JPH0223891A - α―アミラーゼの測定法及びそのための試薬 - Google Patents
α―アミラーゼの測定法及びそのための試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、後記の一般式Ｉの化合物をａ−アミラーゼを
測定するための基質として使用することに関する。
測定するための基質として使用することに関する。
従来の技術
血清中のα−アミラーゼの測定は、すいぞうの機能の重
要な臨床上のパラメータである。σアミラーゼを測定す
るために市場で得られる試薬は、以前には主として基質
としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。しかしな
がらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であること
が判明した。それ故この欠点を除去するために、澱粉及
び澱粉誘導体をオリゴサツカリド及びその光学的に測定
される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラオース、
−ペンタオース、−ヘキサオース及び−ヘプタオース及
びこれらの誘導体によって重要な改良が得られた（ドイ
ツ公開特許第２７４１１９２号明細書、ドイツ公開特許
第２７５５８０３号明細書、米国特許第３８７９２６３
号明細書、米国特許第４００００４２号明細書）。
要な臨床上のパラメータである。σアミラーゼを測定す
るために市場で得られる試薬は、以前には主として基質
としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。しかしな
がらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であること
が判明した。それ故この欠点を除去するために、澱粉及
び澱粉誘導体をオリゴサツカリド及びその光学的に測定
される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラオース、
−ペンタオース、−ヘキサオース及び−ヘプタオース及
びこれらの誘導体によって重要な改良が得られた（ドイ
ツ公開特許第２７４１１９２号明細書、ドイツ公開特許
第２７５５８０３号明細書、米国特許第３８７９２６３
号明細書、米国特許第４００００４２号明細書）。
前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラーゼ測定
の特に重要な実施形式は、ａ−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある（ドイツ公開特許第２７４１１９２号明細書参照）
。
の特に重要な実施形式は、ａ−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある（ドイツ公開特許第２７４１１９２号明細書参照）
。
しかしながら、助酵素のａ−グルコシダーゼは、でき上
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはα−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはα−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。
発明が解決しようとする問題点
それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去し、α−グ
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することがでさ、α
−アミラーゼの検出の正確性を改良するσ−アミラーゼ
の測定法及びそのための試薬である。
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することがでさ、α
−アミラーゼの検出の正確性を改良するσ−アミラーゼ
の測定法及びそのための試薬である。
問題点を解決するための手段
この課題は、本発明によれば、一般式Ｉ：［式中Ｒ及び
Ｒ，は、相互に独立にそれぞれ炭素原子１〜６１１１を
有する直鎖状又は分校状のアルキル基又はアルコール基
又はフェニル基を表わし、その際Ｒ及びＲ１は一緒にな
ってメチレン橋を形成してもよく、その水素原子は相互
に独立にそれぞれ炭素原子１〜５個を有するアルキル基
又はフェニル基によって置換されていてもよく、Ｒ２は
グルコース単位２〜７個を有するオリゴグルコシド基を
表わし、Ｘは水素原子又は光学的に測定される基を表わ
す］の化合物の使用によって解決される。
Ｒ，は、相互に独立にそれぞれ炭素原子１〜６１１１を
有する直鎖状又は分校状のアルキル基又はアルコール基
又はフェニル基を表わし、その際Ｒ及びＲ１は一緒にな
ってメチレン橋を形成してもよく、その水素原子は相互
に独立にそれぞれ炭素原子１〜５個を有するアルキル基
又はフェニル基によって置換されていてもよく、Ｒ２は
グルコース単位２〜７個を有するオリゴグルコシド基を
表わし、Ｘは水素原子又は光学的に測定される基を表わ
す］の化合物の使用によって解決される。
本発明による化合物ですぐ使える試薬は、αグルコシダ
ーゼの存在でも変化をこうむらずそれ故長時間後にも正
確なα−アミラーゼの値が得られる。
ーゼの存在でも変化をこうむらずそれ故長時間後にも正
確なα−アミラーゼの値が得られる。
アルキル基としては、メチル−二チル−プロピル−イソ
プロピル−ブチル−インブチル−ｔ−ブチル−ｎ−ペン
チル基、これらの異性体、ｎ−ヘキシル基、この異性体
並びにンクロヘキシル基が挙げられる。同じようにして
、前記アルキル基に相応するアルコール基は、末端グル
コシド基の４位及び／又は６位の酸素原子の置換分とし
て該当する。本発明の範囲内ではＲとＲ，とが−緒にな
って場合によリ置換されているメチレン橋を形成する化
合物が好ましく、特にアルキル基又はフェニル基、殊に
エチリデン基又はベンジリデン基によって置換されてい
る化合物好ましい。
プロピル−ブチル−インブチル−ｔ−ブチル−ｎ−ペン
チル基、これらの異性体、ｎ−ヘキシル基、この異性体
並びにンクロヘキシル基が挙げられる。同じようにして
、前記アルキル基に相応するアルコール基は、末端グル
コシド基の４位及び／又は６位の酸素原子の置換分とし
て該当する。本発明の範囲内ではＲとＲ，とが−緒にな
って場合によリ置換されているメチレン橋を形成する化
合物が好ましく、特にアルキル基又はフェニル基、殊に
エチリデン基又はベンジリデン基によって置換されてい
る化合物好ましい。
オリゴグルコシド基Ｒ２では、グルコース単位３．４及
び６個を有するものが好ましい。
び６個を有するものが好ましい。
Ｘが光学的に測定される基の場合には、可視光線又は紫
外線の帯域でも色を有する基であるか又は他の化合物と
の反応により、例えば色素に変換するか又は色素と結合
して光学的に測定される基である。かかる光学的に測定
される基は当業者には明らかであり、詳説は不必要であ
る。好ましくはニトロ基を有するフェニル基、例えばニ
トロフェニル基又は３．４−ジニトロフェニル基である
。
外線の帯域でも色を有する基であるか又は他の化合物と
の反応により、例えば色素に変換するか又は色素と結合
して光学的に測定される基である。かかる光学的に測定
される基は当業者には明らかであり、詳説は不必要であ
る。好ましくはニトロ基を有するフェニル基、例えばニ
トロフェニル基又は３．４−ジニトロフェニル基である
。
本発明により使用される化合物の製造は、末端に場合に
より光学的に測定される基Ｘを有するグルコース単位３
〜８個を有するオリゴグルフシドから出発して、これを
エステル化又はエーテル化の条件下にオルトオキシ化合
物、好ましくはジアルコキシエタン又は相応するベンジ
ル誘導体と反応させ、Ｒ及びＲ１が一緒になって場合に
より置換されているメチレン基を形成する一般式Ｉの化
合物を形成し、続いて場合により例えばベルアセチル化
によって遊離ＯＨ基を封鎖し、４位又は６位の酸素原子
のメチレン橋を分解し必要の場合にはこのようにして形
成した４位又は６位の遊離ＯＨ基をなおエーテル化又は
エステル化又はエーテル置換又はエステル置換し、最後
に他のＯＨ−封鎖基、例えばアセチル基を脱離すること
によって行うことができる。
より光学的に測定される基Ｘを有するグルコース単位３
〜８個を有するオリゴグルフシドから出発して、これを
エステル化又はエーテル化の条件下にオルトオキシ化合
物、好ましくはジアルコキシエタン又は相応するベンジ
ル誘導体と反応させ、Ｒ及びＲ１が一緒になって場合に
より置換されているメチレン基を形成する一般式Ｉの化
合物を形成し、続いて場合により例えばベルアセチル化
によって遊離ＯＨ基を封鎖し、４位又は６位の酸素原子
のメチレン橋を分解し必要の場合にはこのようにして形
成した４位又は６位の遊離ＯＨ基をなおエーテル化又は
エステル化又はエーテル置換又はエステル置換し、最後
に他のＯＨ−封鎖基、例えばアセチル基を脱離すること
によって行うことができる。
この合成で中間生成物として生じるが、その外に最終産
物としても好ましく場合により置換されているメチレン
橋を有する化合物は、一般式■： Ｒ３−Ｘ ＩＩ［式中Ｘは前
記のものを表わし、Ｒ３はグルコース単位３〜８個を有
するオリゴグルコシド基を表わすＪの化合物を、ｐ−）
ルオールスルホン酸の存在で一般弐■： ［式中Ｒ４及びＲ５は相互に独立にそれぞれ水素原子又
は炭素原子１〜５個を有するアルキル基又はフェニル基
を表わすＪの化合物と極性有機溶剤中で反応させること
によって製造される。
物としても好ましく場合により置換されているメチレン
橋を有する化合物は、一般式■： Ｒ３−Ｘ ＩＩ［式中Ｘは前
記のものを表わし、Ｒ３はグルコース単位３〜８個を有
するオリゴグルコシド基を表わすＪの化合物を、ｐ−）
ルオールスルホン酸の存在で一般弐■： ［式中Ｒ４及びＲ５は相互に独立にそれぞれ水素原子又
は炭素原子１〜５個を有するアルキル基又はフェニル基
を表わすＪの化合物と極性有機溶剤中で反応させること
によって製造される。
極性有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド又はホル
ムアミドが好ましいが、比較される塩基度を有する他の
極性有機溶剤も適当である意外なことにも、前記反応に
よって均一な生成物が得られ、存在する多くのＯＨ基を
保護することは不必要である。場合により形成した副産
物は容易に分離することができる。
ムアミドが好ましいが、比較される塩基度を有する他の
極性有機溶剤も適当である意外なことにも、前記反応に
よって均一な生成物が得られ、存在する多くのＯＨ基を
保護することは不必要である。場合により形成した副産
物は容易に分離することができる。
反応は好ましくは温度約ｌＯ〜７０°Ｃ１好ましくは室
温で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分
な収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の
一般式■の化合物で作業する。
温で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分
な収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の
一般式■の化合物で作業する。
一般弐■の化合物の例は、ジメトキシメタンジメトキシ
エタン、ジェトキシエタン、ジェトキシエタン、ジブト
キシエタン、ジメトキシプロパン、ジメトキシイソプロ
パン及びフエニルジメトキシメタンである。
エタン、ジェトキシエタン、ジェトキシエタン、ジブト
キシエタン、ジメトキシプロパン、ジメトキシイソプロ
パン及びフエニルジメトキシメタンである。
一般式■の化合物の例は、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオースマルトヘプタオース
及び末端で光学的に測定される基によって置換されてい
るこれらの誘導体、例エバモノニトロフェニルーマルト
へフタオース、３．４−ジニトロフェニル−マルトへブ
タオースその他である。
ペンタオース、マルトヘキサオースマルトヘプタオース
及び末端で光学的に測定される基によって置換されてい
るこれらの誘導体、例エバモノニトロフェニルーマルト
へフタオース、３．４−ジニトロフェニル−マルトへブ
タオースその他である。
本発明により使用される化合物のすぐれた保管貯蔵性は
基質としてのｐ−ニトロフェニルマルトへブタオシド（
Ｇ７１）ＮＰ）での十分に普及した常用のα−アミラー
ゼの呈色試験の条件下、即ち緩衝液のｐＨ７，１；Ｎａ
ＣＱ５０ｍＭ； ａ −グルコシダーゼ約３０Ｕ／ｍＱ
：基質５ｍＭで、４．６−エチリテンーｐ−二トロフェ
ニルマルトヘブタオシド（Ｅｔｈ −Ｇ７＋）ＮＰ）で
２５°Ｃで４日量的のラグ相及び線型に関する実際に同
じ反応経過でグルコースは形成しないが、Ｇ？ｐＮＰで
は著しいグルコースへの分解が生じることを示す４°Ｃ
での同じ条件下では、本発明による基質で８日間後にグ
ルコースの形成は生じなかったが、これに反して公知比
較基質では著しい分解が生じた。それ数本発明によって
、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダーゼの存
在ですぐれた性質を有する新規化合物が得られる。
基質としてのｐ−ニトロフェニルマルトへブタオシド（
Ｇ７１）ＮＰ）での十分に普及した常用のα−アミラー
ゼの呈色試験の条件下、即ち緩衝液のｐＨ７，１；Ｎａ
ＣＱ５０ｍＭ； ａ −グルコシダーゼ約３０Ｕ／ｍＱ
：基質５ｍＭで、４．６−エチリテンーｐ−二トロフェ
ニルマルトヘブタオシド（Ｅｔｈ −Ｇ７＋）ＮＰ）で
２５°Ｃで４日量的のラグ相及び線型に関する実際に同
じ反応経過でグルコースは形成しないが、Ｇ？ｐＮＰで
は著しいグルコースへの分解が生じることを示す４°Ｃ
での同じ条件下では、本発明による基質で８日間後にグ
ルコースの形成は生じなかったが、これに反して公知比
較基質では著しい分解が生じた。それ数本発明によって
、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダーゼの存
在ですぐれた性質を有する新規化合物が得られる。
実施例
例 ！ （参考例）
４．６−エチ’）テン−４−二トロフェニルーσ−Ｄ−
マルトヘプタオシドの製造法。
マルトヘプタオシドの製造法。
バッチ：
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘフタオシド
２５０ｇ （１９６ｍモル）アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール３１．５ｍｆ２（２９７ｍモル） パラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２０ ＤＭＦ （ジメチルホルムアミド） １．５（１合
成 ： ４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘフタオシド２５
０９及びパラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ２０ｇを
ＤＭＦ約１．５ａにとかし、無水にするために回転蒸発
器で回転させて乾燥する。その除水の含量が０．４％か
ら０．０２％に下がる。
２５０ｇ （１９６ｍモル）アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール３１．５ｍｆ２（２９７ｍモル） パラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２０ ＤＭＦ （ジメチルホルムアミド） １．５（１合
成 ： ４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘフタオシド２５
０９及びパラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ２０ｇを
ＤＭＦ約１．５ａにとかし、無水にするために回転蒸発
器で回転させて乾燥する。その除水の含量が０．４％か
ら０．０２％に下がる。
残渣をＤＭＦｌ、５１２にとかし、アセトアルデヒド−
ジメチルアセタール３１．５ｍ（２を添加し、先づ５０
°Ｃで９時間撹拌し、次いで室温で約１０時間維持する
。反応混合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化
リチウム溶液でｐｎ７．３に調節し、濾過し、７５０ｍ
Ｑに濃縮する。
ジメチルアセタール３１．５ｍ（２を添加し、先づ５０
°Ｃで９時間撹拌し、次いで室温で約１０時間維持する
。反応混合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化
リチウム溶液でｐｎ７．３に調節し、濾過し、７５０ｍ
Ｑに濃縮する。
ＨＰＬＣ分析によって、原料約２０％を有するエチリデ
ン−４−ニトロフェニル−α−Ｄマルトヘプタオシド約
７５〜８０％の含量が得られる。
ン−４−ニトロフェニル−α−Ｄマルトヘプタオシド約
７５〜８０％の含量が得られる。
クロマトグラフィーによる精製：
試料溶液（７５０ｍ１２）を、Ｄｏｗｅｘ５０ Ｗ
Ｘ ２（２００〜４００メツシユ）リチウム＋７０ｆｆ
を有する１５０Ｘ２５ｃｍのカラムにあケ、水テ流！１
．５Ｑ／時間で溶出する。その際７ラクウヨン４．５Ｑ
を採取し、クロマトグラフィーヲ紫外線検出器を用いて
２８０ｎｍで行う。
Ｘ ２（２００〜４００メツシユ）リチウム＋７０ｆｆ
を有する１５０Ｘ２５ｃｍのカラムにあケ、水テ流！１
．５Ｑ／時間で溶出する。その際７ラクウヨン４．５Ｑ
を採取し、クロマトグラフィーヲ紫外線検出器を用いて
２８０ｎｍで行う。
約１００ｆｆによって未反応の４−二トロフェニルーα
−Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約２００Ｑによっ
て求める生成物が溶出する。
−Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約２００Ｑによっ
て求める生成物が溶出する。
生成物を含有するフラクションを合し、濃縮乾燥する。
残渣をメタノール１．５Ｑにとかし、濾過し、０°Ｃで
イソプロパツール４１２及び石油エーテルｌＯＱで沈殿
させる。４°Ｃで１夜撹拌後に、生成物を吸引濾過し、
イソプロパツール及び石油エーテルで洗浄し、乾燥基中
で３０°Ｃで乾燥する。
イソプロパツール４１２及び石油エーテルｌＯＱで沈殿
させる。４°Ｃで１夜撹拌後に、生成物を吸引濾過し、
イソプロパツール及び石油エーテルで洗浄し、乾燥基中
で３０°Ｃで乾燥する。
収：Ｉｉｔ：１５０ｇ （理論量の５８％）、無色の粉
末、分子量１３００゜ 分析： Ｈ２Ｏ［７（シャー （Ｋ、 Ｆｉｓｃｈｅｒ）による
１イソプロパツール（ガスクロマトグラフィーによる）
５％酸性加水分解（酵
素）によるアセトアルデヒド９１％ ［α］Ｄ２５°Ｃ（乾燥物質に対する）−７７°（Ｃ−
１、Ｈ２Ｏ） ＨＰＬＣ：面の％９９ （−ＮＨ２−柱５μ；アセトニ
トリル／水１：ｌｃ−燐酸１ｍモル／ｆｆ、３０５ｎｍ
で検波）。
末、分子量１３００゜ 分析： Ｈ２Ｏ［７（シャー （Ｋ、 Ｆｉｓｃｈｅｒ）による
１イソプロパツール（ガスクロマトグラフィーによる）
５％酸性加水分解（酵
素）によるアセトアルデヒド９１％ ［α］Ｄ２５°Ｃ（乾燥物質に対する）−７７°（Ｃ−
１、Ｈ２Ｏ） ＨＰＬＣ：面の％９９ （−ＮＨ２−柱５μ；アセトニ
トリル／水１：ｌｃ−燐酸１ｍモル／ｆｆ、３０５ｎｍ
で検波）。
例 ２（参考例）
４６−ニチリデンーマルトヘプタオースの製造法。
バッチ：
マルトヘプタオース １０９（８，７７７１モル）アセ
トアルデヒド−ジメチルアセタール１．８＋＋１１２（
１７７７１モル） パラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ１９ＤＭＦ
７５ｍＱ合 成 ： ４．５％ マルトヘプタオース１０ｇ及びパラートルオ−ルスルホ
ン酸・Ｈ２Ｃ１ｇをＤＭＦｌｏｏｍＱにとかし、濃縮乾
燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をＤＭＦ７
５ｍ（ｌにとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセタ
ール１．７ｍＱヲ加え、密閉して５０°Ｃで１５時間撹
拌する。次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にとか
し、水酸化リチウムでｐＨ７に中和し、濾過し、５０ｍ
Ｑに濃縮する。
トアルデヒド−ジメチルアセタール１．８＋＋１１２（
１７７７１モル） パラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ１９ＤＭＦ
７５ｍＱ合 成 ： ４．５％ マルトヘプタオース１０ｇ及びパラートルオ−ルスルホ
ン酸・Ｈ２Ｃ１ｇをＤＭＦｌｏｏｍＱにとかし、濃縮乾
燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をＤＭＦ７
５ｍ（ｌにとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセタ
ール１．７ｍＱヲ加え、密閉して５０°Ｃで１５時間撹
拌する。次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にとか
し、水酸化リチウムでｐＨ７に中和し、濾過し、５０ｍ
Ｑに濃縮する。
クロマトグラフィーによる精製：
試料溶液５０ｍ（２を、Ｄｏｗｅｘ５０ ＷＸ ２
（２００〜４００メツシユ）Ｌ＋ ３．５０を有するク
ロマトグラフィーのカラム（１８０Ｘ５ｃｍ）Ｉこあけ
水で流量１５０ ｍＱ／時間で溶出する。紫外線検波器
（２８０ｎｍ）を通るフラクション３０ｍＱを採取する
。
（２００〜４００メツシユ）Ｌ＋ ３．５０を有するク
ロマトグラフィーのカラム（１８０Ｘ５ｃｍ）Ｉこあけ
水で流量１５０ ｍＱ／時間で溶出する。紫外線検波器
（２８０ｎｍ）を通るフラクション３０ｍＱを採取する
。
１．８１２によりマルトヘプタオースが溶出し、２．２
！ｌにより工、チリデンーマルトヘプタオースが溶出す
る。
！ｌにより工、チリデンーマルトヘプタオースが溶出す
る。
主要フラクションを合し、回転させて乾燥し水を若干添
加してメタノール２００ｍＱにとかしイソプロパツール
２００ｍ１２を加え、４℃で撹拌する。その際生成物が
沈殿し、これを吸引濾過しイソプロパツール及び石油エ
ーテルで洗浄し、真空中で２５°ＣでＰ２Ｏ５によって
乾燥する。
加してメタノール２００ｍＱにとかしイソプロパツール
２００ｍ１２を加え、４℃で撹拌する。その際生成物が
沈殿し、これを吸引濾過しイソプロパツール及び石油エ
ーテルで洗浄し、真空中で２５°ＣでＰ２Ｏ５によって
乾燥する。
収ｉ：６．２ｇ （理論量の６０％）
分析：
水［フィシャ−（Ｋ、 Ｆｉｓｃｈｅｒ）による１７．
６％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド９１．２
％ 〔αＩＤ２５°Ｃ（乾燥物質に対する）−６９° （ｃ
＝ｌ、Ｈ２Ｃ） ＨＰＬＣ（例１の条件参照）：面の％ ９６テトラゾリ
ウムブルーとの反応は、還元性末端が存在しないことを
示す。
６％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド９１．２
％ 〔αＩＤ２５°Ｃ（乾燥物質に対する）−６９° （ｃ
＝ｌ、Ｈ２Ｃ） ＨＰＬＣ（例１の条件参照）：面の％ ９６テトラゾリ
ウムブルーとの反応は、還元性末端が存在しないことを
示す。
例 ３
試薬：
エチリデ７−Ｇ７ｐＮＰ ６８２．５ｍｇ（５，２５ｍ
モル／Ｃ）を、塩化ナトリウム（５２，５ｍモル／１２
）並びにアルファーグルコンダーゼ（４２Ｕ ／ ｍρ
）を含有する燐酸ナトリウム緩衝液１゜０ｍ１２（１０
５ｍモル／Ｑ）にとかし、ｐＨ７，１０に調節した。
モル／Ｃ）を、塩化ナトリウム（５２，５ｍモル／１２
）並びにアルファーグルコンダーゼ（４２Ｕ ／ ｍρ
）を含有する燐酸ナトリウム緩衝液１゜０ｍ１２（１０
５ｍモル／Ｑ）にとかし、ｐＨ７，１０に調節した。
試験の最終濃度：
燐酸塩緩衝液１００ｍモル／ Ｑ、 ＮａＣＱ５０ ｍ
モル／Ｑ１基質５ｍモル／Ｌ アルファーグルコンダー
ゼ４０Ｕ／ｍＱ０ 試験バッチ； ２５°Ｃに加熱した試薬２．０ｍ＋２に試料０ 、１
ｒｎ（１を添加し、混合物を２５°Ｃに加熱した。予培
養時間４分間（ラグ相）後に、吸光の増大を８ｇ４０５
ｎｍでエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ ｆ ）光度
計で記録した。毎分の吸光の変化（へＥ／分）から、試
料中のアミラーゼの活性を次式によって計算した。
モル／Ｑ１基質５ｍモル／Ｌ アルファーグルコンダー
ゼ４０Ｕ／ｍＱ０ 試験バッチ； ２５°Ｃに加熱した試薬２．０ｍ＋２に試料０ 、１
ｒｎ（１を添加し、混合物を２５°Ｃに加熱した。予培
養時間４分間（ラグ相）後に、吸光の増大を８ｇ４０５
ｎｍでエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ ｆ ）光度
計で記録した。毎分の吸光の変化（へＥ／分）から、試
料中のアミラーゼの活性を次式によって計算した。
れ ｔこ 。
最初の値
４時間（２５℃）
８時間 ／／
２４時間 ／／
３２時間 ／１
４８時間 ／／
８時間（４℃）
２４時間 ／１
４８時間 ！／
７２時間 ！７
８０時間 ／１
１】９
Ｅ ・■・ ｄ
アルファーアミラーゼの再発見：
活性の測定を、４°Ｃ及び２５°Ｃで保存した試薬で一
定の時間間隔でくり返し、次の値が得ら個々の値は、手
工による酵素の活性の測定に対する通常の変動中である
。
定の時間間隔でくり返し、次の値が得ら個々の値は、手
工による酵素の活性の測定に対する通常の変動中である
。
什
卯
人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、α−グルコシダーゼの存在下に、一般式 I ：▲数
式、化学式、表等があります▼ ［式中Ｒ及びＲ＿１は、相互に独立にそれぞれ炭素原子
１〜６個を有する直鎖状又は分枝状のアルキル基又はア
ルコール基又はフェニル基を表わし、その際Ｒ及びＲ＿
１は一緒になってメチレン橋を形成してもよく、その水
素原子は相互に独立にそれぞれ炭素原子１〜５個を有す
るアルキル基又はフェニル基によって置換されていても
よく、Ｒ＿２はグルコース単位２〜７個を有するオリゴ
グルコシド基を表わし、Ｘは水素原子又は光学的に測定
される基を表わす］の化合物を試料に添加し、かつ該試
料中のα−アミラーゼの存在又は不存在もしくはその量
を、測定尺度としてのＸを測定することにより確定する
ことを特徴とするα−アミラーゼの測定法。 ２、Ｘがニトロフェニルである特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ３、Ｘが３，４−ジニトロフェニルである特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ４、Ｘが水素である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、Ｒ及びＲ＿１がメチル基により置換されたメチレン
橋を表わしてエチリデンを形成する特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ６、Ｒ及びＲ＿１がフェニル基により置換されたメチレ
ン橋を表わしてベンジリデンを形成する特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ７、Ｘがニトロフェニルである特許請求の範囲第５項記
載の方法。 ８、Ｒ及びＲ＿１の少なくとも一方が炭素原子１〜６個
を有するアルキル基である特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ９、アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ
プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−
ペンチル及びその異性体、ｎ−ヘキシル及びその異性体
並びにシクロヘキシルより成る群類から選択される特許
請求の範囲第８項記載の方法。 １０、Ｒ及びＲ＿１の少なくとも一方が炭素原子１〜６
個を有するアルコール基である特許請求の範囲第１項記
載の方法。 １１、アルコール基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、
イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、
ｎ−ペンチル及びその異性体、ｎ−ヘキシル及びその異
性体並びにシクロヘキシルより成る群類から選択される
アルキル基の誘導基である特許請求の範囲第１０項記載
の方法。 １２、Ｒ及びＲ＿１の少なくとも一方がフェニル基であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、Ｒ及びＲ＿１がメチレン橋を形成する特許請求の
範囲第１項記載の方法。 １４、メチレン橋が炭素原子１〜５個を有するアルキル
基又はフェニル基により置換されている特許請求の範囲
第１３項記載の方法。 １５、Ｒ＿２がグルコース単位３、４又は６個を含有す
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １６、 I 式の化合物が４，６−エチリデン−４−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドである特許請
求の範囲第１項記載の方法。 １７、 I 式の化合物が４，６−エチリデンマルトヘプ
タオシドである特許請求の範囲第１項記載の方法。 １８、Ｒ＿２がグルコース単位６個を含有するオリゴグ
ルコシド基である特許請求の範囲第１項記載の方法。 １９、Ｒ＿２がグルコース単位６個を含有するオリゴグ
ルコシド基である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ２０、Ｒ＿２がグルコース単位６個を含有するオリゴグ
ルコシド基である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２１、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ I ［式中Ｒ及びＲ＿１は、相互に独立にそれぞれ炭素原子
１〜６個を有する直鎖状又は分枝状のアルキル基又はア
ルコール基又はフェニル基を表わし、その際Ｒ及びＲ＿
１は一緒になってメチレン橋を形成してもよく、その水
素原子は相互に独立にそれぞれ炭素原子１〜５個を有す
るアルキル基又はフェニル基によって置換されていても
よく、Ｒ＿２はグルコース単位２〜７個を有するオリゴ
グルコシド基を表わし、Ｘは水素原子又は光学的に測定
される基を表わす］の化合物及びα−グルコシダーゼを
含有するα−アミラーゼ測定用試薬。 ２２、Ｘがニトロフェニルである特許請求の範囲第２１
項記載の方法。 ２３、Ｘが３，４−ジニトロフェニルである特許請求の
範囲第２１項記載の方法。 ２４、Ｒ及びＲ＿１がメチル基により置換されたメチレ
ン橋を表わしてエチリデンを形成する特許請求の範囲第
２１項記載の方法。 ２５、Ｒ及びＲ＿１がフェニル基により置換されたメチ
レン橋を表わしてベンジリデンを形成する特許請求の範
囲第２１項記載の方法。 ２６、Ｒ＿２がグルコース単位３、４又は６個を含有す
る特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２７、 I 式の化合物が４，６−エチリデン−４−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドである特許請
求の範囲第２１項記載の方法２８、 I 式の化合物が４
，６−エチリデンマルトヘプタオシドである特許請求の
範囲第２１項記載の方法。 ２９、Ｒ＿２がグルコース単位６個を含有するオリゴグ
ルコシド基である特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ３０、Ｒ＿２がグルコース単位６個を含有するオリゴグ
ルコシド基である特許請求の範囲第２４項記載の方法。 ３１、Ｒ＿２がグルコース単位６個を含有するオリゴグ
ルコシド基である特許請求の範囲第２５項記載の方法。
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