KR101231031B1 - 청국장으로부터 유래한 항균 활성을 가지는 화합물 및 그 용도 - Google Patents

청국장으로부터 유래한 항균 활성을 가지는 화합물 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적정한 발효를 수행한 발효 청국장으로부터 분리한 항균 활성을 지닌 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 청국장으로부터 2차 대사산물을 스크리닝하여 얻은 항균 활성을 가진 화합물 및 그 화합물의 항균 활성의 용도에 관한 것이다.

Description

청국장으로부터 유래한 항균 활성을 가지는 화합물 및 그 용도{The antibacterial activity compounds isolated from Chungkukjang, Korea traditional soybean fermentation products and a use of the same}
본 발명은 발효 청국장으로부터 분리한 항균 활성을 지닌 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 청국장으로부터 2차 대사산물을 스크리닝하여 얻은 항균 활성을 가진 화합물 및 그 화합물의 항균 활성의 용도에 관한 것이다.
콩은 단백질과 지방이 풍부한 식물성 식품으로 오랜 세월동안 한국인의 식생활에서는 큰 비중을 차지해 왔으며, 이러한 영양적 우수성 이외에 isoflavones, saponins, lecithin, oligosaccharides 등 여러 기능성 성분이 함유되어 있음이 밝혀졌다. 콩에 들어있는 여러 기능성 성분 중 isoflavones은 포유동물에서 약한 에스트로겐 활성을 보이므로 phytoestrogen으로 분류하며, 폐경기 증후군, 골다공증, 심혈관계질환, 유방암, 전립선암, 대장암 등과 같이 호르몬과 관련된 질환의 예방에 효과가 있는 것으로 알려지고 있다. (Knight, D.C. and Eden, J.A. A review of the clinical sffects of phytoestrogen. obstest. Gynecol. 87: 987-904, 1996/ Setchell, K.D.R. and Cassidy, A. Dietary isoflavones: Biological effects and relevance to human health. J. Nutr. 129: 758S-767S, 1999)
아이소플라본의 구성은 3개의 비배당체 7"-O-glucosides (daidzin, genistin, glycitin), 9개의 비배당체 6“-O-acetyl-glucosides (6"-O-acetyl-daidzin, 6"-O-acetyl-genistin, 6"-O-acetyl-glycitin), 6"-O-malonyl-glucosides (6"-O-malonyl-daidzin, 6"-O-malonyl-genistin, 6"-O-malonyl-glycitin) 로 이루어져 있다. (Jackson, J.C, Dini, J.P, Lavandier, C, Rupasinghe, H.P.V, Faulkner, H, Poysa, D, Buzzell, S. and De-Grandis, "Effects of processing on the content and composition of isoflavones during manufacturing of soy beverage and Tofu", Biochemistry, 37, 1117-1123, 2002)
우리나라 고유의 전통발효식품으로서 대두에 본래 함유되어 있는 항산화 물질 뿐만 아니라 발효 및 숙성과정 중에 새로이 생성된 항산화 물질인 이소플라본의 aglycones, 유리아미노산, 펩타이드, 갈변물질 등을 함유하고 있다. 이러한 물질들에 의해 혈전용해능과 항돌연변이, 항암작용, 혈압강하작용 및 면역증강 효과 등 대두에서 발견되지 않은 생리활성이 밝혀졌으며, 발효균종, 발효 및 숙성기간, 갈변물질의 생성 정도와 페놀물질 분획에 따라 항산화 능력이 다르다고 알려져 있다. (J Korean Soc Food Sci Nutr, 36(12), 1503-1510, 2007)
본 발명의 목적은 청국장으로부터 항균성 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벼흰잎마름 병원균에 관한 길항제 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성된 화합물을 유효성분으로 포함하는 Xanthomonas oryzae에 대한 항균활성을 가지는 항균용 조성물을 제공한다.

Figure 112012072909611-pat00026

[화학식 1, glycitein]

Figure 112012072909611-pat00027

[화학식 2,daidzein]
Figure 112012072909611-pat00028


[화학식 3, acetylgenistin]
또 본 발명은 하기 화학식 4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 Xanthomonas oryzae에 대한 항균활성을 가지는 항균용 조성물을 제공한다.

Figure 112012072909611-pat00029

[화학식 4, genistein]

Figure 112012072909611-pat00030

[화학식 5,surfactin A]
Figure 112012072909611-pat00031

[화학식 6, surfactin B]
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또한 본 발명은 a) 청국장을 24시간에서 72시간 발효하는 단계; 및 b) 상기 발효된 청국장을 용매 추출하여 청국장 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 청국장으로부터 상기 본 발명의 화학식 1 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 수득하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성되거나 화학식4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 및 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성되거나 화학식 4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성되거나 화학식4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균용 사료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성되거나 화학식4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 Xanthomonas oryzae에 대한 항균활성을 가지는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성되거나 화학식4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 벼흰잎마름병원균에 관한 방제 조성물을 제공한다.Phytopathology 94:478-483. 2004에는 벼흰잎마름병원균과 Xanthomonas oryzae의 관련이 있다는 기재가 있다.
본 발명의 화합물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 본 발명의 화합물을 임상적으로 이용시에는 약학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 약학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제,액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제로 제형화할 수 있다.
또한, 이러한 제제들은 국소 투여에 적절한 고체 또는 액체 부형제나 희석제를 이용하여 통상의 방법으로서 연고제와 같은 형태의 적절한 국소 투여 형태로 제 형화될 수 있다.
통상적인 담체를 상용하여 제조된 약학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를 들면 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 투여량은 환자의 나이, 상태 등에 따라 차이가 있으나, 일반적으로 성인에게 1일에 1 ~ 500mg , 바람직하게는 10 ~ 300 mg의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 1회 내지는 6회 분할 투여할 수 있다.
본 발명의 화합물은 다양한 기능성 식품 및 건강 기능성식품의 제조시 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명의 화합물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 화합물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '기능성 식품'이라 정의한다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제,안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 화합물을 첨가하여 이루어지는 사료는, 포유류, 조류,파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료로서 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 사료는 개, 고양이, 쥐 등의 애완 동물용 사료, 소, 돼지 등의 가축용 사료, 닭, 칠면조 등의 가금용 사료, 도미, 방어 등의 양식어용 사료 등으로서 사용되고, 바람직하게는 애완 동물용 사료 또는 가축용 사료로서 사용된다.
본 발명의 사료는 사료 원료에 본 발명의 화합물을 적절하게 배합하여 만들 수 있다. 사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.
곡물류로서는, 예를 들면 마이로, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 현미, 메밀, 조, 수수, 피, 옥수수, 대두 등을 들 수 있다.
조강류로서는, 예를 들면 쌀겨, 탈지 쌀겨, 밀기울, 말분, 밀, 배아, 보리겨, 스크리닝, 펠렛, 옥수수겨, 옥수수 배아 등을 들 수 있다.
식물성 유박류로서는, 예를 들면 대두박, 콩가루, 아마박, 면실박, 낙화생 박, 홍화박, 야자박, 팜박, 호마박, 해바라기박, 유채박, 케이폭박, 겨자박 등을 들 수 있다.
동물성 사료 원료로서는, 예들 들면 어분(북양 밀, 수입 밀, 홀 밀, 연안 밀), 피쉬솔불, 육분, 어골분, 혈분, 분해모, 골분, 가축용 처리 부산물, 페더 밀, 누에, 탈지 분유, 카제인, 건조 유장 등을 들 수 있다.
그 밖의 사료 원료로서는 식물 경엽류(알팔파, 헤이큐브, 알팔파잎 분말, 유사 아카시아 분말 등), 옥수수 가공 공업부산물(콘 글루텐, 밀, 콘 글루텐 피드, 콘스테이프리카 등), 전분 가공품, 설탕, 발효 공업 산물(효모, 맥주박, 맥아근,알코올박, 장유박 등), 농산 제조 부산물(감귤 가공박, 두부박, 커피박, 코코아박 등), 그 외(카사바, 잠두콩, 구아밀, 해조, 크릴, 스피룰리나, 클로렐라, 광물 등) 등을 들 수 있다.
정제품으로서는 단백질(카제인, 알부민 등), 아미노산, 당질(전분, 셀룰로오스, 슈크로우스, 글루코오스 등), 미네랄,비타민 등을 들 수 있다.
본 발명의 동물용 사료를 동물에게 일상적으로 섭취시킴으로써 감염질환을 예방할 수 있다.
이미 감염질환이 발병되어 있는 경우에는, 상기 동물용 사료를 일상적으로 섭취시킴으로써 감염질환의 증상을 완화, 치유시키는 등, 감염질환을 치료할 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 청국장 화합물 glycitein, genistein, acetylgenistin, daidzein, surfactin A, surfactin B 로 그의 분리 방법과 Xanthomonas oryzae KACC 10331에 대한 항균 활성을 제공한다.
[화학식 1, glycitein]
① 물질 성상 : 흰색 또는 황갈색의 분말
② 분자량: 284
③ 분자식: C16H12O5
④ 질량분석치[M-H]-: 283(m/z)
[화학식 2,daidzein]
① 물질 성상 : 흰색 또는 황갈색의 분말
② 분자량: 254
③ 분자식: C15H10O4
④ 질량분석치[M-H]-: 253(m/z)
[화학식 3, acetylgenistin]
① 물질 성상 : 흰색 또는 황갈색의 분말
② 분자량: 474
③ 분자식: C23H22O11
④ 질량분석치[M-H]-: 473(m/z)
[화학식 4, genistein]
① 물질 성상 : 흰색 또는 황갈색의 분말
② 분자량: 270
③ 분자식: C15H10O5
④ 질량분석치[M-H]-: 269(m/z)
[화학식 5,surfactin A]
① 물질 성상 : 흰색 분말
② 분자량: 1008
③ 분자식: C51H89N7O13
④ 질량분석치[M-H]-: 1007(m/z)
[화학식 6, surfactin B]
① 물질 성상 : 흰색 분말
② 분자량: 994
③ 분자식: C50H87N7O13
④ 질량분석치[M-H]-: 993(m/z)
상기 glycitein(머무름시간; 13.4분), genistein(머무름시간; 13.5분), acetylgenistin(머무름시간; 13.6분), daidzein(머무름시간; 15.4분), surfactin A(머무름시간; 30.9분), surfactin B(머무름시간; 29.7분) 로 표시되는 본 발명의 화합물에 대하여 고성능액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography), 액체크로마토그래피/질량분석기(Liquid chromatography electron spray ionization mass spectrometer)의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석하였다 [도 1 참조]. 그 중 glycitein, daidzein, acetylgenistin은 0.1 : 1.2 : 1의 비율로 확인되며, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.
청국장 발효시간에 따라 각 활성물질들은 모두 발효 24시간 이후에 증가하는 양상을 나타내었고, 청국장 추출물 자체가 가지는 벼흰잎마름병원균에 대한 항균 활성은 청국장 발효 24시간에서 72시간 동안 저해율 100%를 나타내었다 [도 2 참조].
청국장으로부터 상기 glycitein, genistein acetylgenistin, daidzein, surfactin A, surfactin B 로 표시되는 화합물을 추출 분리하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 청국장 분말을 배양기를 사용하여 추출액을 얻는 단계; (2) 상기 분리된 추출액에 극성, 비극성 용매를 가하여 분획 후 농축하는 단계; (3) 상기 농축된 활성분획을 고성능 액체 크로마토그래피(High Perfomance Liquid Chromatography)를 수행하여 순수한 단일 화합물로 분리하는 단계; (4) 상기 순수한 단일 화합물을 LC-ESI-MS(Liquid chromatography electron spray ionization mass spectrometer)를 수행하여 화합물을 확인하는 단계;를 포함하는 상기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 표시되는 화합물 또는 그의 유도체의 제조 방법을 제공한다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 청국장의 추출물 및 glycitein, genistein, acetylgenistin, daidzein, surfactin A, surfactin B로 표시되는 화합물은 벼흰잎마름병원균에 대한 항균 활성 성분으로서 약제의 개발에 유용하며, 청국장 발효시간이 증가할수록 특히 24시간에서 72시간에서 활성 성분의 생산 및 효능이 증가하였다.
도 1은 화학식에 표시되는 화합물의 LC/MS의 크로마토그램과 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 2는 화학식에 표시되는 화합물을 포함한 발효 시간 별 청국장 추출물 (약160 ppm)이 Xanthomonas oryzae KACC 10331에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 화학식에 표시되는 화합물의 발효 시간에 따른 질량 크로마토그램(mass chromatogram)의 넓이(area)를 나타낸 것이며, 분리한 항균물질이 청국장 발효시간이 증가할수록 활성물질의 생산도 유의적으로 증가하는 것을 도면으로 나타낸 것이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
< 실시예 1> 청국장에서 활성 물질의 분리
청국장의 유용한 대사산물을 탐색하기 위하여, 본 발명자는 추출 및 크로마토그래피를 이용하여 청국장 발효 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60 그리고 72시간 시료로부터 활성 화합물을 분리하였다. 청국장의 원료 대두는 순창군에서 한국산(순창산) 백태를 이용하였고 20℃에서 12시간 침지하여 건져낸 후 N.K 증자관을 이용하여 증기압 1.7 kgf/cm2 (메주용 1.2-1.3 kgf/cm2) 에서 30분간 증자한 후 50℃로 냉각하여 발효용기에 10 kg씩 담아서 Bacillus licheniformis KCCM11053P을 0.02% 접종하여 37℃ incubator에서 발효하였다. 청국장 발효조건은 42℃(스팀으로 온도를 조절)에서 72시간 동안 발효하였으며 별도의 수분함량 조절은 하지 않았다.
먼저, 발효별 청국장 각 분말 1 g에 80% MeOH을 9 mL넣어 배양기를 사용하여 25℃에 200 rpm으로 1시간 동안 배양하여 추출액을 얻는다. 추출액은 4℃에 5000 rpm으로 20분 동안 원심분리기를 사용하며 2회 반복하여 상등액을 얻는다. 분리된 상등액에 극성(Water), 비극성(Ethyl actate) 용매를 가하여 분획 후 농축하여 추출물을 얻는다.
< 실시예 2> 청국장 추출물로부터 활성화합물의 단리
상기 실시예 1에서 얻은 추출물 19 mg을 고급메탄올 200 ㎕에 용해시킨 후 고성능 액체 크로마토그래피(High Perfomance Liquid Chromatography)를 수행해 다음과 같은 활성물질(glycitein, genistein, acetylgenistin, daidzein, surfactin A, surfactin B)을 얻었다.
활성물질 각각에 대해서는 LC-ESI-MS(Liquid chromatography electron spray ionization mass spectrometer) 등의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석하였다.
< 실시예 3> 물질의 항균 활성
상기 실시예1 에 기술한 방법에 의하여 얻어진 발효시간에 따른 청국장 복합추출물 (에틸아세테이트 분획)에 대한 항균활성을 확인하였다 [도 2 참조] 분획된 항균 물질을 함유한 추출물 및 활성 단일 분획은 256 ug/ml 농도에서 0.25 ug/ml 농도까지 2배희석 방법을 사용하여 각각의 농도를 함유하는 하기 표 2의 액체배지를 준비하고 여기에 잔토모나스 오리지 (Xanthonomas oryzae)균을 접종하여 보존하였다. 시험에 사용할 잔토모나스 오리지 KACC 10331균은 M210 배지를 사용하여 25℃에서 2일간 배양하였으며, 마이크로플레이트 리이더(Microplate reader)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 발명의 항균 물질을 분리, 조사한 결과 최소저해농도(MIC)는 하기 표 1과 같은 결과를 얻었다.
　 MIC (㎍/ml)
화학식 1+2+3 200
화학식 4 80
화학식 5 10
화학식 6 30
DAPG 4
표 1은 잔토모나스 오리지에 대한 최소저해농도를 나타낸 표이다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성된 화합물을 유효성분으로 포함하는 Xanthomonas oryzae에 대한 항균활성을 가지는 항균용 조성물.
    Figure 112012072909611-pat00007

    [화학식 1, glycitein]

    Figure 112012072909611-pat00008

    [화학식 2,daidzein]
    Figure 112012072909611-pat00009


    [화학식 3, acetylgenistin]
  2. 하기 화학식 4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 Xanthomonas oryzae에 대한 항균활성을 가지는 항균용 조성물.

    Figure 112012072909611-pat00032

    [화학식 4, genistein]

    Figure 112012072909611-pat00033

    [화학식 5,surfactin A]
    Figure 112012072909611-pat00034

    [화학식 6, surfactin B]
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성된 화합물을 유효성분으로 포함하는 벼흰잎마름 병원균에 관한 방제 조성물.


    Figure 112012072909611-pat00035

    [화학식 1, glycitein]

    Figure 112012072909611-pat00036

    [화학식 2,daidzein]
    Figure 112012072909611-pat00037


    [화학식 3, acetylgenistin]
  6. 하기 화학식 4 내지 화학식 6으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 벼흰잎마름 병원균에 관한 방제 조성물.
    Figure 112012072909611-pat00038

    [화학식 4, genistein]

    Figure 112012072909611-pat00039

    [화학식 5,surfactin A]
    Figure 112012072909611-pat00040

    [화학식 6, surfactin B]
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