JPH05507094A - α―アミラーゼ基質としてのインドフェノール置換マルトオリゴシド - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 α−アミラーゼ基質としての インドフェノール置換マルトオリゴシト本発明は、マルトシドまたはマルトトリ オシトの還元末端がα配置で置換インドフェノール残基に結合している、マルト シドとマルトオリゴシトに関する。さらに本発明は、α−アミラーゼの直接的測 定、特に膵臓のα−アミラーゼの測定に用いる合成酵素基質としてのこれらの化 合物の使用、並びにそのための適当な試薬に関する。

α−アミラーゼ（Ｌ　Ｃ，３，２，１，１）は、主に１．４−α−グルコシド結 合を加水分解することによって、１．４−α−グルコシド結合をしたオリゴ糖お よび多糖を、マルトースとマルトオリゴシトに分解する。工業的な醗酵技術での 使用に加えて、臨床分析や診断の分野において、当該酵素はかなりの重要性を有 する。特に膵臓のα−アミラーゼの測定は診断上かなりの重要性を有する。なぜ ならば、数多くの疾病において、体液中、例えば血清、尿、汁二指腸の分泌液中 の当該酵素量が著しく変化するからである。

α−アミラーゼの測定方法およびこれらに好適な合成酵素基質は数多く知られて いる。

ＥＰ−ＡＯ３４６９１２は、α−若しくはβ−配置で、ニトロ基又ニトロビニル 基によってバラ位が置換されているフェニル残基に還元末端が結合しているマル トオリゴシトを開示している。これらのマルトオリゴシトは、ヒドロラーゼ、リ パーゼ、エステラーゼ、α−グルコシダーゼ、又はグルコアミラーゼの活性の測 定に好適な基質であることが述べられている。

ＥＰ−ＡＯ３１９９３３は、非還元末端が保護基によってブロックされておらず 、かつ還元末端が、α−若しくはβ−配置で、置換若しくは非置換のフェニル残 基と結合しているマルトオリゴシドを開示している。置換されたフェニル残基の 例としては、ハロゲン−、ヒドロキシル−、アルキル−、アルコキシ−、アルコ キシカルボニル−、ニトロ−１及びフェノール−置換フェニル残基を挙げること ができる。このフェニル残基は一つの若しくは幾つかのニトロ基によって置換さ れているのが好ましい。上記の型のβ結合したマルトオリゴシトは、補助酵素、 例えばα−グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼの存在下でα−アミラーゼを測 定するのに適していると記述されている。α−アミラーゼの補助酵素の非存在下 での直接的測定については開示されていない。

日本明細書（６４−４２４９７）は、次の式。

〔式中、ＸＩからｘｌは水素原子若しくはハロゲン原子、又はニトロ、シアノ、 アジド、アシル、スルホン酸、ニトロソ、スルホニル、スルホキシル、チオシア ノ、インチオシアノ、イソニトリル、イミノ、アゾ、ジアゾ、アルキル、アリル 、アリール基を意味し、そしてＸ３とＸ′及び／又はＸｉとＸ６は結合すること が可能であり、かつ縮合芳香環を形成することができる。〕を有するインドフェ ノール残基でβ−配置で還元末端が置換されているマルトオリゴシトを開示して いる。

さらに、これらの化合物の製造方法、並びにα−及びβ−グルコシダーゼの存在 下におけるα〜アミラーゼ基質としてのそれらの使用が開示されている。かかる 化合物であるフェノールインドづ　−クロロフェニルーβ−マルトペンタオシド 、ヘキサデカアセチル−（フェノールインド−３，５−ジクロロフェニル）−β −マルトペンタオシド、フェノールインド−３，５゛−ジクロロフェニル−β− マルトヘプタオシド、ヘキサデカアセチル−（２，５−ジメチルフェノールイン ド−３′−クロロフェニル−β）−ペンタオシド、及びヘキサデカアセチル−（ １−ナフトールインド−３′−クロロフェニル）−β−ペンタオシドの製造側中 に具体的な開示がある。

ＥＰ−ＡＯ２６３４３５は、次の式： 〔式中、上記化合物の還元末端の置換基Ｒは、α−配置であり、から選ばれる置 換芳香族基である〕を有する芳香族基で置換されたグリコシド、その立体異性体 、光学異性体および幾何異性体並びにこれらの異性体の混合物を開示している。

これらの基質はα−アミラーゼに対する直接的な基質であるもの（換言すれば、 補助酵素の存在を必要としない）として開示されている。実施例は、特に２−ク ロロ−４−二トロフェニルーα−Ｄ−マルトトリオシト、４−クロロ−２−二ト ロー１−ナフチル−α−マルトトリオシト、および２−ホルミル−４−ニトロフ ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシトの製造を開示する。これに加えて、当該基質 および関連基質の製造方法についても開示する。ＥＰ−ＡＯ２６３４３５に開示 された化合物は、約３８５〜４５０ｎｍの波長で最大吸光度を有する。

日本明細書（０２／３０６９９０）は発色団としてのインドフェニル残基とオリ ゴグルコシドにおいて非置換のＯＨ−・基を有し、２〜１０個のグルコース単位 を有するインドフェニル−α−グルコシドを開示している。かかる開示例は、補 助酵素であるα−グルコシダーゼの存在下において測定が行われるフェノールイ ンド−３°−クロロフェニル−α−Ｄ−マルトペンタオシドについてのものであ る。

日本明細書（０２／３０６９９１）は、α−若しくはβ−結合と２〜１０個のグ ルコース単位を有するインドフェニル−グルコシドの環状アセタールを開示する 。かかるインドフェニル−グルコシドの環状アセタールは発色団としてのインド フェニル基を持ち、グルコースの０４位とＣ８位の非還元末端の０）［基がアル キル若しくはアルキリデン残基で置換されている。５〜７個のグルコース単位の 化合物が好ましいと言及されている。開示例は、補助酵素であるα−グルコシダ ーゼとβ−グルコシダーゼの存在下において測定が行われる、インプロピリデン −フェノールインドフェニル−α−マルトペンタオシドについてのものである。

日本明細書０３１０８５９９６は、発色団としてのインドフェニル残基と非置換 若しくはアシル基で置換されたＯＨ基を有し、かつグルコースのＣ３位とＣ５位 の非還元末端のＯＨ基が所望によりアルキリデン基で置換されている、３〜８個 のグルコース単位を有するインドフェニル−β−マルトオリゴシトを開示してい る。開示例は、補助酵素であるα−グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼの存在 下において測定が行われる、イソプロピリデン−フェノールインドフェニル−β −Ｄ−マルトペンタオシドについてのものである。

しかしながら、上述のすべての方法とα−アミラーゼ測定用の酵素基質は欠点を 有している。例えば、糖の還元末端の置換基がα−又はβ−配置で結合する上述 の５個以上のグルコース単位の化合物は、補助酵素の存在下でのα−アミラーゼ の測定に好適であるにすぎず、直接的基質とはならない。他の物質は、感度が低 くかつ最大吸光度が好ましくない波長にある故に基質としては好ましくない。例 えば、α−アミラーゼ試験が５００ｎｍ以下の波長で行われる場合、ヘモグロビ ンやビリルビンのような体液中に存在する物質に起因する妨害が起こり得ること が知られている。

かくして、本発明の目的は、長波長領域、つまり約５５０　ｎｍ以上において吸 収し、かつ補助酵素を必要とすることなくα−アミラーゼで直接切断され得るα −アミラーゼ基質を提供すること本発明によるこの目的は、一般式Ｉ： Ｇｌｕｃはグルコース分子であり、そしてインドフェニル基はα−配置で糖に結 合され、 ｎは１または２であり、 Ｒ１は水素、直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキルまたはアルコ イル基、炭素原子数３−６のシクロアルキルまたはシクロアルコイル基、ベンゾ イル、ベンジルまたはフェニル基であり、 Ｒ２は水素であり、 あるいは、Ｒ１とＲ２は一緒になってメチレン橋を形成し、その水素原子のそれ ぞれは独立して炭素原子数１−５のアルキル基またはフェニル基で置換されてい てもよく、 Ｒ３、Ｒ４、Ｒ’、　Ｒ’ハ互イニ独立シテ水素、ハロゲン（Ｆ　、　ＣＩ、Ｂ ｒ）、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スルボン酸、スルフィン酸または カルボン酸基もしくは対応する酸アルキルエステルおよび酸アミド基、アルコキ シ基、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキ ル基、所望により置換された炭素原子数３−６のシクロアルキル基または所望に より置換されたアリール基であり、あるいはＲ３とＲ′および／またはＲ５とＲ ６は互いに結合して縮合環を形成することができ、ＸおよびＹは互いに独立して 水素、ハロゲン（Ｆ　、　ＣＬ　Ｂｒ）　、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ 基、スルホン酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応する酸アルキル エステルおよび酸アミド基、アルコキシ基、所望により置換された直鎖状または 分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキル基、所望により置換された炭素原子数３ −６のシクロアルキル基または所望により置換されたアリール基である、 ただし、ＸとＹは同時に水素であることはない〕を有する化合物により達成され る。

上記定義においてアリール基はフェニルまたはナフチル基であることが好ましい 。アルコキシ基は１個または数個の酸素橋を含むことができ、従ってそれは例え ばポリエチレングリコール鎖であり得る。アルキル、シクロアルキルおよびアリ ール基は所望により置換され、すなわち、それらは酵素定量試験で一般に使用さ れる条件下においてα−アミラーゼと反応しない置換基（例えば、ハロゲン）を もっことができる。

一般式Ｉの化合物は、驚いたことに、それらがα−アミラーゼにより直接（つま り、補助酵素の不在下で）切断されて、同時に約５５０　ｎｍ以上の長波長域に おいて吸収するので、α−アミラーゼの合成酵素基質として非常に都合がよい。

本発明による物質の使用可能性は、インドフェノール残基のＸおよびＹの両位置 に水素原子が存在する同様の構造をもつ化合物がα−アミラーゼによって直接切 断されないことを考慮すると、より一層意外なことである。

化合物Ｉの非還元末端における置換基Ｒ１とＲ２は、好ましくは水素原子である 。しかしながら、化合物Ｉをこれらの位置で置換基によりブロックすることも可 能である。このような置換基の導入はＤＥ−３９２９３５５に詳細に記載されて いる。従って、残基Ｒ１およびＲ２は、対応する未置換化合物Ｉから出発して、 これらをエーテル化条件下でジアルコキシ化合物（好ましくは、ジアルコキシエ タンまたは対応するベンジル誘導体）と反応させて、Ｒ１とＲ２が一緒になって 所望により置換されたメチレン基を形成する一般式Ｉの化合物を形成させること により、導入することができる。

所望の置換基はまた、例えば対応するオルトエステル、酸塩化物、酸無水物とい った活性化カルボン酸から、または酵素的に活性化エステルから（Ｊ、Ａ、Ｃ， Ｓ　１１０　（１９８８）、　５８４−５８９）、またはアセタールから、ある いは例えばＭｆ　ｔｓｕｎｏｂｕ反応（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　Ｖｏｌ、　３０　（１９８９）、　３２５−３２６）により脱水剤を使って 直接カルボン酸から、未保護基質に導入することができる。特に、中間生成物と して対応オルトエステルを経て進行する酵素的製法、およびＭｉ　ｔｓｕｎｏｂ ｕ反応による製法が好適である。オルトエステルは対応するニトリルから製造す ることが好ましい（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ　Ｗｅｙｌ、　Ｖｏｌ　Ｖｌ／３　（ １９６５）、　３００−３１３）。これらの保護基質の精製は、例えばイオン交 換やＨＰＬＣのようなりロマトグラフィーを用いて実施することができる。

一般式Ｉにおいて、ｎは１または２であり、かくして本発明化合物はマルトシド またはマルトトリオシトである。これよりも高級のマルトオリゴシトはもはや直 接的基質としてα−アミラーゼに受け入れられない。本発明による化合物は好ま しくはマルトトリオシトである。

■のインドフェノール残基のフェニル環上の基ＸおよびＹは、互いに独立して、 Ｈ、Ｆ　、　ＣＩまたはＢｒ、アセトアミド、ニトロ、またはシアノ基、スルホ ン酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応する酸アルキルエステルお よび酸アミド基、アルコキシ基（１個または数個の酸素橋をもつ、例えばポリエ チレングリコール鎖）、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状の炭素原子 数１−６のアルキル基、所望により置換された炭素原子数３−６のシクロアルキ ル基または所望により置換されたアリール基である。ただし、ＸとＹが同時に水 素であることはない。基ＸおよびＹの一方または両方が水素で、他方の基が水素 と異なる置換基を表す式Ｉの化合物が一般に好適である。また、ＸとＹの少なく とも１つはハロゲンであることが好ましく、特にＸがハロゲンで、Ｙが水素であ ることが好適である。ハロゲンは塩素を表す場合が最も好適である。

一般式■中の基Ｒ３、Ｒ′、Ｒ５およびＲ８はインドフェノール残基のベンゾキ ノン環上に存在しつる置換基を表す。この場合に、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６ は互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ　ＳＣＬ　Ｂｒ）、ニトロ、アセトアミド またはシアノ基、スルホン酸基、スルフィン酸基またはカルボン酸基もしくは対 応する酸アルキルエステルおよび酸アミド基、アルコキシ基、所望により置換さ れた直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキル基、所望により置換さ れた炭素原子数３−６のシクロアルキル基または所望により置換されたアリール 基であり、Ｒ３とＲ４および／またはＲＳとＲ６は一緒に結合して縮合環を形成 することができ、アルコキシ基は１個または数個の酸素橋をもつことができる。

基Ｒ３とＲ″および／または基Ｒ５とＲ６が一緒に結合する場合は、縮合環が形 成される。このような置換パターンを有する生成化合物■も直接的α−アミラー ゼ基質として適している。

好ましくは、Ｒ３とＲ５は水素を表し、Ｒ′とＲ６はハロゲン、特に塩素を表す 。一般式Ｉの化合物のうち、２’、２．６−　トリクロロ−インドフェニル−α −マルトトリオシトが最適であり、この化合物はその長波長吸光度の結果として ６４５ｎｍの測定波長で測定可能であり、かつ補助酵素の不在下でα−アミラー ゼにより顕著に切断され得る。

本発明化合物は既知の方法で製造され、ここでは好適な方法として３つの異なる 方法を説明する。第１の好適な方法はマルトースまたはマルトトリオースから出 発する。これらの化合物を酢酸ナトリウム触媒の存在下に既知方法で（例えば、 無水酢酸との反応により）過アセチル化し、これにより一般式！■：〔式中、Ａ ｃ−Ｇｌｕｃは過アセチル化グルコースを表し、化合物ＩＩの還元末端における アセチル基は糖にβ−配置で結合される〕を宵する化合物を製造する。

その後、化合物Ｉ＋を、酸触媒の存在下で、一般式ＩＩＩ：〔式中、ＸおよびＹ は上記の意味を有する〕を有する置換ｐ−ニトロフェノールと反応させる。この 反応に適する酸触媒は例えばアルキルスルホン酸またはアリールスルホン酸（例 えば、ｐ−トルエンスルホン酸）あるいは好ましくはルイス酸触媒（例えば、Ｂ Ｆ、。

０Ｅｔｃ）である。この反応はｐ−ニトロフェノールＩＩＩによる糖の還元末端 のアセチル基の立体特異的置換反応であり、ｐ−ニトロフェニル基が生成化合物 ＩＶの糖に対してα−配置で結合されるようなその後、化合物ＩＶのニトロ基を 既知の方法で（例えば、Ｐｄ−Ｃの存在下での接触水素化により）アミノ基に還 元する。次に、アセチル基を、例えばアンモニアの存在下でのアルカリけん化に より、生成化合物から切断する。

脱アセチル化生成物は最後に、一般式Ｖ：〔式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６ は上記の意味を有する〕を有する所望により置換されたｐ−ベンゾキノンと反応 させる。この方法では、一般式■Ｉ： 〔式中、インドフェノール残基はα−配置で糖に結合される〕を有する化合物が 得られる。この反応はトリフルオロ酢酸の存在下にジメチルホルムアミドまたは ジオキサンもしくはこれらの混合物のような無水非プロトン性溶媒中で行うこと が好ましい。

糖の非還元末端におけるグルコース残基の４および６位の水素原子は、所望によ り、すでに上で詳述したように別の工程で基Ｒ’およびＲ２により置換すること ができる。

別法として、一般式Ｉの化合物は、過アセチル化β−マルトースまたはβ−マル トトリオースを、一般式ｖｌｌ：〔式中、Ｘ　、　Ｙ　、　Ｒ”、Ｒ４、Ｒ’オ ヨヒＲ’ｉ；！上ｉＥノ意味ヲ有ｔル）　ヲ有するインドフェノールと反応させ ることにより製造される。生成物のその後の処理（すなわち脱アセチル化と、場 合により、非還元末端での誘導体化）は第１の方法と同様に行う。

本発明化合物の第３の製法では、最初に上記方法の１つにより一般式Ｖｌｌｌ： 〔式中、各記号は上記の意味を有する〕を有するインドフェノール−α−グルコ シド誘導体を合成し、この化合物をその後シクロデキストリン−グルコシルトラ ンスフェラーゼおよびシクロデキストリン、アミロースまたはデンプンの共存下 で“トリミング（ｔｒｉｍｍｉｎｇ）　”することにより本発明のマルトシドま たはマルトトリオシト誘導体に変換する。

糖の還元末端での置換基の配置において本発明化合物と異なるβ−マルトオリゴ シト誘導体の製法は、対応するインドフェニル−β−グルコシド誘導体に関する 日本の明細書６４−４２４９７に詳細に記載されている。本発明にょるα−マル トオリゴシト誘導体の製法は、原理的に、それが過アセチル化β−マルトオリゴ シト誘導体から出発する点で相違するにすぎず、β−化合物の製造は過アセチル 化α−マルトオリゴシト誘導体から出発する。

置換基の種類が本発明の物質と異なるα−マルトオリゴシト誘導体の製法はＢＰ −Ａ　０２６３４３５に記載されている。

本発明はまた、請求項１に記載した一般式Ｉの化合物をα−アミラーゼの基質と して使用することからなる、合成酵素基質を用いて水溶液（特に体液）中のα− アミラーゼの活性を定量する方法に関する。この方法では、Ｒ１およびＲ２が水 素を表すが、または−緒になってメチレン橋（その水素原子は互いに独立して炭 素原子数１−５のアルキル基またはフェニル基で置換され得る）を形成する化合 物Ｔを使用することが好ましい。さらに、インドフェニル基のフェニル環上の置 換基ＸおよびＹの一方は水素で、他方の置換基は水素でないことが好適である。

その上、基ＸおよびＹの少なくとも１つはハロゲンを表すことが好ましい。酵素 基質として２’、２．６−　トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオシ トを使用することが特に好ましい。

本発明による方法はα−アミラーゼ活性の直接定量、すなわちα−グルコシダー ゼやβ−グルコシダーゼのような補助酵素の不在下での活性の定量を可能にする 。

さらに、本発明方法を使用することにより、唾液α−アミラーゼのための特異的 阻害剤系を用いて唾液α−アミラーゼの存在下に膵臓α〜アミラーゼの活性を特 異的に定量することが可能である。１種または数種のモノクロ−カル抗体を含む 阻害剤系は、例えばＤＥ　３９２９３５５に開示されている。適当な抗体は例え ばＥＰ−Ａ　０１９１２８４　、ＢＰ−Ａ　Ｏ１５０３０９およびＥＰ−Ａ　０ ２０９１５４に記載されている。膵臓α−アミラーゼは、本発明による酵素基質 と阻害剤物質を併用することにより非常に選択的にかつ正確に定量され得る。

本発明はさらに、酵素基質として一般式Ｉを有する化合物を含む、合成酵素基質 によるα−アミラーゼの直接的、特異的定量のための試薬に関する。本発明によ る試薬は、Ｒ１およびＲ２が水素を表すか、または−緒になってメチレン橋（そ の水素原子は互いに独立して炭素原子数１−５のアルキル基またはフェニル基で 置換され得る）を形成する化合物Ｉを含むことが好ましい。さらに、一般式Ｉを 有する基質中の置換基ＸおよびＹの一方は水素で、他方の置換基は水素と異なる ことが好適である。その上、基ＸおよびＹの少なくとも１つはハロゲンを表すこ とが好ましい。基質として２’、２．６−　トリクロロ−インドフェニル−α− マルトトリオシトを含む本発明試薬が特に好ましい。酵素試験溶液中の本発明物 質の最終濃度は、好ましくは１−１０　ｍｍｏＪ／Ｉ　、特に３−７　ｍｍｏｌ ／ｌである。本発明試薬はざらにα−アミラーゼのための活性化剤、例えばアジ 化物またはチオシアン酸塩を含むことができる。活性化剤は好ましくは５０−７ ００　ｍｍｏｌ／１　、特にｔｏｏ−５００ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度で使用され る。さらに、本発明試薬は１種または数種のモノクローナル抗体を含む唾液α− アミラーゼのための特異的阻害剤系を含むこともできる。この場合には、膵臓α −アミラーゼの選択的定量を行うことが可能である。

さらに、本発明は、特にα−アミラーゼの酵素活性の直接的定量に用いる、合成 酵素基質としての一般式■を有する化合物の使用に関する。

図面を参照しながら、以下の実施例で本発明をさらに詳しく説明することにする 。

図面において、図１は実施例２で試験したα−アミラーゼ基質の化学構造式を示 す。

実施例１ ２’、２．６−　）ジクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオシトの合成 無水トルエン４５０　ｍｌと無水ジクロロエタン１００　ｍｌの混合物中で、湿 気を遮断して、Ｏ，Ｉｍｏｌの過アセチル化β−マルトトリオシト、０．３ｍｏ ｌの２−クロロ−４−二トロフェノールおよび２５　ｍｌ（ＤＢＦｓ、０Ｂｔｔ を４５℃で３２時間攪拌する。その後ジクロロメタン５００ｍ１を加え、飽和Ｎ ａ２ＣＯｓ溶液８００　ｍｌと共に振とぅする。Ｍｇ５Ｏ＋で乾燥後、有機相を 濃縮する。残留物をシリカゲル（移動溶媒：酢酸エチル／ヘキサン２：ｌ）でク ロマトグラフィーにかける。

収量：　２７　ｇ　（２５％） ＴＬＣ：　Ｒ１＝　０．５９．　（シリカゲル；　トルエン／アセトン７／４） Ｉａ）からの生成物６．５　ｇ　（６ｍｍｏｌ）をジオキサンエ６０　＋ｎｌ、 メタ／　−ｋ　６０　ｍｌ、氷酢酸２　ｍｌ　Ｏ）１！１合物に溶がし、０．６ ５　ｇノ１０％　Ｐｄ−Ｃを加える。０．９バールで７時間水素化する。濾過に より触媒を除き、溶媒を除いた後、残留物をシリカゲル（移動溶媒：トルエン／ アセトン７：３）でクロマトグラフィーにかける。

収量＋　１．６　ｇ　（２５℃％） ＴＬＣ：　Ｒ，＝　０．４２　（シリカゲル；　トルエン／アセトン７／４）ｃ ）２−クロロ−４−アミノフェニル−α−マルトトリオシトｌｂ）からの生成物 １　ｇ　（１ｍｍｏｌ／ｌ）をメタノール５０ｍ１、水５ｍｌおよび２５％アン モニア１０　ｌｌ１１に加え、室温で２０時間攪拌する。

溶媒を除き、生成物をこれ以上精製せずに以後の工程で反応させる。

収量：　６８０　ｍｇ ＴＬＣ：　Ｒ，＝　０．４７　（シリカゲル；ブタノール／氷酢酸／水１０／３ １５）ｌｃ）からの生成物６８０　ｍｇを無水ジメチルホルムアミド１０ｍ１に 溶かし、無水ジオキサン３０ｍ１　トリフルオロ酢酸０．２　ｍｌ　。

２．６−シクロロペンゾキノン１　ｇ　（５，８ｍｍｏｌ）およびスパチュラ３ 杯のモレキュラーシーブを加える。この混合物を湿気を遮断して室温で２時間攪 拌する。その後、これを濾過し、濃縮し、残留物を水にとり、再度濾過する。濾 液をゲルクロマトグラフィー（ＬＨ２０、移動溶媒：水）で予備処理する。最後 に、分離用ＨＰＬＣ（ＲＰ　１８．勾配：水／イソプロパツール；０．１％トリ フルオロ酢酸：　８０／２０％→６５／３５％）で精製する。

収量：　６０　ｍｇ　（８％） ＴＬＣ：　Ｒ，＝　０．６２　（シリカゲル；ブタノール／氷酢酸／水１０／３ １５）実施例２ α−アミラーゼの直接定量のための基質としての２’、２．６−　トリクロロ− インドフェニル−α−マルトトリオシトの使用ヒト膵臓α−アミラーゼ（ＨＰＡ ）とヒト唾液α−アミラーゼ（ＨＳ　Ａ）のアミラーゼ活性を次の表および図１ に示した基質を用いて試験した。次の試薬類を使用した：試薬１： ＮａＣｌ　５７．１　ｍｍｏｌ／１ 酢酸カルシウム　５．６　ｍｍｏｌ／１を含む ４−モルホリノ−エタンスルホネート （＝ＭＥＳ）緩衝液　６Ｌ、６　ｍｍｏｌ／１　ｐＨ６，０試薬２： 基質（表に記載した）　’　４９．３　ｍｍｏｌ／１試薬１はさらに、所望によ り、表に記載した活性化剤と、唾液α−アミラーゼの阻害剤としての細胞系ＮＣ ＡＣＣ８４１２２００３（ＭＡＢ　Ｉ）およびＮＣＡＣＣ８４１１１３０１，（ ＭＡＢ　１１）により産生された抗体を含む。

定量を行うために、１．００ｍ１の試薬ｌを０．０２ｍ１の試料と混合し、３７ ℃でブレインキュベートする。続いて、０．１０ｍ１の試薬２を加え、混合し、 モして１．２および３分後にそれぞれの測定波長（表を参照）で吸光度を読み取 る。吸光度差７分の平均を算出する。

計算： △Ａ／ｍｉｎ　Ｘ　１．１２　ｘ　１０００Ｕ／Ｌ試料＝　εｘ０，０２ 試験混合物中の最終濃度は次の通りである：ＭＥＳ緩衝液、　ｐＨ６，０５５ｍ ｍｏｌ／ｌＮａＣ１５１ｍｍｏｌ／１ 酢酸カルシウム　５　ｍｍｏｌ／１ 基１ｊ　４．４４ｍｍｏ　１／　１ 任意の活性化剤 ７　シ化ｔ　ト’）　ｆｙ　ム１５２　ｍｍｏｌ／１またはチオシアン酸カリウ ム　４００　ｍｍｏｌ／ＩＭＡＢ　ｌ　約５−８　ｍｇ／Ｉ ＭＡＲ１１約２−３　ｍｇ／ｌ 試料としてヒト膵臓アミラーゼ（ＨＰ　Ａ）を使用する。泪１］定ｃヨそれぞれ の場合に示した測定波長において３７℃で行う。結果を表に示す。

青 基ｉ　測定波長　４００　ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＳＣＮ２’、２．６−　）ジクロロ 　−　インドフェニル　−α−マルトトリオシト　６４５　０．０６３２．６− シメチルーインドフエニル　−α−マルトトリオシト　５７８　０本 ２．６−ジクロロ−インドフェニル　−得られた結果から、フェニル環の２′位 に水素以外の置換基、特にハロゲン、をもつインドフェニル誘導体のみが直接的 アミラーゼ基質を構成することが分かる。２位に置換基が存在しな０場合は、ア ミラーゼ切断が起こらない。

実施例１ａ）からのデカ−アセチル−（２−クロロ−４−二トロフェニル）−α −マルトトリオシト１４．２５　ｇをメタノール４５０　ｍｌ　ｉこ溶かす。水 ４５　ｍｌと濃アンモニア水溶液９０　ｍｌをこれに加え、室温で１６時間攪拌 する。これを濃縮し、得られた２−Ｃ１−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルト トリオシトをＤＭＦ　１５　ｍｌに溶かす。１．２５　ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）の ２．２−ジメトキシブロノくン（Ｍｅｒｃｋ　８０２９３６）と１７２　Ｂ（１ ｍｍｏｌ）の無水ｐ−トルエン−スルホン酸を順次加える。攪拌しながら４８℃ で８０分間反応させる。その後混合物を１５　ｍｌ　（０，２４ｍ。

１／ｌ）のＮａＨＣＯｓ溶液に滴下する。この混合物を４０　ｍｌずつの酢酸エ チルと共に２回振とうする。水相を濃縮し、続いてセファデックスＬＨ２０カラ ム（Ｐｂａｒｍａｃｉａ）でクロマトグラフィーにかける。

溶離剤コ水。適当な画分を凍結乾燥する。

収量＋　１５０１１１ｇ ＴＬＣ：　Ｒ＋　＝　０．５１　（シリカゲルＴＬＣ，Ｍｅｒｃｋ　５７３５． 移動溶媒＝１−ブタノール／氷酢酸／水＝　ｔｏ／３１５）実施例３ａ）からの イソプロピリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ ト１５０　ｍｇをメタノール１０　ｍｌとテトラヒドロフラン２５　ｍｌに溶か し、３０　ｍｇのＰｄ／活性炭（１０％　Ｐ　ｄ、　Ｍｅｒｃｋ　８０７１０４ ）を加える。

激しく攪拌しながら過度の圧力をかけずに２時間水素化する。

全混合物を濾過して触媒を除き、蒸発させ、３０分後に高真空ポンプで乾燥する 。

収量：　１４０　ｍｇ ＴＬＣ：　Ｒ，＝　０．４４　（シリカゲル、　Ｍｅｒｃｋ　５７３５．移動溶 媒：１−ブタノール、／氷酢酸／水＝　１０／３１５）実施例３ｂ）からのイソ プロピリデン−２−クロロ−４−アミノフェニル−ａ−Ｄ−マルトトリオシト１ ４０　ｍｇ　（０，２ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌの蒸留した無水ジメチルホルムア ミドに溶かす。これに３ｍｌの無水ジオキサンと３滴のＢＦ、−エチルエーテル を加える。これを１０℃に冷却し、０．２２　ｇ　（１，２ｍｍｏｌ）の２．６ −シクロロペンゾキノンを加える。１０℃で１５分間攪拌し、その後室温まで温 めてさらに６０分間攪拌する。

この反応混合物に４０　ｍｌのジエチルエーテルを加えると、生成物が析出する 。これを濾過し、残留物をジエチルエーテルで洗う。

セファデックスＬ　Ｈ２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、水で溶離して生成物 を得る。

ＴＬＣ：　Ｒ，＝　０１６０　（シリカゲル、　Ｍｅｒｃｋ　５７３５．移動溶 媒＝１−ブタノール／氷酢酸／水＝　１０／３１５） 実施例４ ２°−クロロ−２−メチル−インドフェニル−α−マルトトリオシトの合成 ｌｃ）からの生成物３．５ｇを１５　ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに溶かし 、６０　ｍｌの無水ジオキサン、１．３ｍｌのＩＩＦ、−エチルエーテル、２． ４５　ｇ　（２０ｍｍｏｌ）の２−メチル−４−ベンゾキノンおよびスパチュラ １杯のモレキュラーシーブを加える。この混合物を湿気を遮断して一夜（１６時 間）室温で攪拌する。続いて２００　ｍｌの酢酸エチルを加え、これから形成さ れた沈殿物を６４フリツトを通して吸引する。残留物を水に溶かし、セファデッ クスＬＨ２０カラムにかけて精製する。

収量：　２３０　ｍｇ ＴＬＣ：　Ｒ，＝　０．４４　（シリカゲル；ｌ−ブタノール／氷酢酸／水＝１ ０／実施ＰＩ３ ２゛〜クロロ−２，６−ジメチル−インドフェニル−α−マルトトリオシトの合 成 Ｌｃ）からの生成物５００　ｍｇを無水ジメチルホルムアミド５ｍｌ、無水ジオ キサン１０　ｍｌ、　ＢＦ３−エチルエーテル０．２ｍｌに溶がし、０．５５　 ｇ　（３ｍｍｏｌ）の２．６−シメチルー４−ベンゾキノンとスパチュラ２杯の モレキュラーシーブを加える。この混合物を湿気を遮断して一夜室温で攪拌する 。続いて２０　ｍｌの酢酸エチルと２０　ｎ＋１のジエチルエーテルを加え、形 成された沈殿物を６４フリツトを通して吸引する。この橙赤色の残留物を水に溶 がし、セファデックスＬＨ２０カラムにかけて精製する。

収量：　３５　ｍｇ ＴＬＣ：　Ｌ　＝　０．４４　（シリカゲル；１〜ブタノール／氷酢酸／水：１ ｏ／実施例６ α−アミラーゼの直接定量のための基質としての実施例４および５により製造し た物質の使用 手順は実施例２と同様である。結果を表２に示す。

表２ 基質　測定波長　４００　ｍｍｏｌ／Ｉ　ＫＳＣＮ［ｎｍ］　ＨＰＡ 相対値 ！−〇〇」司、−１−一− ２′、２．６−）リクロロ　〜　インドフェニル　−α−マルトトリオシト　６ ４５　１ （実施例１） ２′−りａσ　−２−メチルインド− フェニル−α−マルトトリオシト　５９５　０．３５本（実施例４） ２′−クロロ　−２，６−ジメチル− インドフェニル−α−マルトトリオシト　５７３　０．２７本（実施例５） ＋）−一−−−〜−−−顛＾−ヤ。

孝ｐ）１８．０で測定 要約 一 本発明は、新規なインドフェニル−置換マルトース誘導体、αα−アミラーゼ定 量用試薬に関する。

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、 Ｇｌｕｃはグルコース分子であり、そしてインドフェニル基はα−配置で糖に結 合され、 ｎは１または２であり、 Ｒ１は水素、直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキルまたはアルコ イル基、炭素原子数３−６のシクロアルキルまたはシクロアルコイル基、ベンゾ イル、ベンジルまたはフェニル基であり、 Ｒ２は水素であり、 あるいは、Ｒ１とＲ２は一緒になってメチレン橋を形成し、その水素原子のそれ ぞれは独立して炭素原子数１−５のアルキル基またはフェニル基で置換されてい てもよく、 Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、 ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スルホン酸基、スルフィン酸基またはカ ルボン酸基もしくは対応する酸アルキルエステル基および酸アミド基、アルコキ シ基、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキ ル基、所望により置換された炭素原子数３−６のシクロアルキル基または所望に より置換されたアリール基であり、あるいはＲ３とＲ４および／またはＲ５とＲ ６は互いに結合して縮合環を形成することができ、ＸおよびＹは互いに独立して 水素、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、ニトロ、アセトアミほたはシアノ基、スル ホン酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応する酸アルキルエステル および酸アミド基、アルコキシ基、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状 の炭素原子数１−６のアルキル基、所望により置換された炭素原子数３−６のシ クロアルキル基または所望により置換されたアリール基である、 ただし、ＸとＹは同時に水素であることはない〕で表される化合物。
2. ２．Ｒ１およびＲ２が水素を表す、請求項１記載の化合物。
3. ３．ｎが２である、請求項１または２記載の化合物。
4. ４．２つの基ＸおよびＹのうち一方が水素で、他方が水素と異なる、請求項１− ３のいずれか１つに記載の化合物。
5. ５．基ＸおよびＹの少なくとも１つがハロゲンを表す、請求項１−４のいずれか １つに記載の化合物。
6. ６．ハロゲンが塩素である、請求項５記載の化合物。
7. ７．Ｒ３とＲ５が水素で、Ｒ４とＲ６がハロゲンを表す、請求項１−６のいずれ か１つに記載の化合物。
8. ８．Ｒ４とＲ６が塩素を表す、請求項７記載の化合物。
9. ９．２′，２，６−トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオシド。
10. １０．請求項Ｉ記載の一般式Ｉを有する化合物の製造方法であって、（ａ）マル トースまたはマルトトリオースを既知の方法で過アセチル化し、これにより一般 式ＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、Ａｃ−Ｇｌｕｃは過アセチ ル化グルコースを表し、化合物１１の還元末端におけるアセチル基は糖にβ−配 置で結合される〕を有する化合物を形成し、 （ｂ）化合物ＩＩを、酸触媒の存在下で、一般式ＩＩＩ：▲数式、化学式、表等 があります▼（ＩＩＩ）〔式中、ＸおよびＹは請求項１記載の意味を有する〕の 置換ｐ−ニトロフェノールと反応させ、これにより一般式ＩＶ：▲数式、化学式 、表等があります▼（ＩＶ）〔式中、ｐ−ニトロフェニル基は糖にα−配置で結 合される〕を有する化合物を形成し、 （ｃ）化合物ＩＶのニトロ基を既知の方法でアミノ基に還元し、（ｄ）工程（ｃ ）から得られた化合物のアセチル基を除去し、（ｅ）工程（ｄ）から得られた化 合物を、一般式Ｖ：▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）〔式中、Ｒ３、Ｒ ４、Ｒ５およびＲ５は請求項１記載の意味を有する〕を有する所望により置換さ れたｐ−ベンゾキノンと反応させ、これにより一般式ＶＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩ）〔式中、インドフェニル基は糖にα −配置で結合される〕を有する化合物を形成し、所望により （ｆ）基Ｒ１およびＲ２によるマルトースまたはマルトトリオース残基の非還元 末端における４および６位の置換を既知の方法で導入し、これにより一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、全ての記号は請求項１記載の 意味を有する〕を有する化合物を形成する ことからなる方法。
11. １１．請求項１記載の一般式Ｉを有する化合物をα−アミラーゼの基質として使 用することからなる、合成酵素基質による水溶液（特に体液）中のα−アミラー ゼ活性の定量方法。
12. １２．Ｒ１およびＲ２が水素を表す化合物Ｉを使用する、請求項１１記載の方法 。
13. １３．２つの基ＸおよびＹのうち一方が水素で、他方が水素と異なる化合物Ｉを 使用する、請求項１１または１２記載の方法。
14. １４．２′，２，６−トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオシドを酵 素基質として使用する、請求項１３記載の方法。
15. １５．α−アミラーゼ活性の定量を補助酵素の存在下で行う、請求項１１−１４ のいずれか１つに記載の方法。
16. １６．唾液α−アミラーゼのための特異的阻害剤系を使って唾液α−アミラーゼ の存在下に膵臓α−アミラーゼの活性を特異的に定量する、請求項１１−１５の いずれか１つに記載の方法。
17. １７．阻害剤系として１種または数種のモノクローナル抗体を使用する、請求項 １６記載の方法。
18. １８．合成酵素基質として請求項１記載の一般式Ｉを有する化合物を含む、合成 酵素基質によるα−アミラーゼの特異的直接定量のための試薬。
19. １９．Ｒ１およびＲ２が水素を表す化合物Ｉを基質として含む、請求項１８記載 の試薬。
20. ２０．２つの基ＸおよびＹのうち一方が水素で、他方が水素と異なる化合物Ｉを 基質として含む、請求項１８または１９記載の試薬。
21. ２１．２′，２，６−トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオシドを基 質として含む、請求項２０記載の試薬。
22. ２２．活性化剤をさらに含む、請求項１８−２１のいずれか１つに記載の試薬。
23. ２３．活性化剤がアジド塩またはチオシアン酸塩である、請求項２２記載の試薬 。
24. ２４．唾液α−アミラーゼのための特異的阻害剤系を含む、請求項１８−２３の いずれか１つに記載の試薬。
25. ２５．阻害剤系が１種または数種のモノクローナル抗体からなる、請求項２４記 載の試薬。
26. ２６．合成酵素基質としての請求項１−９のいずれか１つに記載の化合物の使用 。
27. ２７．α−アミラーゼの酵素活性の直接定量のための、請求項２６記載の使用。