KR19990032601A - 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장, 유장 단백질 재료, 아글루콘 이소플라본 재료, 제니스테인 함량이 높은재료 및 다이드제인 함량이 높은 재료 및 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법 - Google Patents

아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장, 유장 단백질 재료, 아글루콘 이소플라본 재료, 제니스테인 함량이 높은재료 및 다이드제인 함량이 높은 재료 및 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장, 유장 단백질 재료, 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 및 아글루콘 이소플라본 재료 뿐만 아니라, 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법을 제공한다. 식물성 단백질 유장내의 이소플라본 복합체는 소정 온도와 pH에서 전환반응을 실시하기에 충분한 시간동안 유장을 처리하므로써 이소플라본 글루코시드로 전환된다. 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장을 생성하는 효소 반응에 의해 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시킨다. 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장으로부터 회수한다. 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 및 아글루콘 이소플라본 재료를 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료의 알콜 추출물로부터 제조한다.

Description

아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장, 유장 단백질 재료, 아글루콘 이소플라본 재료, 제니스테인 함량이 높은 재료 및 다이드제인 함량이 높은 재료 및 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법
본 발명은 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장, 아글루콘 이소플라본이 풍부한 유장 단백질 재료, 아글루콘 이소플라본 재료, 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 및 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이소플라본은 대두와 같은 식물성 단백질 재료를 비롯한 여러 가지 콩과 식물에서 산출된다. 이들 화합물로는 다이드진, 6"-OAc 다이드진, 6"-OMal 다이드진, 다이드제인, 제니스틴, 6"-OAc 제니스틴, 6"-OMal 제니스틴, 제니스테인, 글리시틴, 6"-OAc-글리시틴, 6"-OMal 글리시틴, 글리시테인, 바이오카닌 A, 포르모노넥틴 및 쿠메스트롤을 들 수 있다. 전형적으로, 이들 화합물들은 대두 본래의 쓴 맛과 관련되어 있다.
식물성 단백질 분리물 및 농축물과 같은 통상의 제품의 제조시에, 이러한 물질을 제거하는 것에 관심이 모아졌었다. 예를들면, 대두 플레이크를 수성 알칼리 매체로 추출하는 대두 단백질 분리물의 제조에 대한 통상의 방법으로는, 대부분의 이소플라본을 대두 단백질과 함께 추출물내에 가용화시킨다. 단백질은 추출물의 산성화에 의해 추출물로부터 침전, 분리되어 분리물을 형성하며, 대부분의 가용화된 이소플라본이 보유되어 있는 유장이 남게 된다. 산 침전된 단백질 분리물내에 남아 있는 잔류 이소플라본은 대개 분리물을 완전 세척에 의해 제거한다. 유장 및 세척물은 대개 폐기된다. 식물성 단백질 유장내의 이소플라본은 이소플라본 글루코시드(글르콘), 이소플라본 복합체 및 아글루콘 이소플라본이 포함된다. 이소플라본 글루코시드는 화합물의 이소플라본 부분에 부착된 글루코스 분자를 갖는다. 이소플라본 복합체는 글루코스 분자에 결합된 부가의 부분을 포함하며, 예를들면, 6"-OAc 제니스틴이 글루코스 문자의 6 위치에 결합된 아세테이트 기를 포함한다. 아글루콘 이소플라본은 결합된 글루코스 분자를 포함하지 않는 이소플라본 부분으로 구성된다.
대두 유장은 글루코시드, 복합체 및 아글루콘에 해당하는 이소플라본 화합물의 "족" : 제니스테인 족, 다이드제인 족 및 글리시테인 족을 포함한다. 제니스테인 족에는 글루코시드 제니스테인; 복합체 6"-OMal 제니스틴(제니스틴의 6"-말로네이트 에스테르) 및 6"-OAc 제니스틴(제니스틴의 6"-아세테이트 에스테르); 및 아글루콘 제니스테인이 있다. 다이드제인 족에는 글루코시드 다이드진; 복합체 6"-OMal 다이드진 및 6"-OAc 다이드진 및 아글루콘 다이드제인이 있다. 글리시테인 족에는 글루코시드 글리시틴, 복합체 6"-OMal 글리시틴 및 아글루콘 글리시테인이 있다.
모든 이소플라본은 의료적 평가로 관심이 높으며, 아글루콘은 가장 많은 관심을 갖고 있는 특이성 이소플라본이다. 제니스테인 및 다이드제인은 심혈관 위험 인자를 크게 감소시킬 수 있다. 참고 문헌["Plant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma Lipids of Female Monkeys", Circulation, vol. 90, 1259페이지(1994년 10월)]. 제니스테인 및 다이드제인은 폐경기 또는 월경전 징후와 같이 여성의 내인성 에스트로겐 수치의 감소 또는 변경에 의해 야기되는 상태의 징후를 감소시키는 것으로 판단된다. 부가로, 최근에 확인된 바에 따르면, 아글루콘 이소플라본은 인간 암세포, 예를 들어 유방암 세포 및 전립선암 세포의 성장을 억제할 수 있다[참조: 피터슨 및 반즈, Biochemical and Biophysical Research, Communications, Vol. 179, No. 1, pp. 661-667 (1991년 8월 30일)의 "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene"이란 제하의 논문; 피터슨 및 반즈, The Prostate, Vol. 22, pp. 335-345 (1993)의 "Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation"이란 제하의 논문; 반즈 일동, Mutagens and Carcinogens in the Diet, pp. 239-253 (1990)의 "Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer"이란 제하의 논문].
이미 기술한 바와 같이, 아글루콘 이소플라본은 다이드제인, 제니스테인 및 글리시테인 등을 포함한다. 아글루콘 이소플라본의 구조식은 하기 화학식 1과 같다:
상기 식에서,
R1, R2, R3및 R4는 H, OH 및 OCH3으로 구성되는 군으로부터 선택할 수 있다. 제니스테인은 R1이 OH 이고, R2가 H 이고, R3이 OH 이고, R4가 OH 인 상기 화학식 1의 화합물이고, 다이드제인은 R1이 OH 이고, R2가 H 이고, R3이 H 이고, R4가 OH 인 상기 화학식 1의 화합물이고, 글리시테인은 R1이 OH 이고, R2가 OCH3이고, R3이 H 이고, R4가 OH 인 상기 화학식 1의 화합물이다.
그러므로, 본 발명의 아글루콘 및 식물성 단백질 유장 및 상기 화합물을 포함하는 유장 단백질의 농축물 및, 특히 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 및 아글루콘 이소플라본 재료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아글루콘이 풍부한 식물성 단백질 유장, 아글루콘이 풍부한 식물성 유장 단백질 재료, 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 및 아글루콘 이소플라본 재료의 제조 방법에 관한 것이다.
식물성 단백질 이소플라본 복합체의 아글루콘 이소플라본으로의 전환 방법은 공지되어 있으며, 현재 계류중인 미국 출원 번호 제 08/477,102 호(1995년 6월 7일에 출원, 본 출원의 양수인 소유임)에 기술되어 있다. 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키는 방법은 잘 알려져 있다. 식물성 단백질 유장내에서 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키는 방법은 본 발명의 양수인 소유의 계류중인 PCT 특허 출원 제 PCT/US94/10699 호에 기재되어 있다.
이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키는 당업계에 공지된 다른 방법은 예를 들어 일본 특허 출원 제 258,669 호(오바타 등)에 기술되어 있다. 상기 방법들은 이소플라본 복합체를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키는 방법을 제공하지 않거나, 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 또는 아글루콘 이소플라본 재료를 제공하지 않는다. 또한, 이들 방법은 글루코시드를 아글루콘으로 전환시키는데 있어서 단지 중간 정도의 전환율을 획득할 수 있을 뿐이고, 이러한 중간 정도의 전환율을 획득하기 위해서 실질적인 시간을 필요로 한다. 따라서, 이러한 방법은 규모가 큰 상업적 조작에는 바람직하지 못하다.
본 발명의 제 1 목적은 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장 및, 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 제 2 목적은 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료 및, 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 제 3 목적은 제니스테인 함량이 높은 재료 및, 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 제 4 목적은 다이드제인 함량이 높은 재료 및, 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 제 5 목적은 아글루콘 이소플라본 재료 및, 식물성 단백질 유장으로부터 이들을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
이러한 목적 및 기타의 목적은 하기에 기재된 본 발명의 상세한 설명에 의해 상세하게 기재될 것이다.
본 발명은 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장 및, 이소플라본 복합체를 포함하는 식물성 단백질 유장으로부터 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장을 생성해 내는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 이소플라본 복합체가 이소플라본 글루코시드로 전환되는데 충분한 시간동안 소정의 온도 및 pH 에서 이소플라본 복합체를 포함하는 식물성 단백질 유장을 처리하는 것을 포함한다. 효소는 식물성 단백질 유장내의 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환하기에 충분한 소정의 시간동안 소정의 pH 및 온도에서 식물성 단백질 유장내의 이소플라본 글루코시드와 접촉시킨다.
본 발명의 한 구체예에서, 식물성 단백질 유장을 약 2℃ 내지 약 121℃의 온도에서 약 6 내지 약 13.7의 pH 에서 처리하여 이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환시킨다.
본 발명의 한 구체예에서, 이소플라본 글루코시드를 식물성 단백질 유장내의 효소와 약 5℃ 내지 약 75℃의 온도에서 약 3 내지 약 9 의 pH 에서 접촉시켜 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시킨다.
이소플라본 복합체가 이소플라본 글루코시드로, 이소플라본 글루코시드가 아글루콘 이소플라본으로 높은 전환률로 전환시킬 수 있다. 한 구체예에서, 80% 이상의 이소플라본 복합체는 이소플라본 글루코시드로 전환되며, 80% 이상의 이소플라본 글루코시드이 아글루콘 이소플라본으로 전환된다.
본 발명의 제 1 특징은 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료 및, 이소플라본 복합체를 포함하는 식물성 단백질 유장으로부터 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 단백질 및 아글루콘 이소플라본을 포함하는 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 아글루콘이 풍부한 식물성 단백질 유장으로부터 회수한다. 본 발명의 한 구체예에서, 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료는 한외여과, 열 응고 및 탈수중 하나에 의해 회수된다.
본 발명의 제 2 특징은 제니스테인 함량이 높은 재료 및, 제니스테인 함량이 높은 재료를 이소플라본 복합체를 포함하는 식물성 단백질 유장으로부터 제조하는 방법에 관한 것이다. 식물성 단백질 유장으로부터 유도된 아글루콘 이소플라본 유장 단백질을 수성 알콜 추출제로 추출하여 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조했다. 제니스테인 함량이 높은 재료를 상기 추출물로부터 분리하기에 충분한 시간동안 추출물을 흡착제 재료와 접촉시킨다.
본 발명의 제 3 특징은 다이드제인 함량이 높은 재료 및, 다이드제인 함량이 높은 재료를 이소플라본 복합체를 포함하는 식물성 단백질 유장으로부터 제조하는 방법에 관한 것이다. 식물성 단백질 유장으로부터 유도된 아글루콘 이소플라본 유장 단백질을 수성 알콜 추출제로 추출하여 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조했다. 다이드제인 함량이 높은 재료를 상기 추출물로부터 분리하기에 충분한 시간동안 추출물을 흡착제 재료와 접촉시킨다.
본 발명의 제 4 특징은 아글루콘 이소플라본 재료 및, 아글루콘 이소플라본 재료를 이소플라본 복합체를 포함하는 식물성 단백질 유장으로부터 제조하는 방법에 관한 것이다. 식물성 단백질 유장으로부터 유도된 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 수성 알콜 추출제로 추출하여 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조했다. 추출제를 초기 부피의 약 15% 내지 약 30%로 농축시키고, 추출물에 물을 첨가하여 아글루콘 이소플라본 재료를 침전시켰다.
본 발명의 한 구체예에서, 제니스테인 함량이 높은 재료는 아글루콘 이소플라본 재료로부터 분리된다. 아글루콘 이소플라본 재료는 알콜 수용액에 용매화되며, 알콜 수용액을 제니스테인 함량이 높은 재료를 분리하기에 충분한 시간동안 흡착제 재료와 접촉시킨다.
본 발명의 한 구체예에서, 다이드제인 함량이 높은 재료는 아글루콘 이소플라본 재료로부터 분리된다. 아글루콘 이소플라본 재료는 알콜 수용액에 용매화되며, 알콜 수용액을 다이드제인 함량이 높은 재료를 분리하기에 충분한 시간동안 흡착제 재료와 접촉시킨다.
이러한 방법에서의 출발 물질은 식물성 단백질 유장이며, 이때, 식물성 단백질 유장은 가용성 단백질, 이소플라본 및 식물성 단백질 추출물로부터 식물성 단백질 응유를 제거한 후 잔류하는 기타 수용성 화합물로서 정의된다. 바람직한 구체예에서, 상기 출발 물질은 대두 유장인데, 그 이유는 상기 방법이 대두 재료로부터 아글루콘 이소플라본이 풍부한 유장 및 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료, 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 및 아글루콘 이소플라본 재료를 제조하는데 특히 적합하기 때문이다.
식물성 단백질 유장 출발 물질은 이소플라본 복합체, 이소플라본 글루코시드 및 아글루콘 이소플라본을 포함한다. 예를들면, 대두 유장은 이소플라본-글루코시드-제니스틴, 다이드진 및 글리시틴; 이소플라본 복합물-제니스틴, 다이드진 및 글리시틴의 6"-말로네이트 에스테르 및, 제니스틴 및 다이드진의 6"-아세테이트 에스테르; 및 아글루콘 이소플라본-제니스테인, 다이드제인 및 글리시테인을 포함한다. 대두 유장 출발 물질내의 이소플라본은 주로 이소플라본 복합체이다.
식물성 단백질 유장 출발 물질은 대개 통상의 식물성 단백질 분리 제조 방법의 부산물로서 수득될 수 있다. 식물성 단백질 원, 예를들면, 용매 추출에 의해 오일이 제거된 대두 플레이크를 식물성 단백질 원내의 단백질의 등전점 이상의 pH 를 갖는 수성 추출제로 처리하여 단백질, 이소플라본 및, 기타 추출물에 의해 식물성 단백질 원으로부터 가용화된 기타 화합물을 제조할 수 있다. 추출물은 추출물내에서 용해되지 않은 식물성 재료로부터 분리된다. 가용화된 단백질 및 이소플라본을 포함하는 추출물의 pH 를 단백질의 등전점 이상, 대두 단백질의 경우, 약 pH 4.4∼4.6 으로 조절하여 추출물로부터 단백질을 침전시킨다. 침전된 단백질을 분리하여 식물성 단백질 분리물을 생성하고, 식물성 단백질 유장 출발 물질을 남긴다. 대부분의 이소플라본은 유장내에서 가용화된다. 유장내에서 이소플라본의 회수를 최대화하기위해, 침전된 단백질의 부가의 세척이 바람직할 수 있으며, 각각의 세척액을 유장에 첨가한다.
식물성 단백질 유장 출발 물질을 물에서 슬러리 처리한 식물성 단백질 유장을 분무 건조시킬 수 있다. 취급을 용이하게 하기 위해, 식물성 단백질 유장을 분무 건조시켜 유장 단백질(단백질 분리물을 침전시킨 후에도 단백질은 여전히 유장내에 용해되어 있음), 이소플라본 및 고체 재료로서의 기타 화합물을 회수할 수 있다. 분무 건조된 재료를 물에 첨가하여 식물성 단백질 유장 출발 물질을 재구성시킬 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 슬러리는 100g의 물에 약 2∼10g의 분무 건조된 재료를 포함하여 유장의 점도가 너무 크지 않게 하면서 소정의 아글루콘 이소플라본이 풍부한 유장, 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료, 제니스테인 함량이 높은 재료, 다이드제인 함량이 높은 재료 및 아글루콘 이소플라본 재료를 제조하기에 충분한 이소플라본을 제공한다.
제 1 전환 단계 또는 조작동안, 식물성 단백질 유장 출발 물질내의 이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환시켜 이소플라본 글루코시드가 풍부한 식물성 단백질 유장을 제조한다. 전환율은 유장의 pH 및 온도에 따라 다르다는 것을 알 수 있다.
이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환시키기 위한 pH 범위는 약 6 내지 약 13.5 이다. 식물성 단백질 유장의 pH 는 필요할 경우, 소정의 pH 로 조절해야만 한다. 대두 단백질 유장은 대개 pH 가 약 4.4∼4.6 이며, 이는 소정의 pH 범위로 베이스 또는 염기성 시약으로 조절되어야만 한다. pH 는 시스템의 pH 를 증가시키는 임의의 적절한 베이스, 가성 제제 또는 염기성 제제, 예를들면, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 및 수산화 칼슘으로 조절될 수 있다. 비교적 강한 염기성 조건하에서, 바람직하게는 pH 9∼11에서 더욱 용이하게 전환 반응이 진행되는 것으로 밝혀졌다. pH 는 pH 12 이하로 유지되어야만 하는데, 이는 이소플라본 글루코시드-제니스틴, 다이드진 및 글리시틴, 특히 다이드진이 pH 12 이상에서는 변성되는 경향이 있기 때문이다. 반응은 낮은 pH 조건하, 예를들면, 약 pH 6에서는 덜 용이하게 진행되지만, 반응은 고온 및/또는 승압하에서 진행된다.
이소플라본 복합체의 이소플라본 글루코시드로의 전환에 대한 온도 범위는 약 2℃ 내지 약 121℃ 이다. 전환 반응이 용이하게 일어나는 온도는 유장의 pH 에 따라 다르다. 본 발명자들은 pH가 비교적 높은 경우, 낮은 온도에서 전환 반응이 용이하게 일어나는 것을 알았다. 예를들면, 약 11의 유장 pH 에서, 전환 반응은 약 5℃ 내지 약 50℃ 의 온도 범위내에서 용이하게 그리고 효율적으로 일어난다. 약 9 의 유장 pH에서는 약 45℃ 내지 약 73℃의 온도 범위내에서 효율적으로 전환 반응이 일어난다. 유장 pH가 비교적 낮은 경우, 전환 반응은 고온에서 일어난다. 예를들면, 6의 유장 pH에서, 약 80℃ 내지 약 121℃ 온도 범위에서 전환 반응이 일어난다. 바람직한 구체예에서, 전환 반응은 약 11의 유장 pH 에서 약 35℃에서 일어난다. 다른 바람직한 구체예에서, 전환 반응은 약 9의 유장 pH에서 약 73℃의 온도에서 실시된다.
이소플라본 복합체의 이소플라본 글루코시드로의 거의 완전한 전환 반응에 대한 시간은 식물성 단백질 유장의 pH 및 온도에 따라 다르다. 시간은 15분 내지 24시간이다. 전환 반응은 더 높은 pH 및 고온에서 급속하게 일어난다. 약 9∼10의 pH에서, 전환 반응은 73℃에서 약 4 내지 약 6 시간동안 거의 완전하게 일어난다. 약 10∼11의 pH에서, 전환 반응은 35℃에서 약 30분 내지 1시간동안 거의 완전하게 일어난다. 바람직한 구체예에 있어서, 약 45분동안, 약 11의 pH 및 약 35℃의 온도에서 이소플라본 복합체가 이소플라본 글루코시드로 전환된다.
제 1 전환 단계는 약 80% 내지 약 100%의 이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환하는데 있어서 매우 효율적이다. 특히 95% 이상의 전환율이 관찰된다. 이러한 높은 전환율은 특히 대량의 상업적 조작시에 매우 유용하다.
제 2 전환 단계 또는 조작시에, 제 1 단계에서 제조된 이소플라본 글루코시드 뿐 아니라, 유장내에 이미 존재하는 이소플라본 글루코시드는 효소 반응에 의해 아글루콘 이소플라본으로 전환된다. 전환 반응은 이소플라본 글루코시드가 풍부한 유장으로부터 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장을 생성해 낸다.
제 2 전환 단계는 유장내에 존재하는 효소의 농도 및 이의 특성에 따라 다르다는 것을 알았다. 전환 반응을 실시하는데 필요한 효소는 이소플라본 부분 및 이소플라본 글루코시드의 글루코스 분자사이의 글루코시드 결합을 분해할 수 있는 효소이다. 바람직한 구체예에 있어서, 효소는 1,4-글루코시드 결합을 분해할 수 있는 당 효소이다. 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키는데 필요한 효소의 농도는 유장내에 존재하는 효소의 유형을 비롯한 다양한 인자, 효소 농도의 분포, 효소의 활성, 이소플라본 글루코시드의 농도 및, 전환 반응동안 유장의 pH 및 온도에 따라 다르다.
효소는 유장내의 미생물의 성장으로부터 존재하는 식물성 단백질 유장내에 자연적으로 존재할 수 있거나, 또는 유장에 대한 보충물로서 첨가될 수 있다. 자연적으로 존재하거나 또는 유장내의 미생물의 성장으로부터 존재하는 효소는 "잔류" 효소로 불리우며, 유장에 첨가된 효소는 "보충" 효소로 불리운다.
충분한 효소가 적어도 대부분의, 바람직하게는 거의 모든 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키도록 유장내에 존재해야만 한다. 일반적으로, 유장내의 잔류 효소는 전환 반응을 실시하기에는 불충분해서, 보충 효소를 유장에 첨가해야만 한다. 상기 언급된 바와같이, 효소가 적절한 농도로 존재하여 전환 반응을 실시하느냐의 여부에 대해 다양한 인자를 측정한다.
보충 효소를 첨가할 경우, 보충 효소는 존재하는 효소의 총 농도가 건조 중량을 기준으로 하여 유장 고체의 약 0.1중량% 내지 약 10중량%가 되도록 첨가해야 한다. 바람직한 구체예에 있어서, 보충 효소는 충분한 잔류 효소가 유장내에 존재하느냐와 무관하게 유장에 첨가되어야 하는데, 이는 보충 효소의 첨가가 글루코시드를 아글루콘으로 거의 완전하게 전환시키는데 필요한 시간을 크게 감소시킨다.
보충 효소는 소정의 pH 및 온도 조건 및 비용 효율성 면에서 최적의 활성을 기준으로 선택된다. 보충 효소는 이소플라본 부분 및 이소플라본 글루코시드의 글르코스 부분사이의 결합을 분해할 수 있는 효소이며, 예를들면, 1,4-글루코시드 결합을 분해할 수 있는 당 효소이다. 바람직한 보충 효소는 시판되는 α- 및 β-글루코시다아제 효소, β-갈락토시다아제 효소, 글루코-아밀라아제 효소 및 펙티나아제 효소이다. 특히 바람직한 효소의 예로는 바이오펙티나아제 100L(약 3 내지 약 6의 pH 에서 사용하는 것이 바람직함), 바이오펙티나아제 300L(최적 pH 는 약 3 내지 약 6 임), 바이오펙티나아제 OK 70L(최적 pH 는 약 3 내지 약 6 임), 바이오락타아제 30,000(최적 pH 는 약 3 내지 약 6 임), 뉴트랄 락타아제(최적 pH 는 약 6 내지 약 8 임), 미국, 플로리다 34243, 사라소타, 포스트 오피스 박스 3917, 57번가 1833에 소재하는 퀘스트 인터내쇼날에서 시판되는 모든 효소를 들 수 있다. 또한, 특히 바람직한 효소는 미국, 버지니아 22974, 트로이, 포스트 오피스 박스 1000에 소재하는 아마노 인터내쇼날 엔자임 컴패니, 인코오포레이티드에서 시판되는 락타아제 F(최적 pH 는 약 4 내지 약 6 임) 및 락타아제 50,000(최적 pH 는 약 4 내지 약 6 임)이다. 기타 특히 바람직한 보충 효소로는 미국, 뉴욕 10121, 뉴욕, 스윗 2439, 펜 플라자 2에 소재하는 엔자임 디벨로프먼트 코오포레이숀에 시판되는 G-자임 G990(최적 pH 는 약 4 내지 약 6 임) 및 엔제코 펑갈 락타아제 농축물(최적 pH 는 약 4 내지 약 6 임); 미국, 코네티컷 06813, 댄버리, 터너 로드 33에 소재하는 노보 노르디스크 바이오인더스트리얼즈, 인코오포레이티드에서 시판되는 락토자임 3000L(최적 pH 는 약 6 내지 약 8 임) 및 α-갈 600L(최적 pH 는 약 4 내지 약 6.5 임); 미국, 뉴욕 10017, 뉴욕, 이스트 42번가 205에 소재하는 화이자 푸드 사이언스 그룹에서 시판되는 뉴트랄 락타아제(최적 pH 는 약 6 내지 약 8 임); 미국, 펜실베니아 19406, 킹 오브 프러시아에 소재하는 지스트 브로캐드즈 푸드 인그리디언츠, 인코오포레이티드에서 시판되는 막실락트 L2000(최적 pH 는 약 4 내지 약 6 임)를 들 수 있다.
일단 충분한 농도의 효소가 존재하면, 잔류 효소, 보충 효소, 또는 둘다로부터 효소는 적어도 대부분의, 바람직하게는 거의 모두의 이소플라본 글루코시드가 아글루콘 이소플라본으로 전환되기에 충분한 시간동안 소정의 pH 및 온도에서 유장내의 이소플라본 글루코시드와 접촉하게 된다. 필요할 경우, 이소플라본 글루코시드가 풍부한 유장의 pH 는 효소가 이소플라본 글루코시드와 활성적으로 반응하게 되는 pH 범위내로 조절해야만 한다. 혼합 잔류 효소 및 보충 효소가 이소플라본 글루코시드와 반응하게 되는 pH 범위는 약 3 내지 약 9 이다.
본 발명자들은 유장의 pH 가 반응동안 감소되는 것으로 알려져 있을지라도, 유장내의 잔류 효소가 약 7 내지 약 9의 pH 범위내에서 활성을 지닌다는 것을 알았다. 보충 효소는 여러가지 특이성 효소에 대해 상기에 제시되어 있는 바와같이 효소 제조업자에 의해 명시되어 있는 최적의 pH 범위내에서 활성을 갖는다. 대개 보충 효소는 약 6 내지 약 8 의 중성 pH 범위, 또는 약 4 내지 약 6 의 산성 pH 범위내에서 활성을 띤다. 또한, 산성 효소는 약 3 의 pH 에서 활성을 갖는 것으로 나타났다.
유장의 pH 는 대부분의 경우에 있어서 하나이상의 적절한 아세트산, 황산, 인산, 염산 또는 임의의 적절한 제제의 첨가에 의해 제 1 단계의 비교적 높거나 또는 염기성인 pH 에서 감소되도록 조절될 수 있다. 사용된 제제는 식용 산성 제제 또는 산이 될 수 있다.
이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키는 온도 범위는 약 5℃ 내지 약 75℃이다. 온도는 효소의 활성에 크게 영향을 미치며, 그래서 전환율에 영향을 미치게 된다. 보충 효소는 72.5℃ 이상에서 활성을 띨 수 있으며, 예를들면, α-Gal 600L 은 75℃에서 활성을 띠지만, 효소 탈활성화 반응을 피하도록 낮은 온도에서 전환 반응을 실시하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 전환 반응은 약 35℃ 내지 약 45℃ 에서 실시하는 것이 바람직하다.
바람직하게는 효소 반응은 제 1 전환 단계의 온도와 동일한 온도에서 실시하여 제 1 전환 단계 이후에 유장의 온도를 변화시킬 필요가 없어졌다. 제 2 전환 단계 및 제 1 전환 단계는 모두 35℃에서 실시하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 이소플라본 글루코시드의 아글루콘 이소플라본으로의 전환 반응동안에는 일정한 온도를 유지하는 것이 바람직하다. 그러나, 몇몇의 경우에 있어서, 반응동안 온도를 승온, 감온 또는 변경시키는 것이 바람직할 수도 있다.
제 2 전환 단계에 필요한 시간은 효소와 관련된 인자, 특정 농도 및 유장의 온도 및 pH 에 따라 다르다. 대부분의 경우, 24시간 이내에 완전 전환 반응을 실시할 수 있으나, 보충 효소를 첨가하여 반응 속도를 크게 증가시키는 것이 바람직하다. 선택된 보충 효소, 효소 농도, pH 및 온도는 바람직하게는 2시간이내, 가장 바람직하게는 1 시간이내에 거의 완전한 전환 반응을 실시한다.
제 2 전환 단계에서의 이소플라본 글루코시드의 아글루콘 이소플라본으로의 전환도는 약 80% 내지 100%가 되는 것이 놀랍다. 이소플라본 글루코시드의 아글루콘 이소플라본으로의 95% 이상의 전환을 얻을 수 있다.
이소플라본 글루코시드의 아글루콘 이소플라본으로의 전환 반응 이후에, 아글루콘 이소플라본이 풍부한 유장을 유장내의 단백질의 건조 또는 제거없이 원하는 바에 따라 사용할 수 있거나 또는 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 회수하여 단백질 재료내의 아글루콘 이소플라본을 농축시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용된 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료는 식물성 단백질 유장으로부터 침전 및 분리될 수 있는 단백질, 아글루콘 이소플라본 및 잔류 식물성 화합물을 포함하는 재료로서 정의된다. 아글루콘 이소플라본이 풍부한 단백질 재료를 한외여과, 열 응고 및 탈수와 같은 통상의 절차에 의해 회수할 수 있다. 생성된 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 통상의 방법에 의해 탈수 및 건조시킬 수 있다.
아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료는 유장을 냉각시킴으로써 유장으로부터 회수될 수 있다. 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료는 냉각된 유장에 불용성이며, 냉각된 유장을 원심 분리하여 유장으로부터의 침전물로서 분리할 수 있다. 유장을 약 4℃로 냉각시켜 단백질 재료를 침전시키는 것이 바람직하다.
바람직한 실시예에 있어서, 유장을 농축시켜 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료의 회수를 촉진시킨다. 유장의 농축에 의해 고체 대 액체의 비를 증가시키는 것은 유장으로부터 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료의 포획을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 유장은 가열, 감압하에 유장을 배치하거나 또는 둘다에 의해 농축될 수 있다. 유장은 고체 대 액체의 비가 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1:6, 가장 바람직하게는 약 1:3 이다.
제니스테인 함량이 높은 재료 및 다이드제인 함량이 높은 재료는 회수된 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료로부터 제조할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와같이, 제니스테인 함량이 높은 재료는 잔류 식물성 재료와 함께, 40% 이상의 제니스테인, 가장 바람직하게는 90% 이상의 제니스테인을 포함하는 식물성 재료로서 정의되며, 상기 잔류 식물성 재료는 제니스테인 함량이 높은 재료가 대두 유장으로부터 회수되는 경우에는 잔류 대두 재료가 된다. 다이드제인 함량이 높은 재료는 잔류 식물성 재료와 함께 40% 이상의 다이드제인을 포함한다.
제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료를 제조하기 위해서, 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 초기에 세척하여 바람직하지 않은 염 및 당을 재거한 후, 건조했다. 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 세척하기 위해서, 재료를 물로, 바람직하게는 약 1% 고체 내지 약 6% 고체, 가장 바람직하게는 약 2% 고체의 물로 희석시켰다. 그러나, 세척 물은 임의의 온도의 것이 될 수 있으나, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게는 약 60℃이다. 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 세척한 후, 재료를 세척물로부터 분리하고 건조시킨다. 바람직한 구체예에서, 재료를 원심 분리하고, 상청액을 재료로부터 기울려 따라 버려서 재료를 분리한다.
아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 수성 알콜 추출제로 추출하여 유장 단백질로부터 아글루콘 이소플라본을 제거하고, 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조했다. 저 분자량 알콜, 예를들면, 메탄올, 특히 에탄올은 추출제의 알콜 성분으로서 바람직하다. 아글루콘 이소플라본은 추출제의 거의 모든 알콜 농도에서 가용성인 것으로 밝혀졌다. 아글루콘 이소플라본은 특히 추출제가 약 30%의 알콜 내지 약 90%의 알콜, 가장 바람직하게는 약 60%의 알콜 내지 약 80%의 알콜을 포함하는 경우에 가용성이 된다. 수성 알콜이 바람직한 용매일 경우, 물, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 아세톤 및 에틸 아세테이트 및 이들 용매의 혼합물을 비롯한 기타의 용매를 사용하여 유장 단백질 재료로부터 아글루콘 이소플라본을 추출할 수 있다.
추출은 소량의 추출제를 사용하여 실시한다. 추출제 대 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료의 중량비가 11:1을 넘지 않도록 하는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 재료는 추출제 대 재료의 중량비가 약 6:1 내지 약 8:1 인 역 추출 방법을 사용하여 추출할 수 있다. 다른 구체예에서, 재료는 추출제 대 재료의 중량비 합이 11:1 을 넘지 않는 추출제의 두 분획으로 추출할 수 있다.
추출을 임의의 pH 에서 실시할 수 있을지라도, 추출제는 추출제내의 단백질의 용해도를 최소로 하는 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료내의 단백질의 등전점의 pH 를 갖는 것이 바람직하다. 추출제는 유장 단백질이 대두 유장 단백질인 경우 pH 가 바람직하게는 약 3 내지 약 6, 가장 바람직하게는 약 4.5 이다.
추출은 추출제의 비점 이하의 임의의 온도, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 70℃의 온도에서 실시할 수 있다. 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료로부터 아글루콘 이소플라본을 추출하는데 소요되는 시간을 감소시키기 위해, 바람직하게는 실온 이상, 가장 바람하게는 약 60℃의 온도에서 추출을 실시하는 것이 바람직하다.
추출 이후에, 추출물로부터 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료를 분리하기에 충분한 시간동안 추출물을 흡착제 재료와 접촉시켜 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물로부터 제니스테인 함량이 높은 재료 및 다이드제인 함량이 높은 재료를 분리할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료를 역상 고 성능 액체 크로마토그래피("HPLC")에 의해 추출물로부터 분리한다. 제니스테인, 다이드제인, 기타 이소플라본 및 불순물이 분리 가능하게 결합되어 있는 흡착제로 이루어진 입자를 통해 화합물에 특이적인 방식으로 상기 추출물을 용출시켜 상기 화합물 각각을 분리시키므로써 상기 추출물내의 기타 이소플라본 및 불순물로부터 제니스테인 및 다이드제인을 분리한다.
아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물은 초기 여과되어 HPLC 칼럼을 막을 수 있는 불용성 물질을 제거한다. HPLC 칼럼은 화합물에 특이적인 방식으로 제니스테인, 다이드제인, 기타 이소플라본 및 불순물을 분리 가능하게 결합할 입자형 흡착재로 시판되는 종래의 HPLC 칼럼을 충전하므로써 제조된다. 상기 흡착재는 임의의 역상 HPLC 충전 물질일 수도 있으나, 바람직한 충전재는 하중 용량, 분리 효율성 및 비용을 고려한 기준에 따라 선택할 수 있다. 바람직한 충전재의 하나는 스웨덴에 소재하는 에카 노벨, 노벨 인더스트리즈에서 시판되는 크로마실 C18 16㎛ 100Å 비이드이다.
여과된 추출물은 충전된 HPLC 칼럼의 모든 결합 부위가 상기 칼럼으로 용출한 용출액내의 이소플라본의 외관에 의해 검출되는 이소플라본으로 완전히 포화될 때 까지 상기 칼럼으로 통과시킨다. 이어서, 상기 HPLC 칼럼은 극성 용출제로 용출하여 분리한다. 바람직한 구체예에서, 상기 용출제는 수성 알콜이다. 상기 수성 알콜 용리제의 알콜 함량은 약 30 내지 약 90% 알콜이며, 이소플라본의 양호한 분리 및 양호한 용해도 둘 다를 제공하는 약 50%의 알콜 함량이 바람직하다. 상기 알콜은 메탄올 또는 에탄올이 바람직하며, 제니스테인 함량이 높거나 또는 다이드제인 함량이 높은 생성물을 식품 또는 약학적 용도로 사용하는 경우에는 에탄올이 바람직하다.
상기 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료는 상기 칼럼 용출액으로부터 수거한다. 다이드제인을 포함하는 용출물 분획을 제 1 칼럼에서 용리시킨 후, 글리시테인 분획을 용리시키고, 더 극성인 제니스테인 분획을 용리시킨다. 다이드제인 및 제니스테인 분획은 이들이 칼럼으로부터 용출될 때 수거한다. 필요에 따라, 상기 제니스테인 분획도 수거한다.
상기 분획내의 알콜은 증발 제거하고, 이어서 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료는 원심분리 또는 여과와 같은 통상적인 분리 방법에 의해 회수할 수 있다. 회수된 제니스테인 함량이 높은 재료는 40% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 제니스테인을 잔류 식물성 재료와 함께 함유하는데, 상기 제니스테인이 대두 유장으로부터 회수되는 경우, 상기 잔류 식물성 재료는 잔류 대두 재료가 된다. 회수된 다이드제인 함량인 높은 재료는 대개 대량의 글리시테인을 포함하는 잔류 식물성 재료와 함께 40% 이상의 다이드제인을 함유한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 아글루콘 이소플라본 재료는 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물로부터 제조한다. 본 명세서에서 사용된 바와같이, 아글루콘 이소플라본 재료는 10% 이상의 제니스테인 및 5% 이상의 다이드제인 뿐 아니라, 기타 이소플라본 및 잔류 식물성 화합물을 포함하는 재료로서 정의된다.
아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 추출한 후, 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 농축시켜 추출물로부터의 아글루콘 이소플라본의 침전을 용이하게 한다. 추출물을 가열하고, 추출물을 감압하에 두거나 또는 둘다에 의해 추출물을 농축시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 추출물은 초기 부피의 약 15% 내지 약 30%로 농축된다.
아글루콘 이소플라본 재료는 추출물에 물을 첨가하여 추출물로부터 아글루콘 이소플라본 재료를 침전시킨다. 바람직한 구체예에서, 약 6 내지 약 8부의 물을 농축된 추출물 1부당 첨가한다. 추출물에 물을 첨가할 때 약간의 아글루콘 이소플라본 재료가 침전된다.
추출물로부터의 아글루콘 이소플라본 재료의 회수를 최대로 하기 위해, 추출물 및 물을 완전 혼합하고 냉각시킨다. 추출물 및 물을 소정의 시간, 바람직하게는 약 30분 내지 약 1 시간동안 혼합한다. 바람직한 구체예에서, 추출물 및 물을 약 50℃ 내지 약 75℃, 바람직하게는 약 70℃의 온도에서 혼합한다. 물 및 추출물을 완전 혼합한 후, 혼합물을 냉각시켜 아글루콘 이소플라본 재료를 침전시킨다. 추출물/물 혼합물을 바람직하게는 약 5℃ 내지 약 20℃, 가장 바람직하게는 약 10℃의 온도로 거의 모든 아글루콘 이소플라본 재료를 침전시키기에 충분한 시간동안 냉각시킨다. 침전된 아글루콘 이소플라본을 추출물/물 혼합물로부터 원심분리 또는 여과와 같은 통상의 방법으로 분리할 수 있다.
그후, 분리된 아글루콘 이소플라본 재료를 물로 세척할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아글루콘 이소플라본 재료는 약 70℃의 온도에서 약 5분동안 물 세척물 대 재료의 중량비가 약 0.8:1 내지 약 2:1 이 되는 물로 세척한다. 아글루콘 이소플라본 재료를 세척물로부터 여과 또는 원심분리와 같은 통상의 방법에 의해 분리하고 건조시킨다. 회수된 아글루콘 이소플라본 재료는 대개 20% 이상의 제니스테인 및 10% 이상의 다이드제인을 포함하며, 재료의 잔류 함량은 기타 아글루콘 이소플라본을 비롯한 잔류 식물성 재료로 형성된다. 잔류 식물성 재료는 아글루콘 이소플라본 재료를 대두 유장으로부터 분리하는 경우, 대두 재료가 된다.
회수된 아글루콘 이소플라본 재료는 부가로 정제되어 40% 이상의 제니스테인, 바람직하게는 90% 이상의 제니스테인을 포함하는 제니스테인 함량이 높은 재료 및 40% 이상의 다이드제인을 포함하는 다이드제인 함량이 높은 재료를 재조할 수 있다. 아글루콘 이소플라본 재료를 수성 알콜 용매로 용매화시킬 수 있다. 저분자량 알콜은 용매의 알콜 성분으로서 바람직하며, 에탄올은 독성이 낮기 때문에 식품 및 의약품용으로 가장 바람직하다. 용매의 알콜 성분은 약 30% 내지 약 90%인 것이 바람직하며, 이때, 약 80% 의 알콜 성분은 아글루콘 이소플라본 재료의 우수한 용매화를 제공하는데 가장 바람직하다.
용매화된 아글루콘 이소플라본 재료를 포함하는 알콜 수용액은 알콜 수용액으로부터 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료를 분리시키기에 충분한 시간동안 흡착제 재료와 접촉시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료를 역상 HPLC 에 의해 알콜 수용액으로부터 분리했다. HPLC 칼럼은 상기 기재된 바와같이 제조하고, 아글루콘 이소플라본 재료를 포함하는 알콜 수용액을 칼럼에 충전시키고, 제니스테인 함량이 높은 재료 및 다이드제인 함량이 높은 재료를 상기 기재된 방법으로 칼럼으로부터 용출시켰다. 제니스테인 함량이 높은 재료는 40% 이상의 제니스테인, 바람직하게는 90% 이상의 제니스테인을 잔류 식물성 재료와 함께 포함하고 있으며, 제니스테인이 대두 유장으로부터 회수되는 경우 상기 잔류 식물성 재료는 잔류 대두 재료가 된다. 다이드제인 함량이 높은 재료는 잔류 식물성 재료와 함께 40% 이상의 다이드제인을 포함한다.
실험
본 발명은 식물성 단백질 유장으로서 대두 유장을 이용하는 하기 실시예에 의해 더 구체적으로 예시된다. 하기 실시예는 예시적인 것이며, 어떤 형태로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
이미 지적한 바와 같이, 대두 유장은 상응하는 글루코시드, 복합체, 및 아글루콘 구성원을 보유하는 이소플라본의 제니스테인, 다이드제인 및 글리시테인 "족"을 포함하며, 여기서 제니스테인 족은 복합체 6"-OMal 제니스틴, 6"-OAc 제니스틴, 글루코시드 제니스틴 및 아글루콘 제니스테인을 포함하며; 다이드제인 족은 복합체 6"-OMal 다이드진, 6"-OAc 다이드진, 글루코시드 다이드진 및 아글루콘 다이드제인을 함유하며; 글리시테인 족은 복합체 6"-OMal 글리시틴, 글루코시드 글리시틴 및 아글루콘 글리시테인을 포함한다. 하기 표에서, 이소플라본의 상대적 농도는 이소플라본 족의 백분율로 측정하였다. 예를들면, 제니스테인 족의 경우, 제니스틴(%)+6"-OMal 제니스틴+ 6"-OAc 제니스틴(%)+제니스테인(%)=100% 이다. 복합체가 글루코시드로, 글루코시드가 아글루콘으로 전환되는 전환율은 이소플라본 족내의 각 화합물의 형태의 백분율을 비교하므로써 결정할 수 있다.
실시예 1
첫 번째 실험에서, 이소플라본 복합체에서 이소플라본 글루코시드로의 전환을 조사하였다. 전환율은 동일한 이소플라본 족의 글루코시드의 상응하는 정량적인 백분율 증가와 관련된 이소플라본 족의 말로네이트 및 아세테이트 에스테르의 정량적인 백분율 감소에 의해 결정하였다.
이소플라본 복합체에서 이소플라본 글루코시드로의 제 1 단계 전환에 대한 여러가지 상이한 pH 조건하의 효과를 두가지 다른 온도에서 측정하였다. 분무 건조된 대두 유장을 물에 슬러리 처리하여 2% 고체의 대두 유장 현탁액을 형성했다. 대두 유장을 4개의 샘플에 대해 2개의 그룹으로 나누었다. 각 그룹의 샘플을 각각 pH 6.0, 7.0, 9.0 및 11.0으로 조정하였다. 샘플의 그룹을 24시간동안 항온처리하고, 샘플중 한 그룹을 45℃에서, 샘플의 다른 그룹을 72.5℃에서 항온처리했다. 각 샘플에 대해 0, 2, 4, 6, 8 및 24 시간에 주기 분석을 수행하여 상기 샘플의 이소플라본 함량을 결정하였다. 하기 표 1a 내지 1c 는 상기 실험 과정에 전반에 대한 이소플라본의 변화 및 분포를 나타낸다.
샘플 제니스틴 6"-OMal제니 스틴 6"-OAc제니 스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이 드진 6"-OAc다이 드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
백분율(%)
pH 6, 45℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 33 36
t=2시간 15 62 0 23 15 61 2 21 34 37 28
샘플 제니스틴 6"-OMal제니 스틴 6"-OAc제니 스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이 드진 6"-OAc다이 드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
t=4시간 13 61 0 26 13 60 2 25 30 34 36
t=6시간 11 61 0 28 11 60 2 27 30 33 37
t=8시간 11 60 0 29 10 60 2 28 31 33 36
t=24시간 24 49 2 25 16 52 0 32 30 27 43
pH 7, 45℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 35 30
t=2시간 22 59 0 19 20 50 2 19 42 25 34
t=4시간 22 57 0 21 21 57 1 20 35 32 33
t=6시간 21 57 0 20 20 58 0 21 40 30 30
t=8시간 22 56 0 21 21 57 0 22 37 31 33
t=24시간 17 49 0 15 15 49 0 36 26 28 46
pH 9, 45℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 32 30
t=2시간 50 34 0 16 50 34 0 15 50 20 30
t=4시간 57 27 0 15 57 27 0 16 49 17 34
t=6시간 62 23 0 15 62 23 0 15 54 13 34
t=8시간 67 19 0 14 67 18 0 15 57 10 34
t=24시간 70 17 0 13 63 17 0 20 50 10 39
pH 11, 45℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 33 36
t=2시간 85 0 0 15 82 0 0 18 62 0 38
t=4시간 85 0 0 15 81 0 0 19 63 0 37
t=6시간 86 0 0 14 79 0 0 21 61 0 39
t=8시간 87 0 0 13 77 0 0 23 60 0 40
t=24시간 90 0 0 10 53 0 0 47 46 0 54
샘플 제니스틴 6"-OMal제니스틴 6"-OAc제니스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이드진 6"-OAc다이드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
백분율(%)
pH 6, 72.5℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 33 36
t=2시간 33 48 0 19 33 48 2 17 39 27 34
t=4시간 43 39 0 17 42 39 2 17 46 21 33
t=6시간 51 33 0 17 49 32 3 17 50 19 31
t=8시간 56 28 0 16 54 27 3 16 57 14 29
t=24시간 80 5 0 15 77 5 3 16 66 0 34
pH 7, 72.5℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 33 36
t=2시간 41 43 0 17 41 39 2 17 47 25 29
t=4시간 52 32 0 15 50 32 2 16 49 18 33
t=6시간 58 27 0 15 56 26 2 16 51 15 35
t=8시간 64 21 0 15 62 20 2 16 55 12 32
t=24시간 59 4 0 38 61 3 0 36 50 0 50
pH 9, 72.5℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 33 36
t=2시간 83 4 0 13 82 4 0 14 64 0 36
t=4시간 88 2 0 11 84 2 0 15 65 0 35
t=6시간 90 0 0 10 85 0 0 15 65 0 35
t=8시간 91 0 0 9 85 0 0 15 65 0 35
t=24시간 100 0 0 0 85 0 0 15 100 0 0
pH 11, 72.5℃
t=0 16 65 0 19 15 65 2 18 32 33 36
t=2시간 86 0 0 14 76 0 0 24 57 0 43
t=4시간 87 0 0 13 72 0 0 28 54 0 46
t=6시간 87 0 0 13 67 0 0 33 51 0 49
t=8시간 88 0 0 12 61 0 0 39 48 0 52
t=24시간 78 0 0 22 24 0 0 76 31 0 69
6"-OMal 및 6"-OAc 이소플라본 복합체 화합물의 상대 농도의 감소 및 글루코시드 제니스틴, 다이드진 및 글리시틴의 상응하는 농도 증가에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1차 전환 단계는 더 높은 pH, 즉 더 염기성인 pH 조건 및 더 높은 온도 조건에서 가장 신속하게 완료된다. 이소플라본 복합체에서 이소플라본 글루코시드로의 완전한 전환은 45℃ 및 72.5℃ 둘 다에서 pH 9 및 pH 11 샘플에서 발생하였다. 또한 전환 반응은 72.5℃에서 pH 6 및 7 샘플에서 완료에 가깝도록 진행된다.
실시예 2
두 번째 실험에서, 이소플라본 글루코시드의 아글루콘 이소플라본으로의 전환을 조사하였다. 제 1 전환 단계에 의해 생성된 이소플라본 글루코시드가 풍부한 유장을 사용하여 제 2 전환 단계를 조사했다. 전환율은 동일한 이소플라본 족의 아글루콘 백분율의 상응하는 정량적인 증가와 관련이 있는 이소플라본 족의 글루코시드 백분율의 정량적인 감소에 의해 결정하였다.
대두 유장의 pH를 11.0으로 조절하고, 35℃에서 30분동안 항온처리하여 대두 유장을 이소플라본 글루코시드가 풍부한 유장으로 전환시켰다. 글루코시드가 풍부한 유장의 한 샘플을 24시간동안 45℃에서 항온처리하여 유장내의 잔류 효소에 의한 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로의 전환을 측정했다. 글루코시드가 풍부한 유장의 다른 샘플을 바이오펙티나아제 100L, 바이오펙티나아제 300L, 바이오펙티나아제 OK70L, 락타아제 F, α-갈 600L, G-자임 G990, 퀘스트 바이오락테아제 30,000, 노보 락토자임 3000L, 막실락트 L2000, 엔제코 펑갈 락타아제, 화이자 뉴트랄 락타아제 및 퀘스트 뉴트랄 락타아제와 같은 시판하는 보충 효소로 접종했다. α-갈 600L, G-자임 G990, 바이오펙티나아제 100L, 바이오펙티나아제 300L, 바이오펙티나아제 OK70L, 락타아제 F 및 엔제코 펑갈 락타아제로 접종된 샘플은 접종 전에 pH 를 4.5로 조절했다. 노보 락토자임 3000L, 막실락트 L2000, 화이자 뉴트랄 락타아제 및 퀘스트 바이오락타아제 30,000 및 퀘스트 뉴트랄 락타아제로 접종된 샘플은 접종전에 pH 를 4.5 및 7.0으로 조절했다. 락타아제 F 샘플을 35℃에서 항온처리하고, 바이오펙티나아제 300L 및 바이오펙티나아제 OK70L 샘플을 40℃에서 항온처리한 것을 제외하고, 보충 효소 샘플을 50℃에서 항온처리했다. 일정 시간 간격후에 서브샘플을 취하고 이소플라본 함량에 대해 측정했다. 하기 표 2a 내지 2f는 상기 실험 과정에 전반에 대한 이소플라본의 변화 및 분포를 나타낸다.
샘플 제니스틴 6"-OMal제니스틴 6"-OAc제니스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이드진 6"-OAc다이드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
백분율(%)
잔류 효소 pH 9.0, 45℃
t=0 86 5 0 9 79 4 0 18 100 0 0
t=2시간 89 2 0 9 81 1 0 18 100 0 0
t=4시간 92 1 0 8 82 0 0 18 100 0 0
t=6시간 93 0 0 7 82 0 0 18 100 0 0
t=24시간 0 0 0 100 0 0 0 100 0 0 100
샘플 제니스틴 6"-OMal제니스틴 6"-OAc제니스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이드진 6"-OAc다이드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
바이오펙티나제 300L, pH 4.5, 40℃0.1g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
t=0 74 0 11 15 100 0 0 0 77 0 23
t=0.5시간 46 0 0 54 46 3 0 51 75 0 25
t=1시간 22 0 0 78 24 3 0 73 66 10 24
t=1.5시간 11 0 0 89 14 3 0 82 73 0 27
t=2시간 6 0 0 94 7 3 0 90 70 0 30
바이오펙티나제 OK70L, pH 4.5, 40℃0.1 g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
t=0 74 0 11 15 100 0 0 0 77 0 23
t=0.5시간 69 0 0 31 70 0 0 30 76 0 24
t=1시간 54 0 0 46 53 3 0 44 76 10 24
t=1.5시간 44 0 0 56 43 0 4 52 75 0 25
t=2시간 37 0 0 63 35 3 0 62 74 0 26
바이오펙티나아제 100L, pH 4.5, 50℃0.04g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
t=0 50 2 0 47 61 2 0 37 60 0 40
t=1시간 25 2 0 73 31 2 0 67 54 0 55
t=2시간 12 2 0 86 15 1 0 83 51 0 50
t=3시간 7 2 0 92 9 1 0 90 0 0 100
샘플 제니스틴 6"-OMal제니스틴 6"-OAc제니스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이드진 6"-OAc다이드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
백분율(%)
락타아제 F, pH 4.5, 35℃0.1g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
t=0 47 8 0 45 45 7 0 48 74 0 26
t=0.5시간 9 9 0 82 8 9 0 83 55 0 39
t=1시간 3 8 0 89 2 8 0 90 46 0 54
t=2시간 0 9 0 91 0 8 0 92 32 0 68
α-갈 600L, pH 4.5, 50℃0.1g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
t=0 83 0 0 17 83 0 0 17 80 0 20
t=1시간 4 0 0 96 2 0 0 98 23 0 77
t=2시간 1 0 0 99 0 0 0 100 10 14 76
t=3시간 0 0 0 100 0 0 0 100 8 14 78
엔제코 펑갈 락타아제, pH 4.5, 35℃0.1g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
t=0 83 1 0 16 79 3 1 17 85 0 15
t=0.5시간 17 1 0 82 16 4 3 77 39 0 55
t=1시간 6 1 0 93 5 4 3 87 26 0 74
t=2시간 0 1 0 99 0 4 3 92 4 0 96
G-자임 G990, pH 4.5, 50℃0.1g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
t=0 83 0 0 17 83 0 0 17 80 0 20
t=1시간 49 1 0 51 41 0 0 59 82 0 18
t=2시간 30 1 0 69 21 0 0 79 79 0 21
t=3시간 18 0 0 82 11 0 0 89 69 11 19
샘플 제니스틴 6"-OMal제니스틴 6"-OAc제니스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이드진 6"-OAc다이드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
백분율(%)
노보 락토자임 3000L, 50℃0.2g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
pH 4.5
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 78 8 0 14 80 7 0 13 86 0 14
t=4시간 77 8 0 15 80 7 0 13 84 0 16
pH 7.0
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 72 8 0 20 77 7 0 16 72 0 28
t=4시간 68 8 0 24 74 7 0 19 61 0 39
막실락트 L2000, 50℃0.2g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
pH 4.5
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=4시간 76 7 0 15 76 7 0 17 73 6 21
pH 7.0
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 71 7 0 22 73 6 0 21 56 7 31
t=4시간 65 7 0 28 69 5 0 26 52 0 48
샘플 제니스틴 6"-OMal제니스틴 6"-OAc제니스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이드진 6"-OAc다이드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
백분율(%)
화이자 뉴트랄 락타아제, 50℃0.2g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
pH 4.5
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 77 7 0 16 77 6 0 17 73 7 20
t=4시간 77 0 7 16 77 6 0 17 76 0 24
pH 7.0
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 70 7 0 23 72 5 0 23 70 6 24
t=4시간 55 7 0 38 60 6 0 34 66 0 34
퀘스트 바이오락타아제 30,000, 50℃0.2g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
pH 4.5
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 0 6 0 94 0 6 0 94 0 0 100
t=4시간 0 4 0 96 0 5 0 95 0 0 100
pH 7.0
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 2 7 0 91 3 7 0 90 29 0 71
t=4시간 0 7 0 93 0 6 0 94 0 0 100
샘플 제니스틴 6"-OMal제니스틴 6"-OAc제니스틴 제니스테인 다이드진 6"-OMal다이드진 6"-OAc다이드진 다이드제인 글리시틴 6"-OMal글리시틴 글리시테인
백분율(%)
퀘스트 뉴트랄 락타아제, 50℃0.2g/100g 글루코시드가 풍부한 유장
pH 4.5
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 73 6 0 21 76 5 0 19 79 0 21
t=4시간 73 6 0 21 76 5 0 19 76 0 24
pH 7.0
t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19
t=1시간 2 7 0 91 7 4 0 89 15 0 15
t=4시간 0 7 0 93 0 4 0 96 0 0 100
제니스틴, 다이드진 및 글리시틴 각각의 제니스테인, 다이드제인 및 글리시테인으로의 전환에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이소플라본 글루코시드의 실질적으로 완전한 아글루콘 이소플라본으로의 전환이 달성된다. 보충 효소는 전환율을 현저히 증가시켰으며, 특정 보충 효소로 1시간내에 거의 완전한 전환을 수행하였다. pH 4.5에서 가장 효과적인 것으로 나타난 보충 효소는 바이오펙티나아제 100L, 바이오펙티나아제 300L, 락타아제 F, α-갈 600L, G-자임 G990, 퀘스트 바이오락테아제 30,000 및 엔제코 펑갈 락타아제이다. pH 7 에서 가장 효율적인 보충 효소는 퀘스트 바이오락타아제 30,000 및 퀘스트 뉴트랄 락타아제이다.
실시예 3
다른 실험에서, 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료는 아글루콘 이소플라본이 풍부한 대두 유장으로부터 회수했다. 30㎎의 제니스테인, 37㎎의 다이드제인 및 7㎎의 글리시테인을 포함하는 1,000g 중량의 아글루콘 이소플라본이 풍부한 대두 유장의 제 1 샘플을 약간의 가열에 의해 163g(농도 비-1:6.1)으로 농축시킨다. 농축된 유장을 가열하여 유장내의 단백질 재료를 응고시키고, 이를 원심분리시켜 유장 단백질 재료를 부가로 농축시킨다. 25㎎의 제니스테인, 32㎎의 다이드제인 및 6㎎의 글리시테인을 포함하는 21g의 유장 단백질 재료를 유장으로부터 분리한다. 회수한 유장 단백질 재료는 혼합 유장 및 유장 단백질 재료내에 82%의 제니스테인, 88%의 다이드제인 및 77%의 글리시테인을 포함한다.
중량이 400g이며, 12㎎의 제니스테인, 15㎎의 다이드제인 및 3㎎의 글리시테인을 포함하는 아글루콘 이소플라본이 풍부한 대두 유장의 제 2 샘플을 가열시켜 유장을 농축시키지 않고 유장내의 단백질 재료를 응고시켰다. 응고된 유장 단백질 재료 및 유장을 원심분리하여 유장 단백질 재료를 부가로 농축시켰다. 5㎎의 제니스테인, 7㎎의 다이드제인 및 1㎎의 글리시테인을 포함하는 8.7g의 유장 단백질 재료를 회수했다. 회수된 유장 단백질 재료는 혼합 유장 단백질 재료 및 유장내에 44%의 제니스테인, 47%의 다이드제인 및 34%의 글리시테인을 포함한다.
제 1 및 제 2 샘플의 유장 단백질 재료를 비교하면, 유장 단백질 재료를 분리하기 이전에 아글루콘 이소플라본이 풍부한 유장을 농축시키면 유장 단백질 재료내의 아글루콘 이소플라본의 포획이 증가되는 것으로 나타났다.
실시예 4
다른 실험에서, 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 수성 알콜 추출물로 추출하고, 추출물로부터 아글루콘 이소플라본 재료를 침전시켜 아글루콘 이소플라본 재료를 회수했다.
유장내의 이소플라본 복합체 및 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키고, 유장으로부터 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 회수하여 86%의 단백질 건조 중량, 4.7g의 제니스테인, 2.2g의 다이드제인 및 0.36g의 글리시테인을 포함하는 821g의 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 제공했다. 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 6,360g의 80:20중량%의 에탄올/물 용액(7.7:1 용액/아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료)으로 60℃에서 45분동안 추출했다. 추출후, 생성된 슬러리를 25℃로 냉각시키고, 진공하에 왓맨 No. 4 여과지로 여과했다. 798g의 고체, 0.8g의 제니스테인, 0.4g의 다이드제인 및 0.02g의 글리시테인을 포함하는 중량이 1,584g인 젖은 케이크를 23g의 고체, 3.9g의 제니스테인, 1.8g의 다이드제인 및 0.34g의 글리시테인을 포함하는 3,397g의 맑은 추출물과 함께 회수했다.
2,000g의 80:20 중량%의 에탄올/물 용액(2.3:1의 용액/초기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료)으로 5 분동안 25℃에서 케이크를 2회 추출했다. 2회 추출후에, 생성된 슬러리를 다시 왓맨 No. 4 여과지상에서 여과했다. 794g의 고체, 0.3g의 제니스테인, 0.1g의 다이드제인 및 0.01g의 글리시테인을 포함하고 중량이 1,542g인 젖은 케이크를 4.0g의 고체, 0.5g의 제니스테인, 0.3g의 다이드제인 및 0.01g의 글리시테인을 포함하고 중량이 2,042g인 제 2 추출물과 함께 회수했다. 추출물을 합하고, 이는 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료내에 초기에 94%의 제니스테인 및 95%의 다이드제인을 포함한다.
그후, 추출물을 부치(Buchi) 증발기내에서 진공하에 70℃에서 증발시켜 1,528g(초기 합한 추출물 부피의 20%)으로 농축시켰다. 6,000g의 탈이온수를 농축된 추출물에 첨가했다(4:1 물/추출물). 물을 첨가했을 때 백색의 이소플라본 침전물이 형성되었다. 침전물 슬러리를 70℃로 45분동안 가열했다. 그후, 슬러리를 4℃에서 24시간동안 냉장시켜 이소플라본 침전물이 형성 및 침강되도록 했다. 7,300g의 상청액을 침전물로부터 기울려 따라내고 나머지 슬러리를 원심분리하여 침전물을 회수했다. 회수된 침전물을 600g의 탈이온수로 70℃에서 15분동안 세척했다. 침전물을 원심분리로 회수하고, 진공하에 50℃에서 건조시켰다.
중량이 7.3g이고, 49%의 제니스테인, 19%의 다이드제인 및 4%의 글루시테인을 포함하는 건조된 아글루콘 이소플라본 재료를 수득했다.
실시예 5
다른 실험에서, 제니스테인 함량이 높은 재료 및 다이드제인 함량이 높은 재료를 아글루콘 이소플라본 재료로부터 역상 HPLC 에 의해 분리했다. 건조 중량을 기준으로 하여 55%의 제니스테인, 21%의 다이드제인 및 4%의 글리시테인을 포함하는 2g의 아글루콘 이소플라본 재료를 1ℓ의 50:50 중량%의 메탄올/물 용액에 첨가했다. 용액을 왓맨 No. 5 여과지로 여과한 후, 0.45μ 여과지로 여과했다.
크로마실 충전재(크로마실 C18 16㎛, 100Å 비이드)로 충전된 25㎝ 길이, 2" 직경의 HPLC 칼럼에 상기 용액을 부었다. 50:50중량%의 메탄올/물 용액으로 구성된 유동 상을 64㎖/분의 속도로 칼럼을 통과시켰다. 칼럼 유출물로부터의 다이드제인, 글리시테인 및 제니스테인의 외관을 UV 흡수로 검출했다. 다이드제인을 제 1 분획에서 수집하고, 제니스테인을 제 2 분획에서 수집했다. 다이드제인 및 제니스테인 분획을 증발시켜 알콜을 제거하고, 이로써 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료가 각각의 분획에서 침전되도록 했다. 침전된 제니스테인 함량이 높고 다이드제인 함량이 높은 재료를 원심분리에 의해 회수하고, 진공 오븐내에서 건조시켰다. 회수된 제니스테인 함량이 높은 재료는 약 95%의 제니스테인을 포함하며, 회수된 다이드제인 함량이 높은 재료는 약 45%의 다이드제인을 포함한다.
상기 기재된 실험에 있어서, 6"-OMal-제니스틴, 6"-OAc-제니스틴, 6"-OMal-다이드진, 6"-OAc-다이드진, 6"-OMal-글리시틴 및 글리시테인에 대한 모든 %는 이론치이다. 효소 농도에 대한 %는 각 샘플내의 100g의 유장 고체 또는 100g의 유장에 대한 통상의 효소 제제의 g 으로부터 계산한 것이다.
하기는 대두 생성물내에서 이소플라본을 정량시키는 방법을 기재한 것이다. 0.75g의 샘플(분무 건조 또는 미분쇄 분말)을 50㎖의 80/20의 메탄올/물 용매와 혼합하여 대두 생성물로부터 이소플라본을 추출했다. 혼합물을 2시간동안 실온에서 궤도형 교반기로 교반했다. 2시간후에, 잔류하는 용해되지 않은 재료를 왓맨 No. 42 여과지로 여과시켜 제거했다. 5㎖의 여과물을 4㎖의 물 및 1㎖의 메탄올로 희석했다.
추출된 이소플라본은 휴렛 팩커드 C18 하이퍼실 역상 칼럼을 이용하는 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 분리하였다. 이소플라본을 상기 칼럼에 주입하고, 88% 메탄올, 10% 물 및 2% 빙초산으로 출발하는 용매 구배로 용출하였다. 유속 0.4 ㎖/분에서 모든 이소플라본-제니스틴, 6"-O-아세틸제니스틴, 6"-O-말로닐제니스틴, 제니스테인, 다이드진, 6"-O-아세틸다이드진, 6"-O-말로닐다이드진, 다이드제인, 글리시틴, 6"-O-말로닐글리시틴 및 글리시테인은 모두 용해되었다. 피이크는 260㎚에서 UV 흡광에 의해 검출되었다. HPLC-중량 분광학에 의해 피이크 분석을 실시했다.
미국, 뉴저지, 섬머빌에 소재하는 인도파인 케미칼 컴패니에서 시판하는 순수한 표준물(제니스틴, 제니스테인, 다이드진 및 다이드제인)을 사용하여 정량 분석을 실시했다. 반응 인자(통합 면적/농도)는 상기 화합물 각각에 대해 계산하였으며, 미공지 샘플을 정량하기 위해 사용하였다. 복합체 형태에 대해서는 이용가능한 순수한 표준물이 없기 때문에, 반응 인자는 모분자의 것을 추정하였으나, 분자량 차이에 대해 보정하였다. 글리시틴에 대한 반응 인자는 분자량 차이에 대해 보정된 제니스틴의 것으로 추정하였다.
상기 방법은 개개의 이소플라본의 정량법을 제공한다. 편리하게도, 총 제니스테인, 총 다이드제인 및 총 글리시테인을 계산할 수 있으며, 이는 모든 복합체 형태가 그들의 각각의 비복합체 형태로 전환되는 경우, 이들 화합물의 응집체 중량을 나타낸다. 또한, 이들 총량은 비복합체 형태를 전환시키는 산 가수분해를 이용하는 방법으로 직접 측정할 수도 있다.
이상의 기재는 본 발명의 단순한 바람직한 구체예를 나타낸다. 다양한 변형예 및 수정예는 하기 특허청구의 범위에서 기재된 바와같이 본 발명의 의의 및 다양한 특징에서 벗어나지 않고서 형성될 수 있으며, 이는 대응물 원칙을 비롯한 특허법 원리에 의해 해석되어져야 한다.

Claims (66)

  1. (a) 이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환시키기에 충분한 시간동안 소정의 온도 및 pH 에서 식물성 단백질 유장을 처리하고;
    (b) 적어도 대부분의 이소플라본 글루코시드를 아글루콘 이소플라본으로 전환시키기에 충분한 시간동안 소정의 온도 및 pH 에서 상기 식물성 단백질 유장내의 이소플라본 글루코시드와 효소를 접촉시키는 것을 포함하는 이소플라본 복합체를 포함하는 식물성 단백질 유장으로부터 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장을 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 식물성 단백질 유장을 약 2 내지 약 121℃의 온도 및 pH 약 6 내지 약 13.7에서 처리하여 상기 이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환시키는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 식물성 단백질 유장을 약 45 내지 약 73℃의 온도와 pH 약 9 내지 약 10에서 처리하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환시키는 시간이 약 4시간 내지 약 6시간인 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 식물성 단백질 유장을 약 5 내지 약 50℃의 온도와 pH 약 10 내지 약 11에서 처리하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 이소플라본 복합체를 이소플라본 글루코시드로 전환시키는 시간이 약 0.5시간 내지 약 1시간인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 대부분의 이소플라본 복합체가 이소플라본 글루코시드로 전환되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 80% 이상의 이소플라본 복합체가 이소플라본 글루코시드로 전환되는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 90% 이상의 이소플라본 복합체가 이소플라본 글루코시드로 전환되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 효소를 약 5℃ 내지 약 75℃의 온도에서 pH 약 3 내지 약 9 에서 식물성 단백질 유장내의 이소플라본 글루코시드와 접촉시키는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 효소를 약 35℃ 내지 약 45℃의 온도에서 식물성 단백질 유장내의 이소플라본 글루코시드와 접촉시키는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 식물성 단백질 유장내에서 효소와 상기 이소플라본 글루코시드를 접촉시키는 단계가 유효량의 보충 효소를 식물성 단백질 유장에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 보충 효소가 1,4-글루코시드 결합을 분해할 수 있는 사카리다아제 효소를 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 보충 효소가 α-글루코시다아제 효소, β-글루코시다아제 효소, β-갈락토시다아제 효소, 글루코-아밀라아제 효소, 펙티나아제 효소 및 이의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 80% 이상의 상기 이소플라본 글루코시드가 아글루콘 이소플라본으로 전환되는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 90% 이상의 상기 이소플라본 글루코시드가 아글루콘 이소플라본으로 전환되는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 식물성 단백질 유장이 대두 유장을 포함하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 및 아글루콘 이소플라본을 함유하는 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장으로부터 회수하는 것을 부가로 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 한외여과, 열 응고 및 탈수중 하나이상에 의해 회수하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 식물성 단백질 유장을 냉각시키고, 상기 냉각된 유장으로부터 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 분리하여 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 회수하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 농축 식물성 단백질 유장으로부터 회수하는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서,
    a.) 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 수성 알콜 추출제로 추출하여 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조하고,
    b.) 제니스테인 함량이 높은 재료를 상기 추출물로부터 분리하는데 충분한 시간동안 상기 추출물을 흡착제 물질과 접촉시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,상기 수성 알콜 추출제가 약 30%의 알콜 내지 약 90%의 알콜을 포함하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제가 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료내의 상기 단백질의 등전점 이상의 pH를 갖는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제의 pH 가 약 3 내지 약 6 인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를, 추출제 대 유장 단백질 재료의 중량비가 약 11:1을 초과하지 않는 추출제로 추출하는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를, 상기 수성 알콜 추출제의 두 분획 대 상기 유장 단백질 재료의 중량비 합이 약 11:1의 총 중량비를 초과하지 않는 두 분획의 수성 알콜 추출제로 추출하는 방법.
  28. 제 22 항에 있어서, 상기 흡착재 재료가 입자상인 방법.
  29. 제 22 항에 있어서, 상기 추출물을 흡착제 재료와 접촉시키는 것은 상기 추출물내의 제니스테인을 상기 흡착제 재료로 분리가능하도록 결합시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  30. 제 22 항에 있어서, 상기 추출물을 용리제를 포함하는 흡착제 재료를 통해 용출시켜 상기 추출물로부터 상기 제니스테인 함량이 높은 재료를 분리하는 방법.
  31. 제 22 항에 있어서, 상기 제니스테인 함량이 높은 재료가 40% 이상의 제니스테인을 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 제니스테인 함량이 높은 재료가 90% 이상의 제니스테인을 포함하는 방법.
  33. 제 18 항에 있어서,
    a.) 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 수성 알콜 추출제로 추출하여 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조하고,
    b.) 다이드제인 함량이 높은 재료를 상기 추출물로부터 분리하는데 충분한 시간동안 상기 추출물을 흡착제 물질과 접촉시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제가 약 30%의 알콜 내지 약 90%의 알콜을 포함하는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제가 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료내의 상기 단백질의 등전점 이상의 pH를 갖는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제의 pH 가 약 3 내지 약 6 인 방법.
  37. 제 33 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를, 추출제 대 유장 단백질 재료의 중량비가 약 11:1을 초과하지 않는 추출제로 추출하는 방법.
  38. 제 33 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를, 상기 수성 알콜 추출제 두 분획 대 상기 유장 단백질 재료의 중량비 합이 약 11:1의 총 중량비를 초과하지 않는 두 분획의 수성 알콜 추출제로 추출하는 방법.
  39. 제 33 항에 있어서, 상기 흡착재 재료가 입자상인 방법.
  40. 제 33 항에 있어서, 상기 추출물을 흡착제 재료와 접촉시키는 것은 상기 추출물내의 다이드제인을 상기 흡착제 재료로 분리가능하도록 결합시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  41. 제 33 항에 있어서, 상기 추출물을 용리제를 포함하는 흡착제 재료를 통해 용출시켜 상기 추출물로부터 상기 다이드제인 함량이 높은 재료를 분리하는 방법.
  42. 제 33 항에 있어서, 상기 다이드제인 함량이 높은 재료가 40% 이상의 다이드제인을 포함하는 방법.
  43. 제 18 항에 있어서,
    a.) 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 수성 알콜 추출제로 추출하여 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조하고,
    b.) 글리시테인 함유 재료를 상기 추출물로부터 분리하는데 충분한 시간동안 상기 추출물을 흡착제 물질과 접촉시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  44. 제 18 항에 있어서,
    a.) 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를 수성 알콜 추출제로 추출하여 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 제조하고,
    b.) 상기 아글루콘 이소플라본이 풍부한 추출물을 초기 부피의 약 15% 내지 약 30%로 농축시키고,
    c.) 상기 추출물에 물을 첨가하여 아글루콘 이소플라본 재료를 침전시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제가 약 30%의 알콜 내지 약 90%의 알콜을 포함하는 방법.
  46. 제 44 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를, 추출제 대 유장 단백질 재료의 중량비가 약 11:1을 초과하지 않는 추출제로 추출하는 방법.
  47. 제 44 항에 있어서, 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료를, 상기 수성 알콜 추출제 두 분획 대 상기 유장 단백질 재료의 중량비 합이 11:1의 총 중량비를 초과하지 않는 두 분획의 수성 알콜 추출제로 추출하는 방법.
  48. 제 44 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제가 상기 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료내의 상기 단백질의 등전점 이상의 pH를 갖는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 수성 알콜 추출제의 pH 가 약 3 내지 약 6 인 방법.
  50. 제 44 항에 있어서, 물 대 추출물의 중량비가 약 6:1 내지 약 8:1 인 비율로 물을 상기 추출물에 첨가하는 방법.
  51. 제 44 항에 있어서, 물 대 상기 아글루콘 이소플라본 재료의 중량비가 약 0.8:1 내지 약 2:1 인 비율로 상기 침전된 아글루콘 이소플라본 재료를 물로 세척하는 것을 부가로 포함하는 방법.
  52. 제 44 항에 있어서, 상기 추출물 및 물을 냉각시켜 상기 아글루콘 이소플라본 재료의 침전을 최대로 하는 것을 부가로 포함하는 방법.
  53. 제 44 항에 있어서,
    a.) 상기 알콜 수용액내에서 상기 아글루콘 이소플라본 재료를 용매화시키고,
    b.) 상기 알콜 수용액으로부터 제니스테인 함량이 높은 재료를 분리하기에 충분한 시간동안 상기 용매화된 아글루콘 이소플라본 재료를 포함하는 상기 알콜 수용액을 흡착제 재료와 접촉시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  54. 제 44 항에 있어서,
    a.) 상기 알콜 수용액내에서 상기 아글루콘 이소플라본 재료를 용매화시키고,
    b.) 상기 알콜 수용액으로부터 다이드제인 함량이 높은 재료를 분리하기에 충분한 시간동안 상기 용매화된 아글루콘 이소플라본 재료를 포함하는 상기 알콜 수용액을 흡착제 재료와 접촉시키는 것을 부가로 포함하는 방법.
  55. 제 1 항의 방법에 의해 제조된 아글루콘 이소플라본이 풍부한 식물성 단백질 유장.
  56. 제 18 항의 방법에 의해 제조된 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료.
  57. 제 22 항의 방법에 의해 제조된 제니스테인 함량이 높은 재료.
  58. 제 33 항의 방법에 의해 제조된 다이드제인 함량이 높은 재료.
  59. 제 53 항의 방법에 의해 제조된 제니스테인 함량이 높은 재료.
  60. 제 54 항의 방법에 의해 제조된 다이드제인 함량이 높은 재료.
  61. 제 44 항의 방법에 의해 제조된 아글루콘 이소플라본 재료.
  62. 유장 단백질 및 아글루콘 이소플라본을 포함하는 아글루콘 이소플라본 유장 단백질 재료.
  63. 대두 재료, 10% 이상의 제니스테인 및 5% 이상의 다이드제인을 포함하는 아글루콘 이소플라본 재료.
  64. 대두 재료, 40% 이상의 제니스테인을 포함하는 제니스테인 함량이 높은 재료.
  65. 제 64 항에 있어서, 90% 이상의 제니스테인을 포함하는 제니스테인 함량이 높은 재료.
  66. 대두 재료 및 40% 이상의 다이드제인을 포함하는 다이드제인 함량이 높은 재료.
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