JP790H - オリゴグルコシド誘導体 - Google Patents
オリゴグルコシド誘導体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、オリゴグルコシド誘導体に関する。
従来の技術
血清中のα−アミラーゼの測定は、すいぞうの機能の重
要な臨床上のパラメータである。α−アミラーゼを測定
するために市場で得られる試薬は、以前には主として基
質としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。しかし
ながらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であるこ
とが判明した。それ故この欠点を除去するために、澱粉
及び澱粉誘導体をオリゴサッカリド及びその光学的に測
定される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラオー
ス、−ペンタオース、−ヘキサオース及び−ヘプタオー
ス及びこれらの誘導体によって重要な改良が得られた
(ドイツ公開特許第2741192号明細書、ドイツ公
開特許第2755803号明細書、米国特許第3879
263号明細書、米国特許第4000042号明細
書)。 前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラーゼ測定
の特に重要な実施形式は、α−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある(ドイツ公開特許第2741192号明細書参照)。 しかしながら、助酵素のα−グルコシダーゼは、でき上
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはα−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。 発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去し、α−グ
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することができ、α
−アミラーゼの検出の正確性を改良するα−アミラーゼ
の基質を得ることである。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば、一般式I: [式中RとR1は、一方が水素原子、他方がメチル基又
はフェニル基を表わし、R2はグルコース単位2〜7個
を有する2価のオリゴグルコシド基を表わし、Xは水素
原子又は光学的に測定される基を表わす]の化合物によ
って解決される。 本発明による化合物ですぐ使える試薬は、α−グルコシ
ダーゼの存在でも変化をこうむらずそれ故長時間後にも
正確なα−アミラーゼの値が得られる。 R2の2価のオリゴグルコシド基は、式 (式中、nは2〜7の整数を表わす)で表わされ、グル
コース単位3、4及び6個を有するものが好ましい。 Xが光学的に測定される基の場合には、それ自体、可視
光線又は紫外線の帯域でも色を有する基であり、その際
に、置換基を有しないフェニル基は除かれる。例えばニ
トロフェニル基又は3,4−ジニトロフェニル基であ
る。 本発明による化合物の製造は、末端に基Xを有するグル
コース単位3〜8個を有するオリゴグルコシドから出発
して、これをエステル化又はエーテル化の条件下にオル
トオキシ化合物、好ましくはジアルコキシエタン又は相
応するベンジル誘導体と反応させ、置換されているメチ
レン基を有する一般式Iの化合物を形成することによっ
て行うことができる。 この合成で生じる置換されているメチレン基を有する化
合物は、一般式II: R3−X II [式中Xは前記のものを表わし、R3はグルコース単位
3〜8個を有する1価のオリゴグルコシド基を表わす]
の化合物を、p−トルオールスルホン酸の存在で一般式
III: [式中R4及びR5は一方が水素原子、他方がメチル基
又はフェニル基を表わす]の化合物と極性有機溶剤中で
反応させることによって製造される。 極性有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド又はホル
ムアミドが好ましいが、比較される塩基度を有する他の
極性有機溶剤も適当である。 意外なことにも、前記反応によって均一な生成物が得ら
れ、存在する多くのOH基を保護することは不必要であ
る。場合により形成した副産物は容易に分離することが
できる。 反応は好ましくは温度約10〜70℃、好ましくは室温
で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分な
収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の一
般式IIIの化合物で作業する。 一般式IIIの化合物の例は、ジメトキシエタン及びフェ
ニルジメトキシメタンである。 一般式IIの化合物の例は、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス及び末端で光学的に測定される基によって置換されて
いるこれらの誘導体、例えばモノニトロフェニル−マル
トヘプタオース、3,4−ジニトロフェニル−マルトヘ
プタオースその他である。 本発明による化合物のすぐれた保管貯蔵性は基質として
のp−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(G7pNP)での
十分に普及した常用のα−アミラーゼの呈色試験の条件
下、即ち緩衝液のpH7.1;NaCl50mM;α−グルコ
シダーゼ約30U/ml;基質5mMで、4,6−エチリ
デン−p−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(Eth-G7p
NP)で25℃で4日間内のラグ相及び線型に関する実際
に同じ反応経過でグルコースは形成しないが、G7pNPで
は著しいグルコースへの分解が生じることを示す。4℃
での同じ条件下では、本発明による基質で8日間後にグ
ルコースの形成は生じなかったが、これに反して公知比
較基質では著しい分解が生じた。それ故本発明によっ
て、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダーゼの
存在ですぐれた性質を有する新規化合物が得られる。 実施例 例1 4,6−エチリデン−4−ニトロフェニル−α−D−マ
ルトヘプタオシドの製造法。 バッチ: 4−ニトロフェニル−α−D−マルトヘプタオシド
250g(196mモル) アセトアルデヒド−ジメチルアセタール 31.5ml(297mモル) パラートルオールスルホン酸・H2O 20g DMF(ジメチルホルムアミド) 1.5l 合成: 4−ニトロフェニル−α−D−マルトヘプタオシド25
0g及びパラートルオールスルホン酸・H2O 20g
をDMF約1.5lにとかし、無水にするために回転蒸
発器で回転させて乾燥する。その際水の含量が0.4%
から0.02%に下がる。 残渣をDMF1.5lにとかし、アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール31.5mlを添加し、先ず50℃で9
時間撹拌し、次いで室温で約10時間維持する。反応混
合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化リチウム
溶液でpH7.3に調節し、濾過し、750mlに濃縮す
る。 HPLC分析によって、原料約20%を有するエチリデ
ン−4−ニトロフェニル−α−D−マルトヘプタオシド
約75〜80%の含量が得られる。 クロマトグラフィーによる精製: 試料溶液(750ml)を、Dowex50 WX2(200
〜400メッシュ)リチウム+70lを有する150×
25cmのカラムにあけ、水で流量1.5l/時間で溶出
する。その際フラクション4.5lを採取し、クロマト
グラフィーを紫外線検出器を用いて280nmで行う。 約100lによって未反応の4−ニトロフェニル−α−
D−マルトヘプタオシドが溶出し、約200lによって
求める生成物が溶出する。 生成物を含有するフラクションを合し、濃縮乾燥する。
残渣をメタノール1.5lにとかし、濾過し、0℃でイ
ソプロパノール4l及び石油エーテル10lで沈殿させ
る。4℃で1夜撹拌後に、生成物を吸引濾過し、イソプ
ロパノール及び石油エーテルで洗浄し、乾燥器中で30
℃で乾燥する。 収量:150g(理論量の58%)、無色の粉末、分子
量1300。 分析: H2O[フィシャー(K.Fischer)による] 4.5% イソプロパノール(ガスクロマトグラフィーによる)
5% 酸性加水分解(酵素)によるアセトアルデヒド 91
% [α]D25℃(乾燥物質に対する)=77°(c=
1、H2O) HPLC:面の%99(−NH2−柱5μ;アセトニト
リル/水1:1、c−燐酸1mモル/l、305nmで
検波)。 例2 4,6−エチリデン−マルトヘプタオースの製造法。 バッチ: マルトヘプタオース10g(8.7mモル) アセトアルデヒド−ジメチルアセタール1.8ml (1
7mモル) パラ−トルオールスルホン酸・H2O 1g DMF 75ml 合成: マルトヘプタオース10g及びパラ−トルオールスルホ
ン酸・H2O 1gをDMF100mlにとかし、濃縮乾
燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をDMF7
5mlにとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
1.7mlを加え、密閉して50℃で15時間撹拌する。
次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸
化リチウムでpH7に中和し、濾過し、50mlに濃縮す
る。 クロマトグラフィーによる精製: 試料溶液50mlを、Dowex50 WX2(200〜40
0メッシュ)L+3.5lを有するクロマトグラフィー
のカラム(180×5cm)にあけ水で流量150ml/
時間で溶出する。紫外線検波器(280nm)を通るフ
ラクション30mlを採取する。 1.8lによりマルトヘプタオースが溶出し、2.25
lによりエチリデン−マルトヘプタオースが溶出する。 主要フラクションを合し、回転させて乾燥し水を若干添
加してメタノール200mlにとかしイソプロパノール2
00mlを加え、4℃で撹拌する。その際生成物が沈殿
し、これを吸引濾過し、イソプロパノール及び石油エー
テルで洗浄し、真空中で25℃でP2O5によって乾燥す
る。 収量:6.2g(理論量の60%) 分析: 水[フィシャー(K.Fischer)による]7.6% 酸性加水分解(酵素)によるアセトアルデヒド91.2
% [α]D25℃(乾燥物質に対する)=69°(c=
1、H2O) HPLC(例1の条件参照):面の% 96 テトラゾリウムブルーとの反応は、還元性末端が存在し
ないことを示す。 例3(参考例) 試薬: エチリデン−G7pNP682.5mg(5.25mモル/
l)を、塩化ナトリウム(52.5mモル/l)並びに
アルファーグルコシダーゼ(42U/ml)を含有する燐
酸ナトリウム緩衝液100ml(105mモル/l)にと
かし、pH7.10に調節した。 試験の最終濃度: 燐酸塩緩衝液100mモル/l、NaCl50mモル/l、
基質5mモル/l、アルファーグルコシダーゼ40U/
ml。 試験バッチ: 25℃に加熱した試薬2.0mlに試料0.1mlを添加
し、混合物を25℃に加熱した。予培養時間4分間(ラ
グ相)後に、吸光の増大をHg405nmでエッペンド
ルフ(Eppendorf)光度計で記録した。毎分の吸光の変化
(ΔE/分)から、試料中のアミラーゼの活性を次式に
よって計算した。 アルファーアミラーゼの再発見: 活性の測定を、4℃及び25℃で保存した試薬で一定の
時間間隔でくり返し、次の値が得られた。個々の値は、手工による酵素の活性に測定に対する通常
の変動巾である。
要な臨床上のパラメータである。α−アミラーゼを測定
するために市場で得られる試薬は、以前には主として基
質としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。しかし
ながらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であるこ
とが判明した。それ故この欠点を除去するために、澱粉
及び澱粉誘導体をオリゴサッカリド及びその光学的に測
定される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラオー
ス、−ペンタオース、−ヘキサオース及び−ヘプタオー
ス及びこれらの誘導体によって重要な改良が得られた
(ドイツ公開特許第2741192号明細書、ドイツ公
開特許第2755803号明細書、米国特許第3879
263号明細書、米国特許第4000042号明細
書)。 前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラーゼ測定
の特に重要な実施形式は、α−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある(ドイツ公開特許第2741192号明細書参照)。 しかしながら、助酵素のα−グルコシダーゼは、でき上
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはα−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。 発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去し、α−グ
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することができ、α
−アミラーゼの検出の正確性を改良するα−アミラーゼ
の基質を得ることである。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば、一般式I: [式中RとR1は、一方が水素原子、他方がメチル基又
はフェニル基を表わし、R2はグルコース単位2〜7個
を有する2価のオリゴグルコシド基を表わし、Xは水素
原子又は光学的に測定される基を表わす]の化合物によ
って解決される。 本発明による化合物ですぐ使える試薬は、α−グルコシ
ダーゼの存在でも変化をこうむらずそれ故長時間後にも
正確なα−アミラーゼの値が得られる。 R2の2価のオリゴグルコシド基は、式 (式中、nは2〜7の整数を表わす)で表わされ、グル
コース単位3、4及び6個を有するものが好ましい。 Xが光学的に測定される基の場合には、それ自体、可視
光線又は紫外線の帯域でも色を有する基であり、その際
に、置換基を有しないフェニル基は除かれる。例えばニ
トロフェニル基又は3,4−ジニトロフェニル基であ
る。 本発明による化合物の製造は、末端に基Xを有するグル
コース単位3〜8個を有するオリゴグルコシドから出発
して、これをエステル化又はエーテル化の条件下にオル
トオキシ化合物、好ましくはジアルコキシエタン又は相
応するベンジル誘導体と反応させ、置換されているメチ
レン基を有する一般式Iの化合物を形成することによっ
て行うことができる。 この合成で生じる置換されているメチレン基を有する化
合物は、一般式II: R3−X II [式中Xは前記のものを表わし、R3はグルコース単位
3〜8個を有する1価のオリゴグルコシド基を表わす]
の化合物を、p−トルオールスルホン酸の存在で一般式
III: [式中R4及びR5は一方が水素原子、他方がメチル基
又はフェニル基を表わす]の化合物と極性有機溶剤中で
反応させることによって製造される。 極性有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド又はホル
ムアミドが好ましいが、比較される塩基度を有する他の
極性有機溶剤も適当である。 意外なことにも、前記反応によって均一な生成物が得ら
れ、存在する多くのOH基を保護することは不必要であ
る。場合により形成した副産物は容易に分離することが
できる。 反応は好ましくは温度約10〜70℃、好ましくは室温
で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分な
収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の一
般式IIIの化合物で作業する。 一般式IIIの化合物の例は、ジメトキシエタン及びフェ
ニルジメトキシメタンである。 一般式IIの化合物の例は、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス及び末端で光学的に測定される基によって置換されて
いるこれらの誘導体、例えばモノニトロフェニル−マル
トヘプタオース、3,4−ジニトロフェニル−マルトヘ
プタオースその他である。 本発明による化合物のすぐれた保管貯蔵性は基質として
のp−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(G7pNP)での
十分に普及した常用のα−アミラーゼの呈色試験の条件
下、即ち緩衝液のpH7.1;NaCl50mM;α−グルコ
シダーゼ約30U/ml;基質5mMで、4,6−エチリ
デン−p−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(Eth-G7p
NP)で25℃で4日間内のラグ相及び線型に関する実際
に同じ反応経過でグルコースは形成しないが、G7pNPで
は著しいグルコースへの分解が生じることを示す。4℃
での同じ条件下では、本発明による基質で8日間後にグ
ルコースの形成は生じなかったが、これに反して公知比
較基質では著しい分解が生じた。それ故本発明によっ
て、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダーゼの
存在ですぐれた性質を有する新規化合物が得られる。 実施例 例1 4,6−エチリデン−4−ニトロフェニル−α−D−マ
ルトヘプタオシドの製造法。 バッチ: 4−ニトロフェニル−α−D−マルトヘプタオシド
250g(196mモル) アセトアルデヒド−ジメチルアセタール 31.5ml(297mモル) パラートルオールスルホン酸・H2O 20g DMF(ジメチルホルムアミド) 1.5l 合成: 4−ニトロフェニル−α−D−マルトヘプタオシド25
0g及びパラートルオールスルホン酸・H2O 20g
をDMF約1.5lにとかし、無水にするために回転蒸
発器で回転させて乾燥する。その際水の含量が0.4%
から0.02%に下がる。 残渣をDMF1.5lにとかし、アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール31.5mlを添加し、先ず50℃で9
時間撹拌し、次いで室温で約10時間維持する。反応混
合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化リチウム
溶液でpH7.3に調節し、濾過し、750mlに濃縮す
る。 HPLC分析によって、原料約20%を有するエチリデ
ン−4−ニトロフェニル−α−D−マルトヘプタオシド
約75〜80%の含量が得られる。 クロマトグラフィーによる精製: 試料溶液(750ml)を、Dowex50 WX2(200
〜400メッシュ)リチウム+70lを有する150×
25cmのカラムにあけ、水で流量1.5l/時間で溶出
する。その際フラクション4.5lを採取し、クロマト
グラフィーを紫外線検出器を用いて280nmで行う。 約100lによって未反応の4−ニトロフェニル−α−
D−マルトヘプタオシドが溶出し、約200lによって
求める生成物が溶出する。 生成物を含有するフラクションを合し、濃縮乾燥する。
残渣をメタノール1.5lにとかし、濾過し、0℃でイ
ソプロパノール4l及び石油エーテル10lで沈殿させ
る。4℃で1夜撹拌後に、生成物を吸引濾過し、イソプ
ロパノール及び石油エーテルで洗浄し、乾燥器中で30
℃で乾燥する。 収量:150g(理論量の58%)、無色の粉末、分子
量1300。 分析: H2O[フィシャー(K.Fischer)による] 4.5% イソプロパノール(ガスクロマトグラフィーによる)
5% 酸性加水分解(酵素)によるアセトアルデヒド 91
% [α]D25℃(乾燥物質に対する)=77°(c=
1、H2O) HPLC:面の%99(−NH2−柱5μ;アセトニト
リル/水1:1、c−燐酸1mモル/l、305nmで
検波)。 例2 4,6−エチリデン−マルトヘプタオースの製造法。 バッチ: マルトヘプタオース10g(8.7mモル) アセトアルデヒド−ジメチルアセタール1.8ml (1
7mモル) パラ−トルオールスルホン酸・H2O 1g DMF 75ml 合成: マルトヘプタオース10g及びパラ−トルオールスルホ
ン酸・H2O 1gをDMF100mlにとかし、濃縮乾
燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をDMF7
5mlにとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
1.7mlを加え、密閉して50℃で15時間撹拌する。
次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸
化リチウムでpH7に中和し、濾過し、50mlに濃縮す
る。 クロマトグラフィーによる精製: 試料溶液50mlを、Dowex50 WX2(200〜40
0メッシュ)L+3.5lを有するクロマトグラフィー
のカラム(180×5cm)にあけ水で流量150ml/
時間で溶出する。紫外線検波器(280nm)を通るフ
ラクション30mlを採取する。 1.8lによりマルトヘプタオースが溶出し、2.25
lによりエチリデン−マルトヘプタオースが溶出する。 主要フラクションを合し、回転させて乾燥し水を若干添
加してメタノール200mlにとかしイソプロパノール2
00mlを加え、4℃で撹拌する。その際生成物が沈殿
し、これを吸引濾過し、イソプロパノール及び石油エー
テルで洗浄し、真空中で25℃でP2O5によって乾燥す
る。 収量:6.2g(理論量の60%) 分析: 水[フィシャー(K.Fischer)による]7.6% 酸性加水分解(酵素)によるアセトアルデヒド91.2
% [α]D25℃(乾燥物質に対する)=69°(c=
1、H2O) HPLC(例1の条件参照):面の% 96 テトラゾリウムブルーとの反応は、還元性末端が存在し
ないことを示す。 例3(参考例) 試薬: エチリデン−G7pNP682.5mg(5.25mモル/
l)を、塩化ナトリウム(52.5mモル/l)並びに
アルファーグルコシダーゼ(42U/ml)を含有する燐
酸ナトリウム緩衝液100ml(105mモル/l)にと
かし、pH7.10に調節した。 試験の最終濃度: 燐酸塩緩衝液100mモル/l、NaCl50mモル/l、
基質5mモル/l、アルファーグルコシダーゼ40U/
ml。 試験バッチ: 25℃に加熱した試薬2.0mlに試料0.1mlを添加
し、混合物を25℃に加熱した。予培養時間4分間(ラ
グ相)後に、吸光の増大をHg405nmでエッペンド
ルフ(Eppendorf)光度計で記録した。毎分の吸光の変化
(ΔE/分)から、試料中のアミラーゼの活性を次式に
よって計算した。 アルファーアミラーゼの再発見: 活性の測定を、4℃及び25℃で保存した試薬で一定の
時間間隔でくり返し、次の値が得られた。個々の値は、手工による酵素の活性に測定に対する通常
の変動巾である。
Claims (1)
- 【訂正明細書】 【特許請求の範囲】 【請求項1】一般式I:[式中RとR1は、一方が水素原子、他方がエチル基又
はフェニル基を表わし、R2はグルコース単位2〜7個
を有する2価のオリゴグルコシド基を表わし、Xは水素
原子又は光学的に測定される基を表わす]の化合物。 【請求項2】Xがニトロフェニル基を表わす特許請求の
範囲第1項記載の化合物。
Family
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