SI8411385A8 - Postopek za pripravo derivatov oligoglukozida - Google Patents

Description

Postopek za pripravo derivatov oligoglukozida

Tehnično področje izuma

C 07 H 3/06; A 61 K 49/00.

Predloženi izum se nanaša na področje kemijske tehnologije, specifično na nov postopek za pripravo novih derivatov oligoglukozida, ki so uporabni kot substrat za določevanje alfa-amilaze.

Tehnični problem

Obstajala je potreba po ugotovitvi novega, tehnološko naprednega postopka za pripravo novih derivatov oligoglukozida, uporabnih kot substrat za določevanje alfa-amilaze, v dobrih do bitkih in v zadovoljivi čistoči.

Stanje tehnike

Derivati oligoglukozida s formulo (I), navedeni v nadaljevanju, so novi, zato postopek za njihovo pripravo še ni bil opisan.

Za informacijo pa navajamo v nadaljevanju stanje tehnike na področju določevanja alfa-amilaze.

Določevanje koncentracije alfa-amilaze v serumu je pomemben kliničen parameter za funkcijo želodčne slinavke.

Tržno običajni reagenti za določevanje alfa-amilaze so bili prej pretežno uravnani na uporabo škroba ali škrobovih derivatov kot substratov. Ti substrati pa so se izkazali kot nezadovoljivi zlasti glede enotnosti. Da so se izognili tem pomanjkljivostim so zato škrob inškrobove derivate nadomestili z oligosaharidi. In njihovimi optično določljivimi derivati, pri čemer so zlasti maltotetraoza?.. -pentaoza, -heksaoza in -heptaoza in njihovi derivati dajali zanimive izboljšave (DE-OS 27 41 192, DE-OS 27 55 803, US-PS 3 879 263,

US-PS 4 000 042) .

Posebno zanimiva izvedbena oblika določevanja alfaamilaze ob uporabi navedenih oligoglukozidov se je pokazala v prisotnosti alfa-glukozidaze, ker se je pri tem dalo doseči popolno razgradnjo oligoglukozida v glukozo in se je dalo nato glukozo zlahka določiti po za to znanih postopkih (prim. DE-OS 27 41 192).

Vendar pa se je izkazalo, da pomožni encim alfa-glukozidaza zmanjša skladiščno dobo gotove reagenčne zmesi, ker tudi brez učinkovanja alfa-amilaze izzove določeno cepitev oligoglukozida.

- 3 Opis rešitve tehničnega problema z izvedbenimi primeri

Zato sloni izum na nalogi, da ustvari postopek za pripravo substrata za alfa-amilazo, ki bi bil dovolj skladiščno sposoben, tudi v prisotnosti alfa-glukozidaze, in bi izboljšal pravilnost dokaza alfa-amilaze.

V smislu izuma rešimo to nalogo s pripravo spojin s splošno formulo I

v kateri R in neodvisno drug od drugega pomenita vsakokrat ravno ali razvejeno alkilno ali alkoilno skupino z 1 do 6 atomi ogljika ali fenilni ostanek, pri čemer R in R^ lahko tvorita tudi skupaj metilenski most, katerih atomi vodikov so neodvisno drug od drugega lahko substituirani s po eno alkilno skupino z 1 do 5 atomi ogljika ali fenilno skupino, R₂ predstavlja oligoglukozidni ostanek z 2 do 7 glukoznimi enotami in X atom vodika ali optično določljiv ostanek, zlasti nitrofenilno skupino.

Pokazalo pa se je, da s spojinami, dobljenimi v smislu izuma, reagent, gotov za uporabo,tudi v prisotnosti alfa-glukozidaze ne utrpi nobenih sprememb in zato daje tudi na daljšo dobo pravilne vrednosti za alfa-amilazo.

Kot alkilne skupine naj navedemo metiino, etilno, propilno, izopropilno, butilno, izobutilno, t-butilno, n-pentilno skupino, njihove izomere, n-heksilno skupino, njene izomere, kot tudi cikloheksilno skupino. Prav tako pridejo v poštev alkoilne skupine, ki ustrezajo navedenim alkilnim skupinam, kot substituenti na atomih kisika v legi 4 in/ali 6 glukozidnega ostanka v končnem položaju. V okviru izuma so prednostne tiste spojine, kjer R in R^ skupaj tvorita v danem primeru substituiran metilenski most, posebno prednostne pa tiste, ki so substituirane z alkilno skupino ali fenilno skupino, zlasti etilidenska ali benzilidenska skupina.

Izmed oligoglukozidnih ostankov R^ dajemo prednost tistim s 3, 4 in 6 glukoznimi enotami.

Kadar je X optično določljiv ostanek, gre lahko za ostanek, ki pokaže celo v vidnem ali UV-območju obarvanje, ali za ostanek, ki postane s presnovo z nadaljnjo spojino optično določljiv, npr. s prevedbo v barvilo ali s pripajanjem z barvilom. Tovrstni, optično določljivi ostanki, so strokovnjaku običajni in jih tukaj ni treba bliže pojasnjevati. Prednostni so nitro skupine vsebujoči fenilni ostanki kot nitrofenilna .«ali 3,4-dinitrofenilna skupina.

Priprava spojin v smislu izuma lahko poteka izhajajoč iz oligoglukozidov s 3 do 8 glukoznimi enotami, ki v končni legi nosijo v danem primeru optično določljivo skupino X, tako, da le-te pri pogojih zaestrenja ali zaetrenja presnovimo z ortooksi spojino, prednostno z dialkoksietanom ali ustreznim benzilnim derivatom, ob tvorbi spojine s splošno formulo I, v kateri R in R^ skupaj tvorita v danem primeru substituirano metilensko skupino in v danem primeru zatem blokiramo proste .OH-skupine, npr. s peracetiliranjem, da cepimo metilenski most na atomu kisika v legi 4 ali 6 ter po potrebi tako tvorjeno prosto OH-skupino v legi 4 ali 6 ponovno zaetrimo ali zaestrimo oz. preetrimo ali preestrimo, nakar odcepimo preostale OH-blokirne skupine, npr. acetilne skupine.

Spojine z v danem primeru substituiranim metilenskim mostom, ki nastopajo pri tej sintezi kot intermediati in so sicer tudi prednostne kot končni produkti, pripravimo v smislu izuma tako, da spojino s splošno formulo II r₃-x II kjer ima X zgoraj navedeni pomen in je R^ oligoglukozidni ostanek s 3 do 8 glukoznimi enotami, presnovimo v prisotnosti p-toluolsulfonske kisline s spojino s splošno formulo III ^R5

Rjj-i-(O-nižji alkil)₂ III v kateri R^ in R^ neodvisno drugod drugega pomenita vsakokrat atom vodika ali alkilno skupino z 1 do 5 atomi ogljika ali fenilno skupino, v polarnem organskem topilu.

Kot polarno organsko topilo uporabimo prednostno dimetilformamid ali formamid, primerna pa so tudi druga polarna organska topila s primerljivo bazičnostjo.

Navedena presnova vodi presenetljivo do enotnih produktov, ne da bi morali zaščititi prisotne, številne OH-skupine. Eventualno tvorjeni stranski produkti se dajo brez težav odločiti.

- 6 Presnovo izvedemo smotrno pri temperaturah med okoli 10 in okoli 70 °C, prednostna pa je sobna temperatura. Ker se pri presnovi komajda tvorijo stranski produkti, delamo za doseganje boljših dobitkov prednostno s stehiometričnim prebits kom spojine s splošno formulo III.

Primeri za spojine s splošno formulo III so dimetoksimetan, dimetoksietan, dietoksietan, dipropoksietan, dibutoksietan, dimetoksipropan, dimetoksiizopropan in fenildimetoksietan.

Primeri za spojine s splošno formulo II so maltotetra· oza, maltopentaoza, maltoheksaoza, maltoheptaoza in njihovi de rivati, substituirani v končni legi z optično določljivo skupino, kot sta mononitrofenil-maltoheptaoza, 3,4-dinitrofenilmaltoheptaoza itd.

Izboljšana skladiščna sposobnost spojin s formulo I se pokaže v tem, da se pri pogojih na široko razširjenega, na tržišču običajnega alfa-amilaznega barvnega testa s pni trof enil -Tnaltoheptacrzidom kot substratom (G^pNP), namreč: pufer pH 7,1; NaCl 50 mM; okoli 30 U/ml alfa-glukozidaze;

mM substrata pri praktično identičnih reakcijskih pogojih ! glede Lag-faze in linearnosti s 4,6-etiliden-p-nitrofenilmaltoheptaozida (Eth-G^pNP) v teku 4 dni pri 25 °C praktično ne tvori več glukoza, medtem ko pride s G₇pNP do znatne cepitve v glukozo. Pri enakih pogojih pri 4 °C s substratom s formu< Ιο I po 8 dneh ni prišlo do nobene tvorbe glukoze, pri znanem primerjalnem substratu nasprotno pa do razločne cepitve. V smislu izuma zato ustvarjamo nove spojine, ki kažejo kot substrati za alfa-amilazo v prisotnosti alfa-glukozidaze boljše lastnosti.

Naslednji primeri pojasnjujejo izum.

PRIMER 1

Postopek za pripravo 4,6-etiliden-4-nitrofenil-alfa-Dmaltoheptaozida

Nastavek:

250 g (196 mmolov) 4-nitrofenil-alfa-D-maltoheptaozida

31.5 ml (297 mmolov) acetaldehida-dimetilacetala g p-toluolsulfonske kisline . HgO

1.5 litrov DMF (dimetilformamida)

Sinteza:

250 g 4-nitrofenil-alfa-D-maltoheptaozida in 20 g p-toluolsulfonske kisline . HgO raztopimo v okoli 1,5 litrih DMF ter za absolutiranje oz. sušenje vrotiramo v rotacijski uparilnik. Pri tem pade vsebnost vode od 0,4 % na 0,02 %.

Preostanek raztopimo v 1,5 litrih DMF, dodamo 31,5 ml acetaldehid-dimetilacetala in najprej mešamo 9 ur pri 50 °C, nato pa še 10 ur vzdržujemo pri sobni temperaturi. Reakcijsko zmes uparimo do suhega, raztopimo preostanek v vodi, uravnamo z raztopino litijevega hidroksida na pH 7,3, bistro filtriramo in uparimo na 750 ml.

HPLC-analiza pokaže vsebnost okoli 75 do 80 % etiliden 4-nitrofenil-alfa-D-maltoheptaozida z okoli 20 % izhodnega mate riala.

Kromatografsko, čiščenje:

Raztopino vzorca (750 ml) nanesemo na 150x25 cm-kolono s 70 1 Dowex 50 WX2 (200 do 400 mesh) litija⁴' ter feluiramo z vodo s tokom 1,5 1/iiro. Pri tem zbiramo frakcije po 4,5 1 ter zasledujemo kromatografijo s pomočjo (JV-detektor ja pri 280 nm.

* Po okoli 100 1 Ainiramo nepresnovljeni 4-nitrofenilalfa-D-maltoheptsozid, po okoli 200 1 pa eluhramo iskani produkt

Frakcije, ki vsebujejo produkt, združimo in uparimo s sušenjem. Preostančkraztopimo v okoli 1,5 1 metanola, filtriramo in vipreoborimo pri 0 °C s 4 1 izopropanola in 10 1 petroletra. Po mešanju čez noč pri 4 °C produkt: odsesamo, izperemo z izopropanolom in petroletrom in sušimo pri 30 °C v sušilniku.

Dobitek: 150 g (58 % teor.), brezbarvni prah, molekulska masa

1300. ;

- . ' > . ‘ - · ^{; :}· ·'< *>' ·; - ··

HgO (po K. Fischerju) 4,5 %

Izopropanol (plinsko,kromatografsko) 5 %

Acetaldehid po kisli hidrolizi (encim.) 91 % £alfa7p 25 °C, z ozirom na suho snov = 77® (c=1, HgO)

HPLC: 99 ploskovnih odstotkov (5^im-NH₂-kolona; acetonitril/ voda 1:1, 1 mmol/1 c-fosforova kislina, detekcija pri 305 nm).

PRIMER 2

Postopek za pripravo 4,6-etiliden-maltoheptaoze

Nastavek:

g (8,7 mmolov) maltoheptaoze

1,8 ml (17 mmolov) acetaldehid-dimetilacetala g p-toluolsulfonske kisline . HgO ml DMF

Sinteza:

g maltoheptaoze in 1 g p-toluolsulfonske kisline.H^O raztopimo v 100 ml DMF in uparimo do suhega. Na ta način prevedemo preostanek v brezvodno obliko. Preostanek raztopimo v 75 ml DMF, dodamo 1,7 ml acetaldehid-dimetilacetala in mešamo 15 ur pri 50 °C v zaprti posodi. Nato reakcijsko raztopino uparimo do suhega, preostanek raztopimo v vodi, nevtraliziramo z litijevih hidroksidom na pH 7, bistro filtriramo in koncentriramo na 50 ml.

Kromatografsko čiščenje:

ml vzorčne raztopine nanesemo na kromatografsko kolono (l80x5cm) s 3,5 1 Dowex 50 WX2 (200 do 400 mesh) Li⁺ ter eluiramo z vodo pri pretočni hitrosti 150 ml/uro. Zbiramo frakcije po 30 ml, ki se pretakajo skozi UV-detektor (280 nm)

Po 1,8 1 eluiramo maltoheptaozo, po 2,25 1 peluiramo etiliden-maltoheptaozo.

Glavne frakcije združimo, vrotiramo za sušenje, raztopimo v 200 ml metanola ob dodatku nekoliko vode, dodamo 200 ml izopropanola in mešamo pri 4 °C. Pri tem se izloči produkt, katerega odsesamo, izperemo z izopropanolom in petroletrom in sušimo v vakuumu pri 25 °C nad PgOg.

Dobitek: 6,2 g (60 % teor.)

Analitika: voda (po K.Fischerju) 7,6 %

Acetaldehid po kisli hidrolizi (encim.) 91,2 % *' o falfaJjj z ozirom na suho snov ('P= 1, H,,0) = 69

HPLC (pogoje glej pri primeru 1): 96 ploskovnih odstotkov.

Reakcija s tetrazolijevim modrim dokazuje, da je reducirni konec prost.

PRIMER 3

Reagent: 682,5 mg etiliden-G^PNP (5,25 mmolov/1) raztopimo v 100 ml natrijevega fosfatnega pufra (105 mmolov/1), ki vsebuje natrijev klorid (52,5 mmolov/1), kot tudi alfa-glukožidazo (42 U/ml) in.uravnamo.na pH.7,10.

Končna koncentracija pri testu: fosfatni pufer 100 mmolov/1, NaCl 50 mmolov/1, substrat 5 mmolov/1, alfaglukozidaza 40 U/ml.

Testni nastavek: K 2,0 ml na 25 °C temperiranega reagenta dodamo 0,1 ml vzorca in mešanico temperiramo na 25 °C. Po predhodnem inkubacijskem času 4 minut (lag faza) registriramo povečanje ekstinkcije pri Hg 405 nm na Eppendorfovem fotometru s pisalom. Iz spremembe ekstinkcije na minuto (AE/min) izračunamo aktivnost amilaze v vzorcih po naslednji formuli

-_E. _y . _d- = ΔΕ/min . 7000 £U/17

Ponovna ugotovitev alfa-amilaze: Določitev aktivnosti smo ponavljali pri 4 °C in z reagentom, skladiščenim pri 25 °C, v določenih časovnih obdobjih ter našli naslednje vrednosti:

Skladiščenje '	Humani	Humani	Kontrolni
reagenta	serum 1	serum 2	serum PNU 572
	U/l	U/l	U/l
Začetna vrednost <	118	383	214
4 ure pri 25 °C	120	379	214
8 ur pri 25 °C	120	391	216
24 ur pri 25 °C	113	360	209
32 ur pri 25 °C	120	392	217
48 ur pri 25 °C	126	382	214
8 ur pri 4 °C	119	370	210
24 ur pri 4 °C	118	387	215
48 ur pri 4 °C	123	393	208
72 ur pri 4 °C	113	401	?22 3
80 ur pri 4 °C %	121	375	219
Srednja vrednost/VK	119 3,2 %	383 3,0 %	214 2,i

Posamezne vrednosti leže v običajnem razponu nihanja vrednosti za ročne določitve aktivnosti encimov.

-tV'

Navedba o najboljši, prijaviteljici znani izvedbi za gospodarsko izkoriščanje izuma

Postopek za pripravo 4,6-etiliden-4-nitrofenil-alfa-Dmaltoheptaozida

Nastavek:

250 g (196 mmolov) 4-nitrofenil-alfa-D-maltoheptaozida

31.5 ml (297 mmolov) acetaldehida-dimetilacetala g p-toluolsul f onske kisline . H.,0

1.5 litrov DMF (dimetilformamida)

Sinteza:

250 g 4-nitrofeni1-alfa-D-maltoheptaozida in 20 g p-toluolsulfonske kisline . H^O raztopimo v okoli 1,5 litrih DMF ter za absolutiranje oz. sušenje vrotiramo v rotacijski uparilnik. Pri tem pade vsebnost vode od 0,4 % na 0,02 %.

Preostanek raztopimo v 1,5 litrih DMF, dodamo 31,5 ml acetaldehid-dimetilacetala in najprej mešamo 9 ur pri 50 °C, nato pa še 10 ur vzdržujemo pri sobni temperaturi. Reakcijsko zmes uparimo do suhega, raztopimo preostanek v vodi, uravnamo z raztopino litijevega hidroksida na pH 7,3, bistro filtriramo in uparimo na 750 ml.

HPLC-analiza pokaže vsebnost okoli 75 do 80 % etiliden4-nitrofenil-alfa-D-maltoheptaozida z okoli 20 % izhodnega materiala.

Kromatografsko. čiščenje:

Raztopino vzorca (750 ml) nanesemo na 150x25 cm-kolono s 70 1 Dowex 50 WX2 (200 do 400 mesh) litija* ter bluiramo z

-β vodo s tokom 1,5 1/uro. Pri tem zbiramo frakcije po 4,5 1 ter zasledujemo kromatografijo s pomočjo UV-detektorja pri

280 nm.

Po okoli 100 1 pini ramo nepresnovl j eni 4-nitrofenilalfa-D-maltohepteozid, po okoli 200 1 pa elui ramo iskani produkt.

Frakcije, ki vsebujejo produkt, združimo in uparimo s sušenjem. Preostanek raztopimo v okoli 1,5 1 metanola, filtriramo in : preoborimo pri 0 °C s 4 1 izopropanola in 10 1 petroletra. Po mešanju čez noč pri 4 °C produkt; odsesamo, izperemo z izopropanolom in petroletrom in sušimo pri 30 °C v sušilniku.

Dobitek: 150 g (58 % teor.), brezbarvni prah, molekulska masa

1300.

H^O (po K. Fischerju) 4,5 %

Izopropanol (plinsko. : kroraatografsko) 5 %

Acetaldehid po kisli hidrolizi (encim.) 91 % £alfa7_D 25 °C, z ozirom na suho snov = 77^ (c=1, HgO)

HPLC: 99 ploskovnih odstotkov (S^um-NI^-kolona; acetonitril/ voda 1:1, 1 mmol/1 c-fosforova kislina, detekcija pri 305 nm).

Reagent: 682,5 mg etiliden-G^PNP (5,25 mmolov/1) raztopimo v 100 ml natrijevega fosfatnega pufra (105 mmolov/1), ki vsebuje natrijev klorid (52,5 mmolov/1), kot tudi alfa-glukozidazo (42 U/ml) in uravnamo na pH 7,10.

Končna koncentracija pri testu: fosfatni pufer 100 mmolov/1, NaCl 50 mmolov/1, substrat 5 mmolov/1, alfaglukozidaza 40 U/ml.

-*ΊTeatni nastavek: K 2,0 ml na 25 °C temperiranega reagenta dodamo 0,1 ml vzorca in mešanico temperiramo na 25 °C. Po predhodnem inkubacijskem času 4 minut (lag faza) registriramo povečanje ekstinkcije pri Hg 405 nm na Eppendorfovem fotometru s pisalom. Iz spremembe ekstinkcije na minuto (^E/min) izračunamo aktivnost amilaze v vzorcih po naslednji formuli

-_E-f - y _d-^J = ΔΕ/min . 7000 fU/17

Ponovna ugotovitev alfa-amilaze: Določitev aktivnosti smo ponavljali pri 4 °C in z reagentom, skladiščenim pri 25 °C, v

določenih časovnih obdobjih	ter našli	naslednje	vrednosti:
Skladiščenje	Humani	Humani	Kontrolni
reagenta	serum 1	serum 2	serum PNU 572
	U/l	U/l	U/l
Začetna vrednost	118	383	214
4 ure pri 25 °C	120	379	214
8 ur pri 25 °C	120	391	216
24 ur pri 25 °C	113	360	209
32 ur pri 25 °C	120	392	217
48 ur pri 25 °C	126	382	214
8 ur pri 4 °C	119	370	210
24 ur pri 4 °C	118	387	215
48 ur pri 4 °C	123	393	208
72 ur pri 4 °C	113	401	/22 3
80 ur pri 4 °C %	121	375	219
Srednja vrednost/VK	119 3,2 %	383 3,	0 % 214 2,

-/5Posamezne vrednosti leže v običajnem razponu nihanja vrednosti za ročne določitve aktivnosti encimov.

Claims (3)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Postopek za pripravo spojine s splošno formulo I v kateri R in R^ neodvisno drug od drugega pomenita vsakokrat ravno ali razvejeno alkilno ali alkoilno skupino z 1 do 6 atomi ogljika ali fenilni ostanek, pri čemer R in R^ lahko tvorita tudi skupaj metilenski most, katerega atomi vodika so neodvisno drug od drugega lahko substituirani s po eno alkilno skupino z 1 do 5 atomi ogljika ali fenilno-skupino,prednost no R in R^ skupaj tvorita etilidenski most, Rg predstavlja oligoglukozidni ostanek z 2 do 7 glukoznimi enotami in X atom vodika ali optično določljiv ostanek, zlasti nitrofenilno skupino, označen s tem, da spojino s splošno formulo II r₃-x II v kateri ima X zgoraj navedeni pomen in R₃ predstavlja oligoglukozidni ostanek s 3 do 8 glukoznimi enotami, presnovimo v prisotnosti p-toluolsulfonske kisline s spojino s splošno formulo »5

   R^-C-iO-nižjialkil)g₂

   III

   - v v kateri in neodvisno drug od drugega pomenita vsakokrat atom vodika ali alkilno skupino z 1 do 5 atomi ogljika ali fenilno skupino, v polarnem organskem topilu, pri temperaturi 10 do 70°C.
2. 2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da kot organ sko topilo uporabimo dimetilformamid.
3. 3. Postopek po enem izmed zahtevkov 1 do 3, označen s tem, da uporabimo spojino s splošno formulo III v prebitku.