며 표준 편차는 오차 막대로 표시됨).

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.

이하에서 진행되는 실험들은 아래의 각 실험방법에 따라 수행하였다.

실험방법 1. 박테리아 균주, 플라스미드 벡터 및 유전자 클로닝

DNA 템플릿(DNA templeate), β-글라이코시데이즈 유전자(GenBank accession no. ADQ03897) 클로닝을 위한 발현 벡터 및 효소 발현의 숙주 세포(host cell)은 각각 C. owensensis DSM 13100 (DSMZ, Braunschweig, Germany), pET-29b (+) 벡터 (Novagen, Darmstadt, Germany) 및 E. coli BL21 균주이다. C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈 유전자는 one-step isothermal DNA assembly method에 의해 클로닝되었다.

β-글라이코시데이즈 유전자의 DNA fragment들과 pET-29b (+) 발현 벡터는 다음의 프라이머들에 의하여 PCR로 증폭시켰다.

:β-글라이코시데이즈 유전자에 대한 정방향 프라이머, 5'-AGCAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATGAGTTTTCCAAAAGGATTTTTGTGGGGT-3‘; β-글라이코시데이즈 유전자에 대한 역 프라이머, 5'-ATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATGAATTTTCCTTTATATACTGCTGATA-3‘; 발현 벡터에 대한 정방향 프라이머, 5'-TATCAGCAGTATATAAAGGAAAATTCATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGAT-3‘; 발현 벡터에 대한 역방향 프라이머, 5'-ACCCCACAAAAATCCTTTTGGAAAACTCATATGTCCCTGAAAATACAGGTTTTCGCTGCT-3‘. 증폭된 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈 유전자 및 pET-29b (+) 발현 벡터는 Phusion High-Fidelity DNA 중합 효소(ThermoFisher Scientific, MA, USA, USA)에 의해 PCR을 통해 합성하였다. 그리고 합성된 DNA fragment들은 Gibson Assembly Master Mix(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 이용하여 라이게이션 되었고(ligated), 라이게이션된 DNA는 E. coli BL21로 형질전환(transform)되었다.

실험방법 2. 효소 발현을 위한 박테리아 배양

C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈 발현에 사용하기 위한 재조합 E. coli BL21을 50μg/mL 항생제(카나마이신)가 혼합된 450mL LB배지(Luria-Bertani medium)가 들어있는 배플 유리 삼각 플라스크(baffled glass Erlenmeyer flask)에 넣고 37℃의 온도, 200rpm 조건의 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 배양하였다. 재조합 E. coli BL21 성장의 광학 밀도가 0.6(600nm 조건)에 도달할 때, C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 발현을 위해 100mM IPTG를 첨가한 다음, 세포를 16℃에서 추가로 14시간 동안 배양하였다.

실험방법 3. C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 제조

배양된 재조합 E. coli BL 21 세포를 원심 분리로 수확(harvest)하고, 1 mg/mL 라이소자임이 포함된 Ni-NTA 용해완충액(lysis buffer)에 현탁시키고 얼음 위에서 울트라소니케이터(ultrasonicator, KBT, 성남, 한국)를 사용하여 20분 동안 파괴시켰다. 세포 파편 및 파괴되지 않은 세포를 원심분리하여 제거하고, 상층액을 Bio-Rad ProfiniaTM 정제 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)의 HisTrap HP affinity 컬럼에 적용하였다.

가수 분해 활성을 갖는 수집 된 분획물을 pH 5.5, 4℃ 조건에서 16시간 동안 50mM citrate phosphate buffer(CPB)에 대해 투석시켰다. 투석된 용액을 정제된 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈로 사용하였다. 정제된 효소의 농도는 브래드포드 단백질 분석(Bradford protein assay)에 의해 측정되었다.

실험방법 4. SDS-PAGE 및 겔 여과 크로마토그래피(Gel-Filtration Chromatography)

C. owensensis 유래 재조합 β-글라이코시데이즈의 서브 유닛 분자 질량을 SDS-PAGE(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 검사하였다. 세포 잔해(celluar debris), 조효소 추출물(crude enzyme extract) 및 정제된 β-글라이코시데이즈를 1 mg/mL의 농도로 사용하여 정제 정도를 비교하였다. 쿠마시블루(Coomassie blue)는 각 정제 단계에서 모든 단백질 밴드의 시각화를 위한 염료로 사용되었다. 겔 여과 크로마토 그래피를 C. owensensis 유래 재조합 β-글라이코시데이즈의 분자 질량 측정에 사용하였다. 재조합 β-글라이코시데이즈를 HiPrep^TM 16/60 Sephacryl^® S-300 HR 컬럼 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 통해 전달한 다음, 효소 결합 컬럼은 150 mM의 NaCl을 함유하는 50 mM CPB(pH 5.5)를 이용하여 0.5 mL/min 유속으로 용출(eluted)시켰다. 배양된 재조합 E. coli BL 21 세포를 원심분리하여 수확하고, 1 mg/mL 라이소자임(lysozyme)이 포함된 Ni-NTA 용해완충액(5 mM imidazole 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM sodium/phosphate 완충액, pH 7.0)에 현탁시켰다. 정제된 효소를 다음과 같은 레퍼런스 단백질로 용출시켰다: 각각 43, 75, 158 및 232 kDa의 분자량을 갖는 오발부민(ovalbumin), 콘알부민(conalbumin), 아돌레이즈(aldolase) 및 카탈레이즈(catalase). C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 체류 시간은 레퍼런스 단백질 이동 길이와 비교하여 계산하였다.

실험방법 5. 도라지 잎 추출물(Balloon flower leaf extract, 이하 ‘BFLE’라 한다)의 준비

봉화군에서 재배한 2년생 도라지 잎을 이용하여 추출물을 제조하였다. 도라지 잎을 건조오븐에서 40℃의 온도로 72시간 동안 건조시켰다. 건조된 도라지 잎을 전기 분쇄기를 사용하여 분쇄하였다. 미세 도라지 잎 분말 100g을 70℃에서 24시간 동안 1L의 80%(v/v) 메탄올을 사용하여 추출하였다. 도라지 잎 추출물을 여과하고, 메탄올을 회전 증발기로 완전히 제거한 다음, 잔류물을 동일한 부피의 증류수에 용해시켰다. C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈와 유리당(free sugar)의 효소 반응 온도 70℃ 이상에서 메일라드 반응(Maillard reaction)을 방지하기 위해 추출물의 당을 Diaion HP20 레진(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 컬럼을 사용하여 제거하였다. 추출액을 컬럼에 로딩한 후, 플라티코사이드-흡착 레진을 증류수로 세척하였다. 세척 후 컬럼은 메탄올과 함께 0.5 mL/분의 유속으로 플라티코사이드를 흡수하였다. 용출액에 포함된 메탄올을 증발시키고 증류수 1L를 잔류물에 첨가하였다. 생성된 BFLE을 플라티코딘D 생산에 사용하였다.

실험방법 6. 가수 분해 활성 분석

효소 반응은 80℃에서 50 μg/mL의 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈 및 400 μg/mL의 플라티코사이드를 함유하는 50 mM CPB (pH 5.0)에서 10분 동안 수행하였다. deapi-플라티코딘D, deapi-플라티코딘D3, deapi-플라티코사이드E, 플라티코딘D3, 플라티코딘D 및 플라티코사이드E를 포함하는 플라티코사이드에 대한 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 특이적 활성은 다양한 농도의 효소(5-50 μg/mL)로 평가하였고, 각각 플라티코사이드의 농도는 400 ㎍/mL이고 10분간 진행하였다.

플라티코사이드E에 대한 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 활성에 미치는 온도와 pH의 영향을 시험하였고, 구체적으로 1 mM pNP-β-D-glucopyranoside를 이용하여 pH 5.0에서 10분간 온도를 65 내지 95℃로 변화시키고, 75℃의 온도에서 10분간 pH를 4.0 내지 7.5로 변화시킴으로써 시험하였다. 효소 수용액을 50 mM CPB (pH 5.0) 조건하에 70, 75, 80, 85 and 90℃의 온도에서 유지시키는 인큐베이션 시간을 측정함으로써 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 열안정성 효과를 확인하였다. 배양 후, 반응 샘플을 50 mM CPB (pH 5.0) 조건 하에서 1 mM pNP-β-D-glucopyranoside로 80℃, 10분 동안 분석하였다. 샘플들은 일정한 시간 간격으로 회수하고 분석하였다.

실험방법 7. 플라티코사이드의 생전환(biotransformation)

BFLE로부터 플라티코딘D 생산을 위한 최적의 β-글라이코시데이즈 농도는 BFLE에서 5mg/mL의 플라티코사이드E와 함께 β-글라이코시데이즈의 농도를 0.5 내지 5mg/mL로 변화시킴으로써 결정되었다. 원료로서 BFLE에서 플라티코사이드E의 최적 농도는 3 mg/mL의 일정한 효소 농도 조건에서 플라티코사이드E의 농도를 1 내지 10 mg/mL로 변화시킴으로써 결정되었다. 반응은 80℃에서 3시간 동안 50mM CPB (pH 5.0) 존재하에서 수행하였다. BFLE에서 플라티코사이드E를 플라티코딘D로 전환하기위한 시간 경과 반응(time-course reaction)은 BFLE(5 mg/mL platycoside E (PE) 및 0.07 mg/mL platycodin D (PD) 함유)에서 3 mg/mL의 β-글라이코시데이즈 및 5 mg/mL platycoside E와 함께 50mM CPB(pH 5.0)에서 수행하였다.

실험방법 8. HPLC 분석

효소 반응 후, 내부표준물질(digoxin)과 함께 동일한 부피의 n-부탄올에 의해 반응용액을 추출하였다. 추출한 용액 중 n-부탄올 분획이 완전히 건조될 때까지 증발시키고, 동일한 부피의 메탄올을 첨가하였다. 플라티코사이드 분석은 203nm의 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 hydrosphere C18 컬럼(4.6 × 150 mm; YMC, Kyoto, Japan)으로 수행하였다.

상기 컬럼을 1 mL/분의 유속으로 37℃에서 60분 동안 용리시켰으며, acetonitrile/water(v/v) 구배 조건은 다음과 같다: 10/90 내지 40/60의 조건으로 30분; 40/60 내지 90/10의 조건으로 15분; 90/10 내지 10/90의 조건으로 5분; 10/90 일정한 조건으로 10분. 모든 표준 플라티코사이드는 Ambo Laboratories((Daejeon, Korea)에서 구입했다.

상기의 실험방법들을 토대로 이하의 각 실험예를 수행하였고, 그 결과를 설명한다.

실험예 1. 유전자 클로닝, 효소 정제 및 분자 질량 측정

C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈는 Escherichia coli BL21에서 가용성 형태로 발현되었다. C. owensensis 유래의 발현된 β-글라이코시데이즈는 HisTrap-친크로마토그래피(HisTrap-affinity chromatography)를 사용하여 가용성 단백질로 정제되었고, 정제 결과 17배 정제 및 18%의 최종 수율을 얻었다. C. owensensis 유래 재조합 β-글라이코시데이즈의 특이적 활성은 조효소 추출물로부터의 pNP-β-D-glucopyranoside에 대해 51.6 μmol/min/mg이었다.

재조합 β-글라이코시데이즈의 분자량은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용했을 시 약 53 kDa으로 확인되었다. 재조합 β-글라이코시데이즈의 계산된 분자량은 6개의 히스티딘 잔기를 함유하는 458 아미노산을 기준으로 54,018 Da이었다(도 2a). C. owensensis 유래 천연 β-글라이코시데이즈는 겔-여과 크로마토그래피에 의해 106 kDa의 분자 질량을 갖는 동종이량체인 것으로 결정되었다(도 2b). 크로마토그래피에서 β-글라이코시데이즈 이외의 피크는 검출되지 않았다.

실험예 2. pH 및 온도 변화에 따른 가수 분해 활성

C. owensensis 유래 재조합 β-글라이코시데이즈는 pH 5.0과 80°C에서 최대 가수 분해 활성을 나타냈다(그림 3). 플라티코사이드의 탈당화에 사용되는 재조합 효소 및 Caldicellulosiruptor bescii 및 Dictyoglomus turgidum 유래 β-글라이코시데이즈의 최적 pH 및 온도는 각각 pH 5.5와 80℃, pH 6.5와 80℃였다.

C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 열 안정성은 70 내지 90℃의 온도 범위에서 검사되었다. 효소에 의한 열 불활성화에 대한 1차 키네틱스(first-order kinetics)가 표시되었고, C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 반감기는 70, 75, 80, 85 및 90℃에서 각각 107, 32, 12.5, 0.6 및 0.1 시간이었다(그림 4). C. bescii 유래 플라티코딘D 생성효소 β-글라이코시데이즈는 70, 75, 80, 85 및 90℃에서 각각 96, 29, 6.2, 0.1 및 0.03 시간의 반감기를 나타냈다. C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈는 전반에 걸쳐 C. bescii 유래 β-글라이코시데이즈보다 높은 열 안정성을 보였으며, C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈는 80, 85 및 90℃에서 각각 약 2, 6 및 3배 높은 안정성을 나타냈다.

실험예 3. 기질 특이성

C. owensensis로부터의 재조합 β-글라이코시데이즈의 기질 특이성은 아릴-글라이코사이드(aryl-glycoside) 및 플라티코사이드를 사용하여 측정되었다(표 1 참조). 효소는 기질로서 아릴-글라이코사이드와 함께 다음과 같은 특정 활성을 나타냈다: pNP-β-D-glucopyranoside > oNP-β-D-glucopyranoside > pNP-β-D-galactopyranoside > oNP-β-D-galactopyranoside > pNP-α-L-arabinopyranoside > pNP-α-L-rhamnopyranoside > oNP-β-D-xylopyranoside > pNP-β-D-xylopyranoside.

효소는 글루코파이라노사이드(glucopyranoside) 및 갈락토파이라노사이드(galactopyranoside) 뿐만 아니라 아라비노파이라노사이드(arabinopyranoside), 람노파이라노사이드(rhamnopyranoside) 및 자일로파이라노사이드(xylopyranoside)와 같은 다른 글리코사이드에서 다양한 결합에 작용하였다. 그럼에도 불구하고, 효소는 C-28에 있는 아라비노스(arabinose), 람노스(rhamnose) 및 자일로스(xylose)의 잔기를 절단하지 않았다. 플라티코사이드E에서 플라티코딘D로의 탈당화 경로에 기초하여, 효소는 외부에 위치한 당에서부터 차례로 가수 분해되는 엑소-타입(exo-type) 가수분해효소이다. 효소가 C-28에서 가장 바깥에 연결된 아피오즈(apiose)를 가수 분해하지 않았기 때문에, C-28에서 내부에 연결된 다른 당, 예컨대 아라비노스, 람노스 및 자일로스는 가수분해가 될 수 없었다.

기질로서 플라티코사이드를 사용한 특이적 효소활성은 다음 순서를 나타냈다: platycoside E > deapiosylated(deapi-) platycoside E > platycodin D3 > deapi-platycodin D3. 플라티코사이드E, 디아피-플라티코사이드E(deapi-platycoside E), 플라티코딘D3 및 디아피-플라티코딘D3(deapi-platycodin D3)은 각각 플라티코딘D3, 디아피-플라티코딘D3, 플라티코딘D 및 디아피-플라티코딘D로 변환되었다. 그러나 플라티코딘D 및 디아피-플라티코딘D에 대한 활성은 없었는데, 이는 효소가 플라티코사이드의 C-3 위치에서 내부 포도당 절단을 촉매화할 수 없고, 최외 포도당에 대해 상당히 높은 활성을 가짐을 나타낸다. 플라티코사이드E, 플라티코딘D3 및 디아피-플라티코딘D3에 대한 C. owensensis의 β-글라이코시데이즈 활성은 플라티코딘D-합성 효소(C. bescii 유래 β-글라이코시데이즈)보다 각각 1.06, 6.25 및 5.5배 높았다. 그러나 C. bescii 유래 β-글라이코시데이즈는 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈보다 기질로서 디아피-플라티코사이드E에 대한 높은 특이적 활성을 나타냈다.

실험예 4. 반응 조건의 최적화

BFLE를 80%(v/v) 메탄올로 추출하여 수득하였고, 추출물은 5.19 mg/mL 플라티코사이드E를 함유하였으며, 이는 전체 플라티코사이드의 92.31%(w/w)를 구성하였다(표 2 참조).

이는 플라티코딘D 생산에 사용된 길경 추출물(PRE)에서 플라티코사이드E의 농도 및 함량보다 각각 3.8 배 및 2.3 배 높은 값이었다. 그러나, PRE에 함유된 플라티코딘D3, 폴리갈락신D3(polygalacin D3), 디아피-플라티코딘D3 and 3′-O-아세틸 폴리갈락신D3(3′-O-acetyl polygalacin D3)와 같은 플라티코사이드는 BFLE에 존재하지 않았다. 총 BFLE 플라티코사이드 중 특정 플라티코사이드 함량은 다음 순서와 같다: platycoside E (92.31% (w/w)) > deapi-platycoside E (2.89%) > polygalacin D (2.12%) > platycodin D (1.34%) > deapi-platycodin D (0.53%) > 3″-O-acetyl polygalacin D (0.45%) > platycodin A (0.36%). 이는 BFLE이 플라티코딘D 생산을 위한 효율적인 물질임을 나타낸다.

플라티코딘D 생성과 β-글라이코시데이즈 농도와의 관계를 0.5 내지 5 mg/mL 등 다양한 효소 농도 범위에서 확인하였고, BFLE에 포함된 5 mg/mL의 플라티코사이드E를 기질로서 3시간 동안 사용하였다(도 5a 참조). 플라티코딘D 생산은 재조합 β-글라이코시데이즈 농도가 3mg/mL가 될 때까지 증가했다. 그러나 플라티코딘D 생성의 증가는 효소의 농도가 3mg/mL를 초과하면서 급격히 감소하여, 최적의 효소 농도는 3mg/mL임을 나타냈다. 플라티코딘D 생산은 BFLE에 포함된 플라티코사이드E의 농도를 1 내지 10mg/mL로 변화시킴으로써 3mg/mL 효소와 함께 3시간 동안 수행하였다(도 5b). 몰 전환율은 BFLE에 포함된 플라티코사이드E의 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 그러나, 플라티코딘D 생산은 BFLE에서 5 mg/mL의 플라티코사이드E까지 지속적으로 증가하였다. BFLE에서 5 mg/mL 플라티코사이드E를 초과하면, 플라티코딘D 생성이 상당히 감소되었다. 따라서, BFLE 중 플라티코사이드E의 5mg/mL가 플라티코딘D 생산을 위한 기질 농도로 선택되었다.

실시예 1. C. owensensis 의 β-글라이코시데이즈에 의한 BFLE의 플라티코딘D 생산

최적화된 반응 조건하에서, 6시간 후 C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈에 의해 BFLE 중의 5 mg/mL 플라티코사이드E로부터 3.95 mg/mL의 플라티코딘D가 생성되었고, 생산성 및 몰 수율은 각각 658 mg/L/h 및 100%로 나타났다. 결과적으로, 플라티코딘D 농도는 BFLE의 초기 농도인 0.07 mg/mL에서 최종적으로 4.02 mg/mL로 증가하였다(도 6 참조). 상기 생산은 다음과 같은 형질전환경로에 의하여 수행되었다: platycoside E → platycodin D3 → platycodin D(도 1 참조)

플라티코딘D(platycodin D)는 다양한 약학적 활성을 가지므로, 플라티코사이드(platycoside)를 얻기 위한 효율적이고 경제적인 메커니즘은 매우 유용할 것이다. 도라지 잎 추출물은 길경(platycodi radix) 제조과정에서 버려지는 잎들을 재활용함으로써 얻을 수 있는데, 이는 상기 잎이 높은 플라티코사이드E 함량을 갖기 때문이다.

Caldicellulosiruptor owensensis 유래 재조합 β-글라이코시데이즈(β-glycosidase)를 특성화하고 플라티코사이드 생전환(bioconversion)을 위해 BFLE에 적용했다. 효소는 플라티코시드의 C-3 위치에서 포도당 잔기를 특이적으로 가수 분해하였고, 이는 플라티코딘D 생산에 적합하였다. 최적화된 반응 조건하에서, C. owensensis의 β-글라이코시데이즈는 BFLE의 플라티코사이드E를 지금까지 보고된 최고 농도 및 생산성으로 플라티코딘D로 완전히 전환시켰다. 이러한 결과는 탈당화된 플라티코사이드의 생산 공정을 크게 개선시킨다.

이 연구에서, C. owensensis 유래 β-글라이코시데이즈의 기질 특이성은 아릴-글라이코사이드 및 플라티코사이드를 사용하여 측정되었고, 플라티코딘D의 생성을 위한 효소 반응 조건이 최적화되었다. 최적의 효소 반응 조건 하에서, C. owensensis 유래 재조합 β-글라이코시데이즈는 지금까지 보고된 것 중 최고의 농도 및 생산성으로 BFLE 플라티코사이드E를 플라티코딘D로 완전히 전환시켰다. 길경에서 폐기된 잎을 재활용하여 BFLE를 효율적인 기질로 사용한 것은 이번이 처음이고, 이러한 결과를 통해 탈당화된 플라티코사이드(deglycosylated platycosides)의 생산 과정을 크게 향상시킨다.

Claims (5)

1. 도라지(Platycodon grandiflorum) 잎 추출물로부터 기질을 준비하는 기질준비단계;
   β-글라이코시데이즈(β-glycosidase)를 준비하는 효소준비단계; 및
   상기 기질에 상기 β-글라이코시데이즈(β-glycosidase)를 처리하는 생전환단계를 포함하여 구성되되,
   상기 기질준비단계는,
   도라지 잎을 건조한 다음, 분쇄하는 단계;
   분쇄된 도라지 잎 분말에 메탄올을 부가하여 추출하는 단계;
   상기 추출물을 여과하고 메탄올을 제거한 다음, 증류수에 용해시키는 단계;
   상기 증류수에 용해된 추출물을 플라티코사이드-흡착 레진컬럼에 통과시켜 당을 제거하는 단계; 및
   상기 레진을 증류수로 세척한 다음, 메탄올을 흘려주어 플라티코사이드를 용출시키는 단계;를 포함하고,
   상기 기질은 플라티코사이드E(platycoside E)이며,
   상기 β-글라이코시데이즈는 Caldicellulosiruptor owensensis DSM 13100 균주로부터 유래되고,
   상기 생전환단계에서는, 상기 플라티코사이드E의 농도가 1 내지 5mg/mL이고, β-글라이코시데이즈 농도가 0.5 내지 3mg/mL인 것을 특징으로 하는,
   도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법.
   
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 도라지 잎은 길경에서 폐기된 잎을 재활용하는 것을 특징으로 하는 도라지 잎을 이용한 플라티코딘D의 생산방법
   
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