JP790H - Oligoglucoside derivative - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、オリゴグルコシド誘導体に関する。
従来の技術
血清中のα−アミラーゼの測定は、すいぞうの機能の重
要な臨床上のパラメータである。α−アミラーゼを測定
するために市場で得られる試薬は、以前には主として基
質としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。しかし
ながらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であるこ
とが判明した。それ故この欠点を除去するために、澱粉
及び澱粉誘導体をオリゴサッカリド及びその光学的に測
定される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラオー
ス、−ペンタオース、−ヘキサオース及び−ヘプタオー
ス及びこれらの誘導体によって重要な改良が得られた
（ドイツ公開特許第２７４１１９２号明細書、ドイツ公
開特許第２７５５８０３号明細書、米国特許第３８７９
２６３号明細書、米国特許第４００００４２号明細
書）。
前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラーゼ測定
の特に重要な実施形式は、α−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある（ドイツ公開特許第2741192号明細書参照）。
しかしながら、助酵素のα−グルコシダーゼは、でき上
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはα−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。
発明が解決しようとする問題点
それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去し、α−グ
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することができ、α
−アミラーゼの検出の正確性を改良するα−アミラーゼ
の基質を得ることである。
問題点を解決するための手段
この課題は、本発明によれば、一般式Ｉ：
［式中ＲとＲ１は、一方が水素原子、他方がメチル基又
はフェニル基を表わし、Ｒ２はグルコース単位２〜７個
を有する２価のオリゴグルコシド基を表わし、Ｘは水素
原子又は光学的に測定される基を表わす］の化合物によ
って解決される。
本発明による化合物ですぐ使える試薬は、α−グルコシ
ダーゼの存在でも変化をこうむらずそれ故長時間後にも
正確なα−アミラーゼの値が得られる。
Ｒ２の２価のオリゴグルコシド基は、式
（式中、ｎは２〜７の整数を表わす）で表わされ、グル
コース単位３、４及び６個を有するものが好ましい。
Ｘが光学的に測定される基の場合には、それ自体、可視
光線又は紫外線の帯域でも色を有する基であり、その際
に、置換基を有しないフェニル基は除かれる。例えばニ
トロフェニル基又は３，４−ジニトロフェニル基であ
る。
本発明による化合物の製造は、末端に基Ｘを有するグル
コース単位３〜８個を有するオリゴグルコシドから出発
して、これをエステル化又はエーテル化の条件下にオル
トオキシ化合物、好ましくはジアルコキシエタン又は相
応するベンジル誘導体と反応させ、置換されているメチ
レン基を有する一般式Ｉの化合物を形成することによっ
て行うことができる。
この合成で生じる置換されているメチレン基を有する化
合物は、一般式II：
Ｒ３−Ｘ II
［式中Ｘは前記のものを表わし、Ｒ３はグルコース単位
３〜８個を有する１価のオリゴグルコシド基を表わす］
の化合物を、ｐ−トルオールスルホン酸の存在で一般式
III：
［式中Ｒ４及びＲ５は一方が水素原子、他方がメチル基
又はフェニル基を表わす］の化合物と極性有機溶剤中で
反応させることによって製造される。
極性有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド又はホル
ムアミドが好ましいが、比較される塩基度を有する他の
極性有機溶剤も適当である。
意外なことにも、前記反応によって均一な生成物が得ら
れ、存在する多くのＯＨ基を保護することは不必要であ
る。場合により形成した副産物は容易に分離することが
できる。
反応は好ましくは温度約１０〜７０℃、好ましくは室温
で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分な
収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の一
般式IIIの化合物で作業する。
一般式IIIの化合物の例は、ジメトキシエタン及びフェ
ニルジメトキシメタンである。
一般式IIの化合物の例は、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス及び末端で光学的に測定される基によって置換されて
いるこれらの誘導体、例えばモノニトロフェニル−マル
トヘプタオース、３，４−ジニトロフェニル−マルトヘ
プタオースその他である。
本発明による化合物のすぐれた保管貯蔵性は基質として
のｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(G7pNP)での
十分に普及した常用のα−アミラーゼの呈色試験の条件
下、即ち緩衝液のpH７．１；NaCl５０ｍＭ；α−グルコ
シダーゼ約３０Ｕ／ml；基質５ｍＭで、４，６−エチリ
デン−ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(Eth-G7p
NP)で２５℃で４日間内のラグ相及び線型に関する実際
に同じ反応経過でグルコースは形成しないが、G7pNPで
は著しいグルコースへの分解が生じることを示す。４℃
での同じ条件下では、本発明による基質で８日間後にグ
ルコースの形成は生じなかったが、これに反して公知比
較基質では著しい分解が生じた。それ故本発明によっ
て、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダーゼの
存在ですぐれた性質を有する新規化合物が得られる。
実施例
例１
４，６−エチリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マ
ルトヘプタオシドの製造法。
バッチ：
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド
２５０ｇ（１９６ｍモル）
アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
３１．５ml（２９７ｍモル）
パラートルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ ２０ｇ
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド） １．５ｌ
合成：
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド２５
０ｇ及びパラートルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ ２０ｇ
をＤＭＦ約１．５ｌにとかし、無水にするために回転蒸
発器で回転させて乾燥する。その際水の含量が０．４％
から０．０２％に下がる。
残渣をＤＭＦ１．５ｌにとかし、アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール３１．５mlを添加し、先ず５０℃で９
時間撹拌し、次いで室温で約１０時間維持する。反応混
合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化リチウム
溶液でpH７．３に調節し、濾過し、７５０mlに濃縮す
る。
ＨＰＬＣ分析によって、原料約２０％を有するエチリデ
ン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド
約７５〜８０％の含量が得られる。
クロマトグラフィーによる精製：
試料溶液（７５０ml）を、Dowex５０ ＷＸ２（２００
〜４００メッシュ）リチウム＋７０ｌを有する１５０×
２５cmのカラムにあけ、水で流量１．５ｌ／時間で溶出
する。その際フラクション４．５ｌを採取し、クロマト
グラフィーを紫外線検出器を用いて２８０ｎｍで行う。
約１００ｌによって未反応の４−ニトロフェニル−α−
Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約２００ｌによって
求める生成物が溶出する。
生成物を含有するフラクションを合し、濃縮乾燥する。
残渣をメタノール１．５ｌにとかし、濾過し、０℃でイ
ソプロパノール４ｌ及び石油エーテル１０ｌで沈殿させ
る。４℃で１夜撹拌後に、生成物を吸引濾過し、イソプ
ロパノール及び石油エーテルで洗浄し、乾燥器中で３０
℃で乾燥する。
収量：１５０ｇ（理論量の５８％）、無色の粉末、分子
量１３００。
分析：
Ｈ２Ｏ［フィシャー(K.Fischer)による］ ４．５％
イソプロパノール（ガスクロマトグラフィーによる）
５％
酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド ９１
％
［α］Ｄ２５℃（乾燥物質に対する）＝７７°（ｃ＝
１、Ｈ２Ｏ）
ＨＰＬＣ：面の％９９（−ＮＨ２−柱５μ；アセトニト
リル／水１：１、ｃ−燐酸１ｍモル／ｌ、３０５ｎｍで
検波）。
例２
４，６−エチリデン−マルトヘプタオースの製造法。
バッチ：
マルトヘプタオース１０ｇ（８．７ｍモル）
アセトアルデヒド−ジメチルアセタール１．８ml （１
７ｍモル）
パラ−トルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ １ｇ
ＤＭＦ ７５ml
合成：
マルトヘプタオース１０ｇ及びパラ−トルオールスルホ
ン酸・Ｈ２Ｏ １ｇをＤＭＦ１００mlにとかし、濃縮乾
燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をＤＭＦ７
５mlにとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
１．７mlを加え、密閉して５０℃で１５時間撹拌する。
次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸
化リチウムでpH７に中和し、濾過し、５０mlに濃縮す
る。
クロマトグラフィーによる精製：
試料溶液５０mlを、Dowex５０ ＷＸ２（２００〜４０
０メッシュ）Ｌ＋３．５ｌを有するクロマトグラフィー
のカラム（１８０×５ｃｍ）にあけ水で流量１５０ml／
時間で溶出する。紫外線検波器（２８０ｎｍ）を通るフ
ラクション３０mlを採取する。
１．８ｌによりマルトヘプタオースが溶出し、２．２５
ｌによりエチリデン−マルトヘプタオースが溶出する。
主要フラクションを合し、回転させて乾燥し水を若干添
加してメタノール２００mlにとかしイソプロパノール２
００mlを加え、４℃で撹拌する。その際生成物が沈殿
し、これを吸引濾過し、イソプロパノール及び石油エー
テルで洗浄し、真空中で２５℃でP2O5によって乾燥す
る。
収量：６．２ｇ（理論量の６０％）
分析：
水［フィシャー(K.Fischer)による］７．６％
酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド９１．２
％
［α］Ｄ２５℃（乾燥物質に対する）＝６９°（ｃ＝
１、Ｈ２Ｏ）
ＨＰＬＣ（例１の条件参照）：面の％ ９６
テトラゾリウムブルーとの反応は、還元性末端が存在し
ないことを示す。
例３（参考例）
試薬：
エチリデン−G7pNP６８２．５mg（５．２５ｍモル／
ｌ）を、塩化ナトリウム（５２．５ｍモル／ｌ）並びに
アルファーグルコシダーゼ（４２Ｕ／ml）を含有する燐
酸ナトリウム緩衝液１００ml（１０５ｍモル／ｌ）にと
かし、pH７．１０に調節した。
試験の最終濃度：
燐酸塩緩衝液１００ｍモル／ｌ、NaCl５０ｍモル／ｌ、
基質５ｍモル／ｌ、アルファーグルコシダーゼ４０Ｕ／
ml。
試験バッチ：
２５℃に加熱した試薬２．０mlに試料０．１mlを添加
し、混合物を２５℃に加熱した。予培養時間４分間（ラ
グ相）後に、吸光の増大をＨｇ４０５ｎｍでエッペンド
ルフ(Eppendorf)光度計で記録した。毎分の吸光の変化
（ΔＥ／分）から、試料中のアミラーゼの活性を次式に
よって計算した。
アルファーアミラーゼの再発見：
活性の測定を、４℃及び２５℃で保存した試薬で一定の
時間間隔でくり返し、次の値が得られた。個々の値は、手工による酵素の活性に測定に対する通常
の変動巾である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to oligoglucoside derivatives. Prior art Measurement of α-amylase in serum is an important clinical parameter of pancreatic function. The commercially available reagents for measuring α-amylase have previously been mainly the use of starch or starch derivatives as substrates. However, this substrate proved to be insufficient, especially with regard to homogeneity. To eliminate this disadvantage, therefore, starch and starch derivatives are replaced by oligosaccharides and their optically determined derivatives, especially by maltotetraose, -pentaose, -hexaose and -heptaose and their derivatives. Significant improvements have been obtained (German Published DE 2741192, German Published DE 2755803, US Pat. No. 3879).
263, U.S. Pat. No. 4,400,421). A particularly important implementation of α-amylase assay using the oligoglucoside was obtained in the presence of α-glucosidase. This is because a complete decomposition of oligoglucosides into glucose was obtained, and glucose could easily be measured by known methods for this (see DE-A 2741192). However, the coenzyme α-glucosidase was found to reduce the storage and storage time of the resulting reagent mixture. This is because it has no effect of α-amylase and causes a constant degradation of oligoglucosides. Problems to be Solved by the Invention Therefore, the object of the present invention is to eliminate these drawbacks, and it is possible to sufficiently preserve even in the presence of α-glucosidase,
To obtain a substrate for α-amylase which improves the accuracy of detection of amylase. According to the invention, the problem is solved by the general formula I: [Wherein one of R and R 1 represents a hydrogen atom and the other represents a methyl group or a phenyl group, R 2 represents a divalent oligoglucoside group having 2 to 7 glucose units, and X represents a hydrogen atom or an optical group. Representing a group that is determined in a typical manner]. The ready-to-use reagents for the compounds according to the invention do not undergo changes in the presence of α-glucosidases and therefore give accurate α-amylase values even after a long time. The divalent oligoglucoside group of R 2 has the formula (Wherein n represents an integer of 2 to 7), and those having 3, 4 and 6 glucose units are preferable. If X is an optically measurable group, it is itself a group which also has a color in the visible or UV range, the phenyl groups having no substituents being excluded. For example, it is a nitrophenyl group or a 3,4-dinitrophenyl group. The preparation of the compounds according to the invention starts from oligoglucosides having 3 to 8 glucose units having a group X at the end, which under the conditions of esterification or etherification are orthooxy compounds, preferably dialkoxyethanes or correspondingly. Reaction with a benzyl derivative to form a compound of general formula I having a substituted methylene group. The compound having a substituted methylene group generated in this synthesis is represented by the general formula II: R 3 -X II [wherein X represents the above-mentioned, R 3 represents a monovalent oligo with 3 to 8 glucose units. Represents a glucoside group]
In the presence of p-toluol sulfonic acid
III: It is produced by reacting with a compound of the formula [wherein R 4 and R 5 represent one hydrogen atom and the other represents methyl group or phenyl group] in a polar organic solvent. Preferred polar organic solvents are dimethylformamide or formamide, but other polar organic solvents having comparable basicities are also suitable. Surprisingly, the reaction results in a homogeneous product and it is not necessary to protect the many OH groups present. The optional by-products can be easily separated. The reaction is preferably carried out at a temperature of about 10-70 ° C, preferably room temperature. In order to obtain a sufficient yield, it is preferred to work with a stoichiometric excess of the compound of general formula III, since the reaction produces very few by-products. Examples of compounds of general formula III are dimethoxyethane and phenyldimethoxymethane. Examples of compounds of general formula II are maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose and derivatives thereof such as mononitrophenyl-maltohepta which are substituted at the end by groups which are optically determined. Aose, 3,4-dinitrophenyl-maltoheptaose and others. The excellent storability of the compounds according to the invention is due to the well-known and conventional α-amylase color test under p-nitrophenylmaltoheptaoside (G 7 pNP) as a substrate, namely in the buffer. pH 7.1; NaCl 50 mM; α-glucosidase about 30 U / ml; substrate 5 mM, 4,6-ethylidene-p-nitrophenylmaltoheptaoside (Eth-G 7 p
NP) does not form glucose in the same course of reaction for the lag phase and linear within 4 days at 25 ° C., but shows that G 7 pNP causes significant degradation to glucose. 4 ° C
Under the same conditions as above, the formation of glucose did not occur after 8 days with the substrate according to the invention, whereas, on the contrary, significant degradation occurred with the known comparative substrate. The present invention therefore provides novel compounds which have excellent properties in the presence of α-glucosidase as a substrate for α-amylase. Example 1 Method for producing 4,6-ethylidene-4-nitrophenyl-α-D-maltoheptaoside. Batch: 4-nitrophenyl-α-D-maltoheptaoside
250 g (196 mmol) Acetaldehyde-dimethyl acetal 31.5 ml (297 mmol) Paratoluol sulfonic acid / H 2 O 20 g DMF (dimethylformamide) 1.5 l Synthesis: 4-nitrophenyl-α-D-maltoheptaoside 25
0 g and paratoluolsulfonic acid / H 2 O 20 g
Is dissolved in about 1.5 l of DMF and tumbled on a rotary evaporator to dryness. At that time, the water content is 0.4%
To 0.02%. The residue is dissolved in DMF (1.5 L), acetaldehyde-dimethyl acetal (31.5 ml) is added, and first, at 50 ° C., 9 ml is added.
Stir for hours and then maintain at room temperature for about 10 hours. The reaction mixture is concentrated to dryness, the residue is taken up in water, adjusted to pH 7.3 with lithium hydroxide solution, filtered and concentrated to 750 ml. HPLC analysis gives a content of about 75-80% ethylidene-4-nitrophenyl-α-D-maltoheptaoside with about 20% starting material. Purification by chromatography: A sample solution (750 ml) was added to Dowex50 WX2 (200
~ 400 mesh) 150 x with lithium + 70 l
Pour into a 25 cm column and elute with water at a flow rate of 1.5 l / h. 4.5 liters of the fraction are then taken and the chromatography is carried out at 280 nm using a UV detector. Unreacted 4-nitrophenyl-α-with about 100 l
The D-maltoheptaoside elutes and the product sought with about 200 l elutes. The fractions containing the product are combined and concentrated to dryness.
The residue is dissolved in 1.5 l of methanol, filtered and precipitated at 0 ° C. with 4 l of isopropanol and 10 l of petroleum ether. After stirring overnight at 4 ° C., the product is suction filtered, washed with isopropanol and petroleum ether and dried in an oven at 30 ° C.
Dry at ℃. Yield: 150 g (58% of theory), colorless powder, molecular weight 1300. Analysis: H 2 O [by K. Fischer] 4.5% isopropanol (by gas chromatography)
Acetaldehyde by 5% acidic hydrolysis (enzyme) 91
% [Α] D 25 ° C. (on dry matter) = 77 ° (c =
1, H 2 O) HPLC: % surface 99 (-NH 2 - Column 5 [mu]; acetonitrile / water 1: 1, c- phosphate 1m mol / l, detection at 305 nm). Example 2 Method for producing 4,6-ethylidene-maltoheptaose. Batch: Maltoheptaose 10 g (8.7 mmol) Acetaldehyde-dimethyl acetal 1.8 ml (1
7m mol) para - toluenesulfonic acid · H 2 O 1g DMF 75ml Synthesis: maltoheptaose 10g and para - dissolved toluenesulfonic acid · H 2 O 1 g in 100 ml of DMF, concentrated to dryness. The residue is dried in this way. The residue is DMF7
After dissolving in 5 ml, 1.7 ml of acetaldehyde-dimethyl acetal is added, and the mixture is sealed and stirred at 50 ° C. for 15 hours.
The reaction solution is then concentrated to dryness, the residue dissolved in water, neutralized to pH 7 with lithium hydroxide, filtered and concentrated to 50 ml. Purification by chromatography: 50 ml of the sample solution was added to Dowex 50 WX2 (200-40).
(0 mesh) L + 3.5 l on a chromatographic column (180 x 5 cm ) having a flow rate of 150 ml / water.
Elute in time. Collect 30 ml fraction passing through UV detector (280 nm). Maltoheptaose was eluted with 1.8 l and 2.25
Ethylidene-maltoheptaose is eluted by l. The main fractions were combined, vortexed to dryness, a little water added and dissolved in 200 ml of methanol and isopropanol 2
Add 00 ml and stir at 4 ° C. A product precipitates which is filtered off with suction, washed with isopropanol and petroleum ether and dried over P 2 O 5 at 25 ° C. in vacuo. Yield: 6.2 g (60% of theory) Analysis: Water [by K. Fischer] 7.6% Acetaldehyde by acid hydrolysis (enzyme) 91.2
% [Α] D 25 ° C. (on dry matter) = 69 ° (c =
1, H 2 O) HPLC (see conditions in Example 1): Reaction of the surface with% 96 tetrazolium blue shows the absence of reducing ends. Example 3 (reference example) Reagent: ethylidene-G 7 pNP 682.5 mg (5.25 mmol /
l) was dissolved in 100 ml of sodium phosphate buffer (105 mmol / l) containing sodium chloride (52.5 mmol / l) and alpha-glucosidase (42 U / ml) and adjusted to pH 7.10. Final concentration of the test: Phosphate buffer 100 mmol / l, NaCl 50 mmol / l,
Substrate 5 mmol / l, alpha-glucosidase 40U /
ml. Test batch: 0.1 ml sample was added to 2.0 ml reagent heated to 25 ° C and the mixture was heated to 25 ° C. After a preincubation time of 4 minutes (lag phase), the increase in absorbance was recorded at Hg 405 nm on an Eppendorf photometer. From the change in absorbance per minute (ΔE / min), the activity of amylase in the sample was calculated by the following formula. Rediscovery of Alpha Amylase: Activity measurements were repeated at regular time intervals with reagents stored at 4 ° C and 25 ° C, giving the following values. The individual values are the usual fluctuations for the measurement of enzyme activity by hand.
Claims (1)
はフェニル基を表わし、Ｒ２はグルコース単位２〜７個
を有する２価のオリゴグルコシド基を表わし、Ｘは水素
原子又は光学的に測定される基を表わす］の化合物。 【請求項２】Ｘがニトロフェニル基を表わす特許請求の
範囲第１項記載の化合物。[Correction specification] [Claims] [Claim 1] General formula I: [Wherein one of R and R 1 represents a hydrogen atom, the other represents an ethyl group or a phenyl group, R 2 represents a divalent oligoglucoside group having 2 to 7 glucose units, and X represents a hydrogen atom or an optical group. Representing a group that is measured in a specific manner]. 2. The compound according to claim 1, wherein X represents a nitrophenyl group.
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