KR102084332B1

KR102084332B1 - 플라티코딘 디 제조용 조성물 및 플라티코딘 디 제조방법

Info

Publication number: KR102084332B1
Application number: KR1020180159494A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 신경철; 길태근
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2020-03-03

Abstract

본 발명은 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 유래 β-글루코시다아제를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 조성물 및 이를 이용한 플라티코딘 D 제조방법에 관한 것이다.

Description

플라티코딘 디 제조용 조성물 및 플라티코딘 디 제조방법{COMPOSITION FOR PRODUCING PLATYCODIN D AND METHOD FOR PRODUCING PLATYCODIN D}

본 발명은 고온성 미생물 유래 β-글루코시다아제를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 조성물 및 이를 이용한 플라티코딘 D 제조방법에 관한 것이다.

도라지(Platycodon grandiflorum)는 동아시아 지역에 자생 또는 재배되는 초롱꽃과(Campanualaceae)에 속하는 다년생 초본류로서, 주로 뿌리가 전통적인 생약재 및 식품으로 활용되고 있으며 주요 활성 물질은 사포닌 계열의 화합물로 알려져있으며 도라지의 함유 성분의 약 2% 정도 존재하고 있는데, 이들 사포닌 성분들이 도라지의 다양한 약리 효능의 유효 성분으로 주목받고 있다. 이 중에서 많이 연구되어온 물질은 플라티코딘(platycodin)과 폴리갈라신(polygalacin)으로 가지고 있는 당 잔기의 차이에 따라 다양한 형태로 존재한다.

도라지는 주로 폐질환, 가래, 기침, 천식, 진통, 해열 등의 증상의 치료제로 사용되어 왔으며, 항염증 효과, 항암 효과, 통증 완화 효과, 소화효소분비 억제효과, 콜레스테롤 대사 개선효과, 간기능 보호 및 개선 효과, 면역기능 조절 활성 효과 등의 약리효능이 있는 것으로 알려져 있다.

도라지의 주요 성분으로는 플라티코사이드 E 등이 있는데, 기존에는 상업용 효소를 이용하여, 도 1과 같이 플라티코사이드 E로부터 플라티코딘 D3를 거쳐 플라티코딘 D로 최종적으로 전환시킨 연구가 진행된바 있었으나, 이의 생산성 및 전환율이 낮은 문제점이 있었다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 조성물 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 조성물을 제공한다.

상기 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제의 농도는 0.05 mg/ml 내지 5.00 mg/ml일 수 있다.

상기 조성물은 플라티코사이드 E; 또는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3 및 플라티코딘 D 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 함유된 도라지 추출물을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 플라티코딘 D 제조방법을 제공한다.

상기 기질은 플라티코사이드 E; 또는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3 및 플라티코딘 D로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 함유된 도라지 추출물을 포함할 수 있다.

상기 처리는 pH 4.5~6.5 및 70~90℃ 조건에서 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 숙주세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따라 고온성 미생물인 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 이용하여 플라티코사이드 E 또는 도라지 추출물로부터 플라티코딘 D를 제조하는 경우, 높은 반응 온도 및 빠른 반응 속도를 유지하여 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시킬 수 있다. 특히, 플라티코사이드 E 또는 플라티코딘 D3의 3번 위치 글루코오스를 선택적으로 가수분해하여 높은 생산성 및 전환율로 플라티코딘 D를 최종 전환시킬 수 있다. 이때, 플라티코사이드 E 또는 플라티코딘 D3의 글루코오스가 존재하지 않는 28번 위치 당(28-0-glycosides)은 가수분해되지 않는 것을 특징으로 한다.

상기 플라티코딘 D는 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 플라티코사이드 E(platycoside E)로부터 플라티코딘 D3(platycodin D3)를 거쳐 플라티코딘 D(platycodin D)로 전환되는 경로를 보여주는 그림이다.
도 2(a)는 Cb 유래 β-글루코시다아제의 pH 변화에 따른 활성도를 보여주는 것이고, 도 3(b)는 Cb 유래 β-글루코시다아제의 온도 변화에 따른 활성도를 보여주는 것이다.
도 3은 Cb 유래 β-글루코시다아제의 온도 안정성에 따른 활성도를 보여주는 것이다.
도 4(a) 및 (b)는 Cb 유래 β-글루코시다아제를 플라티코사이드 E에 처리한 결과, 제조된 플라티코딘 D의 생산성을 보여주는 것이다.
도 5(a) 및 (b)는 Cb 유래 β-글루코시다아제를 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물에 처리한 결과, 제조된 플라티코딘 D의 생산성을 보여주는 것이다.

본 발명자들은 높은 생산성 및 전환율로 플라티코딘 D를 제조하기 위한 방법에 대한 연구를 수행한 결과, 고온성 미생물인 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 효소액을 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 플라티코딘 D를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본원 명세서 내 "플라티코딘 D(platycodin D)"이라 함은 하기 화학식 1로 표시된다:

[화학식 1]

구체적으로, 상기 플라티코딘 D는 도라지 추출물에 소량 존재하는 주요 플라티코사이드 중 하나로서, 플라티코사이드라 함은 모핵에 글루코오스, 아피오스, 자일로스, 람노오스, 아라비노피라노오스 등의 당들이 결합된 상태를 말한다. 보다 구체적으로, 상기 플라티코딘 D는 플라티코사이드 E 또는 플라티코딘 D3의 3번 위치 글루코오스가 일부 가수분해되어, 하나의 글루코오스만 남아있는 상태를 말한다. 즉, 플라티코딘 D는 플라티코사이드 E 또는 플라티코딘 D3와 모핵에 연결되는 글리코시드(glycoside)의 수에서 차이를 가지는바, 이러한 구조적인 차이는 효능면에서 차이를 유발한다고 볼 수 있는데, 플라티코딘 D는 다른 플라티코사이드 보다 생물학적 활성이 높은 것을 특징으로 한다.

플라티코딘 D 제조용 조성물

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii ; Cb) 유래 β-글루코시다아제를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 조성물을 제공한다.

상기 Cb 유래 β-글루코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 Cb 유래 β-글루코시다아제는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 이때, 상기 Cb 유래 β-글루코시다아제의 최적 활성 pH는 4.5 내지 6.5, 바람직하게 5.0 내지 6.0이고, 최적 활성 온도는 70℃ 내지 90℃, 바람직하게 75℃ 내지 85℃이다.

상기 Cb 유래 β-글루코시다아제는 도라지 추출물에 존재하는 주요 플라티코사이드인 플라티코사이드 E의 3번 위치 글루코오스를 선택적으로 가수분해하여 플라티코딘 D3를 거쳐 플라티코딘 D로 최종적으로 전환시키기 위한 역할을 한다. 이때, 플라티코사이드 E의 글루코오스가 존재하지 않는 28번 위치 당(28-0-glycosides)은 가수분해되지 않는 것을 특징으로 한다.

상기 Cb 유래 β-글루코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 Cb 유래 β-글루코시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 Cb 유래 β-글루코시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28(+)a 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환된 미생물로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균을 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 Cb 유래 β-글루코시다아제를 추가로 분리 및 정제하는 과정은 ⅰ) 상기 미생물의 배양액 내 세포를 파쇄하는 단계; ⅱ) 상기 세포 파쇄물을 1차 원심분리하여 1차 상등액을 얻는 단계; ⅲ) 상기 1차 상등액을 고온 열처리한 후 2차 원심분리하여 2차 상등액을 얻는 단계; 및 ⅳ) 상기 2차 상등액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, ⅰ) 단계에서 파쇄는 프렌치 프레서 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 15,000 lb/in² 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ⅲ) 단계에서 고온 열처리는 70℃ 및 10분 내외로 수행될 수 있으며, ⅳ) 단계에서 여과는 0.45 ㎛ 내외의 여과지를 사용하여 수행될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 플라티코사이드 E; 또는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3 및 플라티코딘 D 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 함유된 도라지 추출물을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.

즉, 상기 기질은 플라티코딘 D를 제조하기 위한 출발물질에 해당하는, 플라티코사이드 E를 필수적으로 포함하는 것이 바람직하고, 상기 기질 내 플라티코사이드 E의 농도는 0.50~2.00 ㎎/㎖ 인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 도라지 추출물은 도라지의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 이때, 도라지 추출물은 플라티코사이드 E(platycoside E) 0.50~2.00 ㎎/㎖, 플라티코딘 D3(platycodin D3) 0.01~0.20 ㎎/㎖ 및 플라티코딘 D(platycodin D) 0.10~0.50 ㎎/㎖를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.본 발명에서는 도라지 추출물로 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물을 사용하였다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 Cb 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 조성물을 제공한다.

상기 Cb 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 Cb 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

플라티코딘 D 제조방법

본 발명은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 플라티코딘 D 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 플라티코딘 D 제조방법은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함한다.

상기 조성물은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 Cb 유래 β-글루코시다아제를 포함하거나, 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 Cb 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로, 구체적인 내용에 대해서는 전술한 바와 같다.

또한, 상기 기질은 플라티코사이드 E; 또는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3 및 플라티코딘 D로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 함유된 도라지 추출물을 포함할 수 있다.

상기 처리는 pH 4.5~6.5 및 70~90℃ 조건에서 수행될 수 있다. 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 5.0~6.0인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 75~85℃인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조건을 유지함으로써, 사용되는 효소를 최적으로 활성화시킬 수 있어, 최종적으로 플라티코딘 D를 높은 생산성 및 전환율로 제조할 수 있다.

또한, 상기 처리는 100분 이상 수행되는 것이 바람직하고, 140분 이상 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이로써, 플라티코딘 D로의 전환율이 100%일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 칼디셀룰로시럽터 베시 ( Caldicellulosiruptor bescii ; Cb ) 유래 β-글루코시다아제의 발현

(1) 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명에서는 Cb 유래 β-글루코시다아제를 제조하기 위하여, 먼저, Cb 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 분리하였다.

구체적으로, 염기 서열 및 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii)을 선발하고, 이로부터 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자의 염기 서열[서열목록 참조; 진뱅크 수탁번호 ACM59590(Genebank Accession No. ACM59590)]을 기초로 하였으며, β-글루코시다아제의 재조합 발현 벡터를 만들기 위하여 Gibson assembly method를 이용하여 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자의 염기 서열을 기초로 한 프라이머(primer)(F:CAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATATGAGTTTACCAAAAGGATTTCTTGGGT, R: ATCTCAGTGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATGAGTTTTCCTTTATATACTGCTGATA)를 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였으며, 재조합 플라스미드 벡터 pET 28(+)a (Novagen사 제품)의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머 (primer)(F:TATCAGCAGTATATAAAGGAAAACTCATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGAT, R: ACCCCACAGAAATCCTTTTGGTAAACTCATATATGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTG)를 고안하여 중합효소 연쇄반응을 실시하여 제한효소 없이 ligation하여 pET 28(+)a/β-글루코시다아제를 제작하였다. 형질전환된 재조합 대장균은 플라티코딘 D의 제조를 위한 배양을 실시하기 전에 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 -70 ℃에 냉동 보관하였다.

(2) Cb 유래 β-글루코시다아제의 발현 및 정제

효소의 단백질 발현을 위한 형질전환된 재조합 대장균은 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 50 μg/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, β-글루코시다아제의 과발현을 유도하기 위해 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.

배양된 β-글루코시다아제를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 과발현된 β-글루코시다아제는 형질전환된 균주의 배양액을 3000 rpm으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 플라티코딘 D의 제조에 사용할 효소의 정제를 위해 사용하였다.

이후 이러한 효소를 정제하기 위하여, 형질전환된 균주의 배양액을 13,000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리한 다음 상기 세포 용액을 프렌치 프레서로 15,000 lb/in²에서 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000 rpm 로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 고온인 70℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 이로부터 얻은 열 처리물을 13,000 rpm 으로 4℃에서 0분 동안 다시 원심분리하였다. 그 결과 얻은 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 플라티코딘 D의 제조에 사용할 효소액으로 분리하였다.

실시예 2: Cb 유래 β-글루코시다아제의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도 확인

본 발명에서는 실시예 1에서 분리한 Cb 유래 β-글루코시다아제의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도를 다음과 같이 확인하였다. 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 Cb 유래 β-글루코시다아제와 기질을 반응시키고, Cb 유래 β-글루코시다아제의 활성도를 비교하였다.

(1) Cb 유래 β-글루코시다아제에 대한 pH 효과 확인

Cb 유래 β-글루코시다아제에 대한 pH 효과를 확인하기 위하여, Cb 유래 β-글루코시다아제 0.05 mg/ml 및 플라티코사이드 E 0.4 mg/ml가 함유된 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액을 pH 4.5 내지 6.5의 범위에서 80℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, Cb 유래 β-글루코시다아제의 활성도를 측정하였다.

그 결과, 도 2(a)에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 5.5인 것으로 확인된다.

(2) Cb 유래 β-글루코시다아제에 대한 온도 효과 확인

Cb 유래 β-글루코시다아제에 대한 온도 효과를 확인하기 위해서, Cb 유래 β-글루코시다아제 0.05 mg/ml 및 플라티코사이드 E 0.4 mg/ml가 함유된 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액(pH 6.5)을 70℃ 내지 90℃의 범위에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, Cb 유래 β-글루코시다아제의 활성도를 측정하였다.

그 결과, 도 2(b)에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 80℃인 것으로 확인된다.

실시예 3: Cb 유래 β-글루코시다아제의 온도 안정성 확인

본 발명에서는 실시예 1에서 분리한 Cb 유래 β-글루코시다아제의 온도 안정성을 확인하기 위하여, Cb 유래 β-글루코시다아제가 함유된 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액(pH 6.5)을 70℃ 내지 90℃의 범위에서 5분 내지 18시간 동안 방치한 다음, 방치 후 꺼내진 Cb 유래 β-글루코시다아제 0.05 mg/ml 및 플라티코사이드 E 0.4 mg/ml를 80℃에서 10분 동안 반응시켰다. 래 β-글루코시다아제의 활성도가 절반 이하로 줄어들 때까지 반응시켰다. 이후, n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, Cb 유래 β-글루코시다아제의 활성도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 70℃에서는 136시간, 75℃에서는 30시간, 80℃에서는 4.5시간, 85℃에서는 0.07시간, 90℃에서는 0.03시간 경과시, Cb 유래 β-글루코시다아제의 활성도가 절반으로 줄어드는 것으로 확인된다(●: 70℃, ○: 75℃, ▲: 80℃, △: 85℃, ■: 90℃).

실시예 4: Cb 유래 β-글루코시다아제를 이용하여, 플라티코사이드 E로부터 플라티코딘 D의 제조

본 발명에서는 실시예 1에서 분리한 Cb 유래 β-글루코시다아제를 이용하여, 플라티코사이드 E로부터 플라티코딘 D를 제조하기 위하여, 다양한 농도의 Cb 유래 β-글루코시다아제(0.01 mg/ml 내지 0.4 mg/ml) 및 플라티코사이드 E 1 mg/ml가 함유된 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액(pH 5.5)을 80℃에서 30분 동안 반응시켰다.

그 결과, 도 4(a)에 나타난 바와 같이, Cb 유래 β-글루코시다아제의 농도가 증가함에 따라 플라티코딘 D의 생산성이 증가하는 것으로 확인된다. 다만, Cb 유래 β-글루코시다아제의 농도가 0.07 mg/ml 이상인 경우, 플라티코딘 D의 생산성 증가폭이 줄어드는 것으로 확인된다.

도 4(b)는 Cb 유래 β-글루코시다아제의 농도가 0.07 mg/ml인 경우, 반응 시간에 따른 플라티코사이드 E의 생산성을 나타낸 것으로, 100 분 내에 플라티코사이드 E 1 mg/ml가 플라티코딘 D 0.79 mg/ml로 100% 전환되었고, 시간 당 생산성은 0.47 g/l/h인 것으로 확인된다.

실시예 5: Cb 유래 β-글루코시다아제를 이용하여, 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물로부터 플라티코딘 D의 제조

본 발명에서는 실시예 1에서 분리한 Cb 유래 β-글루코시다아제를 이용하여, 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물로부터 플라티코딘 D의 제조에 앞서, 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물의 성분 함량을 분석하였다. 구체적으로, 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물은 MeOH 1 L에 100 g의 건조된 도라지 뿌리 가루를 넣고 80℃에서 12시간동안 추출한 후 필터링과 농축을 거쳐 1 L의 2차 증류수에 녹여져 제조되었다.

먼저, 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물의 성분 함량 분석 결과, 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물은 플라티코사이드 E 1.35 mg/ml, 플라티코딘 D3 0.05 mg/ml 및 플라티코딘 D 0.36 mg/ml를 함유하고 있는 것으로 분석된다.

이후, 다양한 농도의 Cb 유래 β-글루코시다아제(0.1 mg/ml 내지 1.2 mg/ml) 및 플라티코사이드 E 1 mg/ml가 되도록 농도 조절된 도라지 뿌리 메탄올 10% 추출물이 함유된 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액(pH 5.5)을 80℃에서 30분 동안 반응시켰다.

그 결과, 도 5(a)에 나타난 바와 같이, Cb 유래 β-글루코시다아제의 농도가 증가함에 따라 플라티코딘 D의 생산성이 증가하는 것으로 확인된다. 다만, Cb 유래 β-글루코시다아제의 농도가 0.5 mg/ml 이상인 경우, 플라티코딘 D의 생산성 증가폭이 줄어드는 것으로 확인된다.

도 5(b)는 Cb 유래 β-글루코시다아제의 농도가 0.5 mg/ml인 경우, 반응 시간에 따른 플라티코사이드 E의 생산성을 나타낸 것으로, 140 분 내에 플라티코사이드 E 1 mg/ml 및 플라티코딘 D3 0.0.038 mg/ml가 플라티코딘 D 0.82 mg/ml로 100% 전환되었고, 시간 당 생산성은 0.35 g/l/h(286 μM/h)이고, 효소 농도 당 생산성은 0.7 g/g/h(572 μmol/l/h)이며, 플라티코딘 D의 최종 농도는 1.1 mg/ml인 것으로 확인된다.

한편, 도라지 뿌리 추출물로부터 플라티코딘 D를 제조하는데 사용되는 효소로 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus usami) 유래 β-글루코시다아제가 공지되어 있는데, 이는 고온균 유래 효소에 해당하지 않을 뿐더러, 이의 시간 당 생산성은 200 μM/h에 불과한 것으로, 실시예 1에서 분리한 Cb 유래 β-글루코시다아제의 시간 당 생산성이 약 1.4 배 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 도라지 뿌리 추출물로부터 플라티코딘 D 및 디아피 플라티코딘 D(Deapi -platycodin D)를 동시에 제조하는데 사용되는 효소로 Snailase가 공지 되어 있는데, 이는 높은 시간 당 생산성을 보였으나, 이는 플라티코딘 D 및 디아피 플라티코딘 D를 합친 값에 불과할 뿐더러, 효소 농도당 생산성이 3.67 μmol/l/h에 불과한 것으로, 실시예 1에서 분리한 Cb 유래 β-글루코시다아제의 효소 농도 당 생산성이 약 156 배 우수함을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION FOR PRODUCING PLATYCODIN D AND METHOD FOR PRODUCING PLATYCODIN D <130> 1064911 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 1 Met Ser Leu Pro Lys Gly Phe Leu Trp Gly Ala Ala Thr Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asn Glu Asp Gly Lys Gly Glu Ser Ile Trp 20 25 30 Asp Arg Phe Thr His Gln Lys Gly Asn Ile Leu Tyr Gly His Asn Gly 35 40 45 Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Phe Glu Glu Asp Val Ser Leu 50 55 60 Met Lys Glu Leu Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ala 65 70 75 80 Arg Ile Phe Pro Asp Gly Phe Gly Thr Val Asn Gln Lys Gly Leu Glu 85 90 95 Phe Tyr Asp Arg Leu Ile Asn Lys Leu Val Glu Asn Gly Ile Glu Pro 100 105 110 Val Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Lys Leu Gln Asp Ile 115 120 125 Gly Gly Trp Ala Asn Pro Glu Ile Val Asn Tyr Tyr Phe Glu Tyr Ala 130 135 140 Met Leu Ile Val Asn Arg Tyr Lys Asp Lys Val Lys Lys Trp Ile Thr 145 150 155 160 Phe Asn Glu Pro Tyr Cys Ile Ala Phe Leu Gly His Phe Tyr Gly Val 165 170 175 His Ala Pro Gly Ile Lys Asp Phe Lys Val Ala Met Asp Val Val His 180 185 190 Asn Ile Met Leu Ser His Phe Lys Val Val Lys Ala Val Lys Glu Asn 195 200 205 Asn Ile Asp Val Glu Val Gly Ile Thr Leu Asn Leu Thr Pro Val Tyr 210 215 220 Phe Gln Thr Glu Arg Leu Gly Tyr Lys Val Ser Glu Ile Glu Arg Glu 225 230 235 240 Met Val Asn Leu Ser Ser Gln Leu Asp Asn Glu Leu Phe Leu Asp Pro 245 250 255 Val Leu Lys Gly Ser Tyr Pro Gln Lys Leu Phe Asp Tyr Leu Val Gln 260 265 270 Lys Asp Leu Leu Glu Thr Gln Lys Val Leu Ser Met Gln Gln Glu Val 275 280 285 Lys Glu Asn Phe Val Phe Pro Asp Phe Leu Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr 290 295 300 Arg Ala Val Arg Leu Tyr Asp Glu Asn Ser Asn Trp Ile Phe Pro Ile 305 310 315 320 Arg Trp Glu His Pro Ala Gly Glu Tyr Thr Glu Met Gly Trp Glu Val 325 330 335 Phe Pro Gln Gly Leu Tyr Asp Leu Leu Ile Trp Ile Lys Glu Ser Tyr 340 345 350 Pro Gln Ile Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Asn Asp 355 360 365 Lys Val Glu Asp Gly Arg Val His Asp Gln Lys Arg Val Glu Tyr Leu 370 375 380 Lys Gln His Phe Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ile Glu Asn Gly Val Asp 385 390 395 400 Leu Arg Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ala 405 410 415 Met Gly Tyr Thr Lys Arg Phe Gly Val Ile Tyr Val Asp Tyr Glu Thr 420 425 430 Gln Lys Arg Ile Lys Lys Asp Ser Phe Tyr Phe Tyr Gln Gln Tyr Ile 435 440 445 Lys Glu Asn Ser 450 <210> 2 <211> 1359 <212> DNA <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 2 atgagtttac caaaaggatt tctgtggggt gctgcaactg catcatatca gattgagggt 60 gcttggaatg aagatggaaa aggtgaatct atatgggaca ggtttacaca tcaaaaagga 120 aatattttat atggtcataa tggcgacgtt gcctgtgacc actatcatag gttcgaagaa 180 gatgtctctc ttatgaaaga acttggacta aaagcctaca ggttttctat tgcatgggcg 240 agaatttttc cagatggttt cggtactgtg aatcaaaaag gtcttgagtt ttatgataga 300 ctcatcaaca agcttgttga aaacggtatt gaaccggttg tcaccattta tcactgggat 360 cttcctcaaa agctacaaga cattggcggt tgggcaaacc cagaaattgt aaattattat 420 tttgaatatg caatgcttat cgtaaaccgt tataaagaca aagtaaaaaa atggataaca 480 tttaatgaac cttattgtat tgcctttttg ggacactttt atggagttca tgcaccagga 540 ataaaagact ttaaagttgc aatggatgtt gtgcacaaca ttatgctttc tcattttaag 600 gttgtaaaag ctgtaaagga aaacaatatt gatgttgagg taggaattac actaaattta 660 actccagttt actttcaaac agagcgtctt ggatataagg taagcgaaat tgaaagagaa 720 atggtaaacc tcagcagcca gcttgacaat gaacttttcc ttgatccagt actcaaagga 780 agctatccac aaaagctgtt tgattacctt gttcaaaaag atttgttgga aactcaaaaa 840 gtattgagta tgcagcagga agtaaaagaa aatttcgttt ttcctgattt tcttggtatc 900 aactactata cacgtgctgt caggctttac gatgaaaatt ctaactggat atttccaata 960 agatgggaac atcctgcagg agagtacacc gagatgggct gggaagtgtt cccacaagga 1020 ctttatgatc ttttgatttg gattaaagaa agttacccac aaattccaat ttatataaca 1080 gaaaacggtg ctgcttataa cgacaaggta gaagatggaa gagttcatga ccaaaagaga 1140 gtggagtatt taaaacagca ctttgaagca gcaagaaagg caattgaaaa tggagtggat 1200 ttgcgaggtt attttgtgtg gtctttgttg gacaatcttg aatgggcaat gggttataca 1260 aaaaggtttg gagttatata tgtggactat gaaacccaaa aaaggattaa aaaagacagc 1320 ttctattttt atcagcagta tataaaggaa aactcataa 1359

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 포함하는
플라티코딘 D 제조용 조성물.
제1항에 있어서.
상기 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제의 농도는 0.01 mg/ml 내지 5.00 mg/ml인
플라티코딘 D 제조용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 플라티코사이드 E; 또는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3 및 플라티코딘 D 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 함유된 도라지 추출물을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것인
플라티코딘 D 제조용 조성물.
서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는
플라티코딘 D 제조용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느한 항에 따른 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는
플라티코딘 D 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 기질은 플라티코사이드 E; 또는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3 및 플라티코딘 D로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 함유된 도라지 추출물을 포함하는
플라티코딘 D 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 처리는 pH 4.5~6.5 및 70~90℃ 조건에서 수행되는 것인
플라티코딘 D 제조방법.
서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라티코딘 D 제조용 재조합 발현 벡터.
숙주세포에 제8항에 따른 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체.