JP790H

JP790H - オリゴグルコシド誘導体

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Publication number: JP790H
Authority: JP
Publication date: 1994-11-24

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、オリゴグルコシド誘導体に関する。従来の技術血清中のα−アミラーゼの測定は、すいぞうの機能の重
要な臨床上のパラメータである。α−アミラーゼを測定
するために市場で得られる試薬は、以前には主として基
質としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。しかし
ながらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であるこ
とが判明した。それ故この欠点を除去するために、澱粉
及び澱粉誘導体をオリゴサッカリド及びその光学的に測
定される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラオー
ス、−ペンタオース、−ヘキサオース及び−ヘプタオー
ス及びこれらの誘導体によって重要な改良が得られた
（ドイツ公開特許第２７４１１９２号明細書、ドイツ公
開特許第２７５５８０３号明細書、米国特許第３８７９
２６３号明細書、米国特許第４００００４２号明細
書）。前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラーゼ測定
の特に重要な実施形式は、α−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある（ドイツ公開特許第2741192号明細書参照）。しかしながら、助酵素のα−グルコシダーゼは、でき上
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはα−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。発明が解決しようとする問題点それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去し、α−グ
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することができ、α
−アミラーゼの検出の正確性を改良するα−アミラーゼ
の基質を得ることである。問題点を解決するための手段この課題は、本発明によれば、一般式Ｉ：［式中ＲとＲ_１は、一方が水素原子、他方がメチル基又
はフェニル基を表わし、Ｒ_２はグルコース単位２〜７個
を有する２価のオリゴグルコシド基を表わし、Ｘは水素
原子又は光学的に測定される基を表わす］の化合物によ
って解決される。本発明による化合物ですぐ使える試薬は、α−グルコシ
ダーゼの存在でも変化をこうむらずそれ故長時間後にも
正確なα−アミラーゼの値が得られる。Ｒ_２の２価のオリゴグルコシド基は、式（式中、ｎは２〜７の整数を表わす）で表わされ、グル
コース単位３、４及び６個を有するものが好ましい。Ｘが光学的に測定される基の場合には、それ自体、可視
光線又は紫外線の帯域でも色を有する基であり、その際
に、置換基を有しないフェニル基は除かれる。例えばニ
トロフェニル基又は３，４−ジニトロフェニル基であ
る。本発明による化合物の製造は、末端に基Ｘを有するグル
コース単位３〜８個を有するオリゴグルコシドから出発
して、これをエステル化又はエーテル化の条件下にオル
トオキシ化合物、好ましくはジアルコキシエタン又は相
応するベンジル誘導体と反応させ、置換されているメチ
レン基を有する一般式Ｉの化合物を形成することによっ
て行うことができる。この合成で生じる置換されているメチレン基を有する化
合物は、一般式II：Ｒ_３−Ｘ II ［式中Ｘは前記のものを表わし、Ｒ_３はグルコース単位
３〜８個を有する１価のオリゴグルコシド基を表わす］
の化合物を、ｐ−トルオールスルホン酸の存在で一般式
III：［式中Ｒ_４及びＲ_５は一方が水素原子、他方がメチル基
又はフェニル基を表わす］の化合物と極性有機溶剤中で
反応させることによって製造される。極性有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド又はホル
ムアミドが好ましいが、比較される塩基度を有する他の
極性有機溶剤も適当である。意外なことにも、前記反応によって均一な生成物が得ら
れ、存在する多くのＯＨ基を保護することは不必要であ
る。場合により形成した副産物は容易に分離することが
できる。反応は好ましくは温度約１０〜７０℃、好ましくは室温
で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分な
収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の一
般式IIIの化合物で作業する。一般式IIIの化合物の例は、ジメトキシエタン及びフェ
ニルジメトキシメタンである。一般式IIの化合物の例は、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス及び末端で光学的に測定される基によって置換されて
いるこれらの誘導体、例えばモノニトロフェニル−マル
トヘプタオース、３，４−ジニトロフェニル−マルトヘ
プタオースその他である。本発明による化合物のすぐれた保管貯蔵性は基質として
のｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(G₇pNP)での
十分に普及した常用のα−アミラーゼの呈色試験の条件
下、即ち緩衝液のpH７．１；NaCl５０ｍＭ；α−グルコ
シダーゼ約３０Ｕ／ml；基質５ｍＭで、４，６−エチリ
デン−ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(Eth-G₇p
NP)で２５℃で４日間内のラグ相及び線型に関する実際
に同じ反応経過でグルコースは形成しないが、G₇pNPで
は著しいグルコースへの分解が生じることを示す。４℃
での同じ条件下では、本発明による基質で８日間後にグ
ルコースの形成は生じなかったが、これに反して公知比
較基質では著しい分解が生じた。それ故本発明によっ
て、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダーゼの
存在ですぐれた性質を有する新規化合物が得られる。実施例例１４，６−エチリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マ
ルトヘプタオシドの製造法。バッチ：４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド
２５０ｇ（１９６ｍモル）アセトアルデヒド−ジメチルアセタール３１．５ml（２９７ｍモル）パラートルオールスルホン酸・Ｈ_２Ｏ２０ｇＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）１．５ｌ合成：４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド２５
０ｇ及びパラートルオールスルホン酸・Ｈ_２Ｏ２０ｇ
をＤＭＦ約１．５ｌにとかし、無水にするために回転蒸
発器で回転させて乾燥する。その際水の含量が０．４％
から０．０２％に下がる。残渣をＤＭＦ１．５ｌにとかし、アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール３１．５mlを添加し、先ず５０℃で９
時間撹拌し、次いで室温で約１０時間維持する。反応混
合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化リチウム
溶液でpH７．３に調節し、濾過し、７５０mlに濃縮す
る。ＨＰＬＣ分析によって、原料約２０％を有するエチリデ
ン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド
約７５〜８０％の含量が得られる。クロマトグラフィーによる精製：試料溶液（７５０ml）を、Dowex５０ＷＸ２（２００
〜４００メッシュ）リチウム^＋７０ｌを有する１５０×
２５cmのカラムにあけ、水で流量１．５ｌ／時間で溶出
する。その際フラクション４．５ｌを採取し、クロマト
グラフィーを紫外線検出器を用いて２８０ｎｍで行う。約１００ｌによって未反応の４−ニトロフェニル−α−
Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約２００ｌによって
求める生成物が溶出する。生成物を含有するフラクションを合し、濃縮乾燥する。
残渣をメタノール１．５ｌにとかし、濾過し、０℃でイ
ソプロパノール４ｌ及び石油エーテル１０ｌで沈殿させ
る。４℃で１夜撹拌後に、生成物を吸引濾過し、イソプ
ロパノール及び石油エーテルで洗浄し、乾燥器中で３０
℃で乾燥する。収量：１５０ｇ（理論量の５８％）、無色の粉末、分子
量１３００。分析：Ｈ_２Ｏ［フィシャー(K.Fischer)による］４．５％イソプロパノール（ガスクロマトグラフィーによる）
５％酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド９１
％［α］_Ｄ２５℃（乾燥物質に対する）＝７７°（ｃ＝
１、Ｈ_２Ｏ）ＨＰＬＣ：面の％９９（−ＮＨ_２−柱５μ；アセトニト
リル／水１：１、ｃ−燐酸１ｍモル／ｌ、３０５ｎｍで
検波）。例２４，６−エチリデン−マルトヘプタオースの製造法。バッチ：マルトヘプタオース１０ｇ（８．７ｍモル）アセトアルデヒド−ジメチルアセタール１．８ml （１
７ｍモル）パラ−トルオールスルホン酸・Ｈ_２Ｏ１ｇＤＭＦ７５ml 合成：マルトヘプタオース１０ｇ及びパラ−トルオールスルホ
ン酸・Ｈ_２Ｏ１ｇをＤＭＦ１００mlにとかし、濃縮乾
燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をＤＭＦ７
５mlにとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
１．７mlを加え、密閉して５０℃で１５時間撹拌する。
次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸
化リチウムでpH７に中和し、濾過し、５０mlに濃縮す
る。クロマトグラフィーによる精製：試料溶液５０mlを、Dowex５０ＷＸ２（２００〜４０
０メッシュ）Ｌ^＋３．５ｌを有するクロマトグラフィー
のカラム（１８０×５_ｃｍ）にあけ水で流量１５０ml／
時間で溶出する。紫外線検波器（２８０ｎｍ）を通るフ
ラクション３０mlを採取する。１．８ｌによりマルトヘプタオースが溶出し、２．２５
ｌによりエチリデン−マルトヘプタオースが溶出する。主要フラクションを合し、回転させて乾燥し水を若干添
加してメタノール２００mlにとかしイソプロパノール２
００mlを加え、４℃で撹拌する。その際生成物が沈殿
し、これを吸引濾過し、イソプロパノール及び石油エー
テルで洗浄し、真空中で２５℃でP₂O₅によって乾燥す
る。収量：６．２ｇ（理論量の６０％）分析：水［フィシャー(K.Fischer)による］７．６％酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド９１．２
％［α］_Ｄ２５℃（乾燥物質に対する）＝６９°（ｃ＝
１、Ｈ_２Ｏ）ＨＰＬＣ（例１の条件参照）：面の％９６テトラゾリウムブルーとの反応は、還元性末端が存在し
ないことを示す。例３（参考例）試薬：エチリデン−G₇pNP６８２．５mg（５．２５ｍモル／
ｌ）を、塩化ナトリウム（５２．５ｍモル／ｌ）並びに
アルファーグルコシダーゼ（４２Ｕ／ml）を含有する燐
酸ナトリウム緩衝液１００ml（１０５ｍモル／ｌ）にと
かし、pH７．１０に調節した。試験の最終濃度：燐酸塩緩衝液１００ｍモル／ｌ、NaCl５０ｍモル／ｌ、
基質５ｍモル／ｌ、アルファーグルコシダーゼ４０Ｕ／
ml。試験バッチ：２５℃に加熱した試薬２．０mlに試料０．１mlを添加
し、混合物を２５℃に加熱した。予培養時間４分間（ラ
グ相）後に、吸光の増大をＨｇ４０５ｎｍでエッペンド
ルフ(Eppendorf)光度計で記録した。毎分の吸光の変化
（ΔＥ／分）から、試料中のアミラーゼの活性を次式に
よって計算した。アルファーアミラーゼの再発見：活性の測定を、４℃及び２５℃で保存した試薬で一定の
時間間隔でくり返し、次の値が得られた。個々の値は、手工による酵素の活性に測定に対する通常
の変動巾である。

Claims

【訂正明細書】【特許請求の範囲】【請求項１】一般式Ｉ：［式中ＲとＲ_１は、一方が水素原子、他方がエチル基又
はフェニル基を表わし、Ｒ_２はグルコース単位２〜７個
を有する２価のオリゴグルコシド基を表わし、Ｘは水素
原子又は光学的に測定される基を表わす］の化合物。【請求項２】Ｘがニトロフェニル基を表わす特許請求の
範囲第１項記載の化合物。