JPH0515436B2 - - Google Patents
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Description
産業上の利用分野
本発明は、後記の一般式の化合物をα−アミ
ラーゼを測定するための基質として使用すること
に関する。 従来の技術 血清中のα−アミラーゼの測定は、すいぞうの
機能の重要な臨床上のパラメータである。α−ア
ミラーゼを測定するために市場で得られる試薬
は、以前には主として基質としての澱粉又は澱粉
誘導体の使用であつた。しかしながらこの基質
は、殊に均一性に関して不十分であることが判明
した。それ故この欠点を除去するために、澱粉及
び澱粉誘導体をオリゴサツカリド及びその光学的
に測定される誘導体に代え、その際殊にマルトテ
トラオース、−ペンタオース、−ヘキサオース及び
−ヘプタオース及びこれらの誘導体によつて重要
な改良が得られた（ドイツ公開特許第2741192号
明細書、ドイツ公開特許第2755803号明細書、米
国特許第3879263号明細書、米国特許第4000042号
明細書）。 前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラ
ーゼ測定の特に重要な実施形式は、α−グルコシ
ダーゼの存在で得られた。それというのもオリゴ
グルコシドのグルコースへの完全な分解が得ら
れ、更にグルコースはこのための公知方法によつ
て容易に測定することができたからである（ドイ
ツ公開特許第2741192号明細書参照）。 しかしながら、助酵素のα−グルコシダーゼ
は、でき上がつた試薬混合物の保管貯蔵時間を下
げることが判明した。それというのもこれはα−
アミラーゼの影響を有しないで、オリゴグルコシ
ドの一定分解を惹起するからである。 発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去
し、α−グルコシダーゼの存在でも十分に保存す
ることができ、α−アミラーゼの検出の正確性を
改良するα−アミラーゼの測定法及びそのための
試薬である。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば、一般式： ［式中Ｒ及びR1は一緒になつてメチレン橋を
形成し、この架橋基はメチル基又はフエニル基に
よつて置換されており、R2はグルコース単位２
〜７個を有するオリゴグルコシド基を表わし、Ｘ
は水素原子又は光学的に測定される基を表わす］
の化合物の使用によつて解決される。 本発明による化合物ですぐ使える試薬は、α−
グルコシダーゼの存在でも変化をこうむらずそれ
故長時間後にも正確なα−アミラーゼの値が得ら
れる。 アルキル基としては、メチル−、エチル−、プ
ロピル−、イソプロピル−、ブチル−、イソブチ
ル−、ｔ−ブチル−、ｎ−ペンチル基、これらの
異性体、ｎ−ヘキシル基、この異性体並びにシク
ロヘキシル基が挙げられる。同じようにして、前
記アルキル基に相応するアルコイル基は、末端グ
ルコシド基の４位及び／又は６位の酸素原子の置
換分として該当する。本発明の範囲内ではＲと
R1とが一緒になつて場合により置換されている
メチレン橋を形成する化合物が好ましく、特にア
ルキル基又はフエニル基、殊にエチリデン基又は
ベンジリデン基によつて置換されている化合物好
ましい。 オリゴグルコシド基R2では、グルコース単位
３，４及び６個を有するものが好ましい。 Ｘが光学的に測定される基の場合には、可視光
線又は紫外線の帯域でも色を有する基であるか又
は他の化合物との反応により、例えば色素に変換
するか又は色素と結合して光学的に測定される基
である。かかる光学的に測定される基は当業者に
は明らかであり、詳説は不必要である。好ましく
はニトロ基を有するフエニル基、例えばニトロフ
エニル基又は３，４−ジニトロフエニル基であ
る。 Ｘが水素原子である場合の測定は、当業者に知
られているように、UV中で実施する光学測定が
該当する。例えば、その方法は、ドイツ公開特許
第2741192号に記載されている。 本発明により使用される化合物の製造は、末端
に場合により光学的に測定される基Ｘを有するグ
ルコース単位３〜８個を有するオリゴグルコシド
から出発して、これをエステル化又はエーテル化
の条件下にオルトオキシ化合物、好ましくはジア
ルコキシエタン又は相応するベンジル誘導体と反
応させ、Ｒ及びR1が一緒になつて場合により置
換されているメチレン基を形成する一般式の化
合物を形成し、続いて場合により例えばペルアセ
チル化によつて遊離OH基を封鎖し、４位又は６
位の酸素原子のメチレン橋を分解し必要の場合に
はこのようにして形成した４位又は６位の遊離
OH基をなおエーテル化又はエステル化又はエー
テル置換又はエステル置換し、最後に他のOH−
封鎖基、例えばアセチル基を脱離することによつ
て行うことができる。 この合成で中間生成物として生じるが、その外
に最終産物としても好ましく場合により置換され
ているメチレン橋を有する化合物は、一般式： R3−Ｘ ［式中Ｘは前記のものを表わし、R3はグルコ
ース単位３〜８個を有するオリゴグルコシド基を
表わす］の化合物を、ｐ−トルオールスルホン酸
の存在で一般式： ［式中R4及びR5は相互に独立にそれぞれ水素
原子又は炭素原子１〜５個を有するアルキル基又
はフエニル基を表わす］の化合物と極性有機溶剤
中で反応させることによつて製造される。 極性有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド
又はホルムアミドが好ましいが、比較される塩基
度を有する他の極性有機溶剤も適当である。 意外なことにも、前記反応によつて均一な生成
物が得られ、存在する多くのOH基を保護するこ
とは不必要である。場合により形成した副産物は
容易に分離することができる。 反応は好ましくは温度約10〜70℃、好ましくは
室温で行う。反応では殆ど副産物は形成しないの
で、十分な収率を得るためには、好ましくは化学
量論的過剰量の一般式の化合物で作業する。 一般式の化合物の例は、ジメトキシメタン、
ジメトキシエタン、ジエトキシエタン、ジプロポ
キシエタン、ジブトキシエタン、ジメトキシプロ
パン、ジメトキシイソプロパン及びフエニルジメ
トキシメタンである。 一般式の化合物の例は、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、
マルトヘプタオース及び端末で光学的に測定され
る基によつて置換されているこれらの誘導体、例
えばモノニトロフエニル−マルトヘプタオース、
３，４−ジニトロフエニル−マルトヘプタオース
その他である。 本発明により使用される化合物のすぐれた保管
貯蔵性は基質としてのｐ−ニトロフエニルマルト
ヘプタオシド（G7pNP）での十分に普及した常
用のα−アミラーゼの呈色試験の条件下、即ち緩
衝液のPH7.1；NaCl50mM；α−グルコシダーゼ
約30U／ml；基質5mMで、４，６−エチリデン
−ｐ−ニトロフエニルマルトヘプタオシド（Eth
−G7pNP）で25℃で４日間内のラグ相及び線型
に関する実際に同じ反応経過でグルコースは形成
しないが、G7pNPでは著しいグルコースへの分
解が生じることを示す。４℃での同じ条件下で
は、本発明による基質で８日間後にグルコースの
形成は生じなかつたが、これに反して公知比較基
質では著しい分解が生じた。それ故本発明によつ
て、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダ
ーゼの存在ですぐれた性質を有する新規化合物が
得られる。 実施例 例１ （参考例） ４，６−エチリデン−４−ニトロフエニル−α
−Ｄ−マルトヘプタオシドの製造法。 バツチ： ４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオ
シド 250ｇ（196ｍモル） アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
31.5ml（297ｍモル） パラートルオールスルホン酸・H2Ｏ 20ｇ DMF（ジメチルホルムアミド） 1.5 合 成： ４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオ
シド250ｇ及びパラートルオールスルホン酸・H2
Ｏ 20ｇをDMF約1.5にとかし、無水にするた
めに回転蒸発器で回転させて乾燥する。その際水
の含量が0.4％から0.02％に下がる。 残渣をDMF1.5にとかし、アセトアルデヒド
−ジメチルアセタール31.5mlを添加し、先づ50℃
で９時間攪拌し、次いで室温で約10時間維持す
る。反応混合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとか
し、水酸化リチウム溶液でPH7.3に調節し、濾過
し、750mlに濃縮する。 HPLC分析によつて、原料約20％を有するエチ
リデン−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘ
プタオシド約75〜80％の含量が得られる。 クロマトグラフイーによる精製： 試料溶液（750ml）を、Dowex50 WX2（200〜
400メツシユ）リチウム+70を有する150×25cm
のカラムにあけ、水で流量1.5／時間で溶出す
る。その際フラクシヨン4.5を採取し、クロマ
トグラフイーを紫外線検出器を用いて280nmで行
う。 約100によつて未反応の４−ニトロフエニル
−α−Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約200
によつて求める生成物が溶出する。 生成物を含有するフラクシヨンを合し、濃縮乾
燥する。残渣をメタノール1.5にとかし、濾過
し、０℃でイソプロパノール４及び石油エーテ
ル10で沈殿させる。４℃で１夜撹拌後に、生成
物を吸引濾過し、イソプロパノール及び石油エー
テルで洗浄し、乾燥器中で30℃で乾燥する。 収量：150ｇ（理論量の58％）、無色の粉末、分子
量1300。 分析： H2Ｏ［フイシヤー（K.Fischer）による］イソプ
ロパノール（ガスクロマトグラフイーによる）
５％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド
91％ ［α］D 25℃（乾燥物質に対する）＝77°（ｃ＝１，
H2Ｏ） HPLC：面の％99（−NH2−柱5μ；アセトニトリ
ル／水１：１，ｃ−燐酸1mモル／，305nmで
検波）。 例２ （参考例） ４，６−エチリデン−マルトヘプタオースの製
造法。 バツチ： マルトヘプタオース 10ｇ（8.7ｍモル） アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
1.8ml（17ｍモル） パラートルオールスルホン酸・H2Ｏ １ｇ DMF 75ml 合成： マルトヘプタオース10ｇ及びパラートルオール
スルホン酸・H2Ｏ １ｇをDMF100mlにとかし、
濃縮乾燥する。この方法で残渣を無水にする。残
渣をDMF75mlにとかし、アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール1.7mlを加え、密閉して50℃で
15時間攪拌する。次いで反応溶液を濃縮乾燥し、
残渣を水にとかし、水酸化リチウムでPH７に中和
し、濾過し、50mlに濃縮する。 クロマトグラフイーによる精製： 試料溶液50mlを、Dowex50 WX2（200〜400メ
ツシユ）L+3.5を有するクロマトグラフイーの
カラム（180×５cm）にあけ水で流量150ml／時間
で溶出する。紫外線検波器（280nm）を通るフラ
クシヨン30mlを採取する。 1.8によりマルトヘプタオースが溶出し、
2.25によりエチリデン−マルトヘプタオースが
溶出する。 主要フラクシヨンを合し、回転させて乾燥し水
を若干添加してメタノール200mlにとかし、イソ
プロパノール200mlを加え、４℃で撹拌する。そ
の際生成物が沈殿し、これを吸引濾過し、イソプ
ロパノール及び石油エーテルで洗浄し、真空中で
25℃でP2O5によつて乾燥する。 収量：6.2ｇ（理論量の60％）、 分析： 水［フイシヤー（K.Fischer）による］ 7.6％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド
91.2％ ［α］D 25℃（乾燥物質に対する）＝69°（ｃ＝１，
H2Ｏ） HPLC（例１の条件参照）：面の％ 96 テトラゾリウムブルーとの反応は、還元性末端
が存在しないことを示す。 例 ３ 試薬： エチリデン−G7pNP 682.5mg（5.25mモル／
）を、塩化ナトリウム（52.5mモル／）並び
にアルファーグルコシダーゼ（42U／ml）を含有
する燐酸ナトリウム緩衝液100ml（105mモル／
）にとかし、PH7.10に調節した。 試験の最終濃度： 燐酸塩緩衝液100mモル／，NaCl 50mモ
ル／、基質5mモル／、アルファーグルコシ
ダーゼ40U／ml。 試験バツチ： 25°に加熱した試薬2.0mlに試薬0.1mlを添加し、
混合物を25℃に加熱した。予培養時間４分間（ラ
グ相）後に、吸光の増大をHg405nmでエツペン
ドルフ（Eppendorf）光度計で記憶した。毎分の
吸光の変化（ΔE／分）から、試料中のアミラー
ゼの活性を次式によつて計算した。 ΔE／分・Ｖ・1000・３／Ｅ・ｖ・ｄ＝ΔE／分・70
00［Ｕ／］ 前記式中ｖは使用した試料の容量を表し、Ｖは
使用した試薬及び試料の容量（全容量）を表し、
ｄはキユベツトの総厚を表す（一般に１cm）。 アルフアーアミラーゼの再発見： 活性の測定を、４℃及び25℃で保存した試薬で
一定の時間間隔でくり返し、次の値が得られた。
ラーゼを測定するための基質として使用すること
に関する。 従来の技術 血清中のα−アミラーゼの測定は、すいぞうの
機能の重要な臨床上のパラメータである。α−ア
ミラーゼを測定するために市場で得られる試薬
は、以前には主として基質としての澱粉又は澱粉
誘導体の使用であつた。しかしながらこの基質
は、殊に均一性に関して不十分であることが判明
した。それ故この欠点を除去するために、澱粉及
び澱粉誘導体をオリゴサツカリド及びその光学的
に測定される誘導体に代え、その際殊にマルトテ
トラオース、−ペンタオース、−ヘキサオース及び
−ヘプタオース及びこれらの誘導体によつて重要
な改良が得られた（ドイツ公開特許第2741192号
明細書、ドイツ公開特許第2755803号明細書、米
国特許第3879263号明細書、米国特許第4000042号
明細書）。 前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラ
ーゼ測定の特に重要な実施形式は、α−グルコシ
ダーゼの存在で得られた。それというのもオリゴ
グルコシドのグルコースへの完全な分解が得ら
れ、更にグルコースはこのための公知方法によつ
て容易に測定することができたからである（ドイ
ツ公開特許第2741192号明細書参照）。 しかしながら、助酵素のα−グルコシダーゼ
は、でき上がつた試薬混合物の保管貯蔵時間を下
げることが判明した。それというのもこれはα−
アミラーゼの影響を有しないで、オリゴグルコシ
ドの一定分解を惹起するからである。 発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去
し、α−グルコシダーゼの存在でも十分に保存す
ることができ、α−アミラーゼの検出の正確性を
改良するα−アミラーゼの測定法及びそのための
試薬である。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば、一般式： ［式中Ｒ及びR1は一緒になつてメチレン橋を
形成し、この架橋基はメチル基又はフエニル基に
よつて置換されており、R2はグルコース単位２
〜７個を有するオリゴグルコシド基を表わし、Ｘ
は水素原子又は光学的に測定される基を表わす］
の化合物の使用によつて解決される。 本発明による化合物ですぐ使える試薬は、α−
グルコシダーゼの存在でも変化をこうむらずそれ
故長時間後にも正確なα−アミラーゼの値が得ら
れる。 アルキル基としては、メチル−、エチル−、プ
ロピル−、イソプロピル−、ブチル−、イソブチ
ル−、ｔ−ブチル−、ｎ−ペンチル基、これらの
異性体、ｎ−ヘキシル基、この異性体並びにシク
ロヘキシル基が挙げられる。同じようにして、前
記アルキル基に相応するアルコイル基は、末端グ
ルコシド基の４位及び／又は６位の酸素原子の置
換分として該当する。本発明の範囲内ではＲと
R1とが一緒になつて場合により置換されている
メチレン橋を形成する化合物が好ましく、特にア
ルキル基又はフエニル基、殊にエチリデン基又は
ベンジリデン基によつて置換されている化合物好
ましい。 オリゴグルコシド基R2では、グルコース単位
３，４及び６個を有するものが好ましい。 Ｘが光学的に測定される基の場合には、可視光
線又は紫外線の帯域でも色を有する基であるか又
は他の化合物との反応により、例えば色素に変換
するか又は色素と結合して光学的に測定される基
である。かかる光学的に測定される基は当業者に
は明らかであり、詳説は不必要である。好ましく
はニトロ基を有するフエニル基、例えばニトロフ
エニル基又は３，４−ジニトロフエニル基であ
る。 Ｘが水素原子である場合の測定は、当業者に知
られているように、UV中で実施する光学測定が
該当する。例えば、その方法は、ドイツ公開特許
第2741192号に記載されている。 本発明により使用される化合物の製造は、末端
に場合により光学的に測定される基Ｘを有するグ
ルコース単位３〜８個を有するオリゴグルコシド
から出発して、これをエステル化又はエーテル化
の条件下にオルトオキシ化合物、好ましくはジア
ルコキシエタン又は相応するベンジル誘導体と反
応させ、Ｒ及びR1が一緒になつて場合により置
換されているメチレン基を形成する一般式の化
合物を形成し、続いて場合により例えばペルアセ
チル化によつて遊離OH基を封鎖し、４位又は６
位の酸素原子のメチレン橋を分解し必要の場合に
はこのようにして形成した４位又は６位の遊離
OH基をなおエーテル化又はエステル化又はエー
テル置換又はエステル置換し、最後に他のOH−
封鎖基、例えばアセチル基を脱離することによつ
て行うことができる。 この合成で中間生成物として生じるが、その外
に最終産物としても好ましく場合により置換され
ているメチレン橋を有する化合物は、一般式： R3−Ｘ ［式中Ｘは前記のものを表わし、R3はグルコ
ース単位３〜８個を有するオリゴグルコシド基を
表わす］の化合物を、ｐ−トルオールスルホン酸
の存在で一般式： ［式中R4及びR5は相互に独立にそれぞれ水素
原子又は炭素原子１〜５個を有するアルキル基又
はフエニル基を表わす］の化合物と極性有機溶剤
中で反応させることによつて製造される。 極性有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド
又はホルムアミドが好ましいが、比較される塩基
度を有する他の極性有機溶剤も適当である。 意外なことにも、前記反応によつて均一な生成
物が得られ、存在する多くのOH基を保護するこ
とは不必要である。場合により形成した副産物は
容易に分離することができる。 反応は好ましくは温度約10〜70℃、好ましくは
室温で行う。反応では殆ど副産物は形成しないの
で、十分な収率を得るためには、好ましくは化学
量論的過剰量の一般式の化合物で作業する。 一般式の化合物の例は、ジメトキシメタン、
ジメトキシエタン、ジエトキシエタン、ジプロポ
キシエタン、ジブトキシエタン、ジメトキシプロ
パン、ジメトキシイソプロパン及びフエニルジメ
トキシメタンである。 一般式の化合物の例は、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、
マルトヘプタオース及び端末で光学的に測定され
る基によつて置換されているこれらの誘導体、例
えばモノニトロフエニル−マルトヘプタオース、
３，４−ジニトロフエニル−マルトヘプタオース
その他である。 本発明により使用される化合物のすぐれた保管
貯蔵性は基質としてのｐ−ニトロフエニルマルト
ヘプタオシド（G7pNP）での十分に普及した常
用のα−アミラーゼの呈色試験の条件下、即ち緩
衝液のPH7.1；NaCl50mM；α−グルコシダーゼ
約30U／ml；基質5mMで、４，６−エチリデン
−ｐ−ニトロフエニルマルトヘプタオシド（Eth
−G7pNP）で25℃で４日間内のラグ相及び線型
に関する実際に同じ反応経過でグルコースは形成
しないが、G7pNPでは著しいグルコースへの分
解が生じることを示す。４℃での同じ条件下で
は、本発明による基質で８日間後にグルコースの
形成は生じなかつたが、これに反して公知比較基
質では著しい分解が生じた。それ故本発明によつ
て、α−アミラーゼの基質としてα−グルコシダ
ーゼの存在ですぐれた性質を有する新規化合物が
得られる。 実施例 例１ （参考例） ４，６−エチリデン−４−ニトロフエニル−α
−Ｄ−マルトヘプタオシドの製造法。 バツチ： ４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオ
シド 250ｇ（196ｍモル） アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
31.5ml（297ｍモル） パラートルオールスルホン酸・H2Ｏ 20ｇ DMF（ジメチルホルムアミド） 1.5 合 成： ４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオ
シド250ｇ及びパラートルオールスルホン酸・H2
Ｏ 20ｇをDMF約1.5にとかし、無水にするた
めに回転蒸発器で回転させて乾燥する。その際水
の含量が0.4％から0.02％に下がる。 残渣をDMF1.5にとかし、アセトアルデヒド
−ジメチルアセタール31.5mlを添加し、先づ50℃
で９時間攪拌し、次いで室温で約10時間維持す
る。反応混合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとか
し、水酸化リチウム溶液でPH7.3に調節し、濾過
し、750mlに濃縮する。 HPLC分析によつて、原料約20％を有するエチ
リデン−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘ
プタオシド約75〜80％の含量が得られる。 クロマトグラフイーによる精製： 試料溶液（750ml）を、Dowex50 WX2（200〜
400メツシユ）リチウム+70を有する150×25cm
のカラムにあけ、水で流量1.5／時間で溶出す
る。その際フラクシヨン4.5を採取し、クロマ
トグラフイーを紫外線検出器を用いて280nmで行
う。 約100によつて未反応の４−ニトロフエニル
−α−Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約200
によつて求める生成物が溶出する。 生成物を含有するフラクシヨンを合し、濃縮乾
燥する。残渣をメタノール1.5にとかし、濾過
し、０℃でイソプロパノール４及び石油エーテ
ル10で沈殿させる。４℃で１夜撹拌後に、生成
物を吸引濾過し、イソプロパノール及び石油エー
テルで洗浄し、乾燥器中で30℃で乾燥する。 収量：150ｇ（理論量の58％）、無色の粉末、分子
量1300。 分析： H2Ｏ［フイシヤー（K.Fischer）による］イソプ
ロパノール（ガスクロマトグラフイーによる）
５％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド
91％ ［α］D 25℃（乾燥物質に対する）＝77°（ｃ＝１，
H2Ｏ） HPLC：面の％99（−NH2−柱5μ；アセトニトリ
ル／水１：１，ｃ−燐酸1mモル／，305nmで
検波）。 例２ （参考例） ４，６−エチリデン−マルトヘプタオースの製
造法。 バツチ： マルトヘプタオース 10ｇ（8.7ｍモル） アセトアルデヒド−ジメチルアセタール
1.8ml（17ｍモル） パラートルオールスルホン酸・H2Ｏ １ｇ DMF 75ml 合成： マルトヘプタオース10ｇ及びパラートルオール
スルホン酸・H2Ｏ １ｇをDMF100mlにとかし、
濃縮乾燥する。この方法で残渣を無水にする。残
渣をDMF75mlにとかし、アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール1.7mlを加え、密閉して50℃で
15時間攪拌する。次いで反応溶液を濃縮乾燥し、
残渣を水にとかし、水酸化リチウムでPH７に中和
し、濾過し、50mlに濃縮する。 クロマトグラフイーによる精製： 試料溶液50mlを、Dowex50 WX2（200〜400メ
ツシユ）L+3.5を有するクロマトグラフイーの
カラム（180×５cm）にあけ水で流量150ml／時間
で溶出する。紫外線検波器（280nm）を通るフラ
クシヨン30mlを採取する。 1.8によりマルトヘプタオースが溶出し、
2.25によりエチリデン−マルトヘプタオースが
溶出する。 主要フラクシヨンを合し、回転させて乾燥し水
を若干添加してメタノール200mlにとかし、イソ
プロパノール200mlを加え、４℃で撹拌する。そ
の際生成物が沈殿し、これを吸引濾過し、イソプ
ロパノール及び石油エーテルで洗浄し、真空中で
25℃でP2O5によつて乾燥する。 収量：6.2ｇ（理論量の60％）、 分析： 水［フイシヤー（K.Fischer）による］ 7.6％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド
91.2％ ［α］D 25℃（乾燥物質に対する）＝69°（ｃ＝１，
H2Ｏ） HPLC（例１の条件参照）：面の％ 96 テトラゾリウムブルーとの反応は、還元性末端
が存在しないことを示す。 例 ３ 試薬： エチリデン−G7pNP 682.5mg（5.25mモル／
）を、塩化ナトリウム（52.5mモル／）並び
にアルファーグルコシダーゼ（42U／ml）を含有
する燐酸ナトリウム緩衝液100ml（105mモル／
）にとかし、PH7.10に調節した。 試験の最終濃度： 燐酸塩緩衝液100mモル／，NaCl 50mモ
ル／、基質5mモル／、アルファーグルコシ
ダーゼ40U／ml。 試験バツチ： 25°に加熱した試薬2.0mlに試薬0.1mlを添加し、
混合物を25℃に加熱した。予培養時間４分間（ラ
グ相）後に、吸光の増大をHg405nmでエツペン
ドルフ（Eppendorf）光度計で記憶した。毎分の
吸光の変化（ΔE／分）から、試料中のアミラー
ゼの活性を次式によつて計算した。 ΔE／分・Ｖ・1000・３／Ｅ・ｖ・ｄ＝ΔE／分・70
00［Ｕ／］ 前記式中ｖは使用した試料の容量を表し、Ｖは
使用した試薬及び試料の容量（全容量）を表し、
ｄはキユベツトの総厚を表す（一般に１cm）。 アルフアーアミラーゼの再発見： 活性の測定を、４℃及び25℃で保存した試薬で
一定の時間間隔でくり返し、次の値が得られた。
【表】
表中PNU572は人間の血清をベースとする対照
血清であるPrecinorm Ｕ，Charge572の略語で
ある。Precinorm Ｕの濃度及び酵素活性は正常
範囲であるか又は正常／病的の限界範囲である。 VKは次のようにして計算される変動係数を表
す（％）： 平均値×標準偏差×100／測定数(n)＝VK 従つて、3.2％、3.0％及び2.0％はそれぞれ人間
の血清１、人間の血清２及び対照血清の変動係数
である。 個々の値は、酵素活性のマニユアル測定に対す
る通常の変動幅である。 使用した人血清１及び２は正常なアミラーゼ活
性(1)及び高いアミラーゼ活性(2)を有する患者から
のものである。正常／病的の限界範囲のアミラー
ゼ活性を特徴とする対照血清PNU572との比較に
より、本願発明による測定が合理的な（即ち正し
い）数値を示すことが明らかである。つまり数値
が正常なアミラーゼ活性を有する患者の試料では
相応する対照血清よりも低くかつ高いアミラーゼ
活性を有する患者では相応する対照血清よりも高
い。
血清であるPrecinorm Ｕ，Charge572の略語で
ある。Precinorm Ｕの濃度及び酵素活性は正常
範囲であるか又は正常／病的の限界範囲である。 VKは次のようにして計算される変動係数を表
す（％）： 平均値×標準偏差×100／測定数(n)＝VK 従つて、3.2％、3.0％及び2.0％はそれぞれ人間
の血清１、人間の血清２及び対照血清の変動係数
である。 個々の値は、酵素活性のマニユアル測定に対す
る通常の変動幅である。 使用した人血清１及び２は正常なアミラーゼ活
性(1)及び高いアミラーゼ活性(2)を有する患者から
のものである。正常／病的の限界範囲のアミラー
ゼ活性を特徴とする対照血清PNU572との比較に
より、本願発明による測定が合理的な（即ち正し
い）数値を示すことが明らかである。つまり数値
が正常なアミラーゼ活性を有する患者の試料では
相応する対照血清よりも低くかつ高いアミラーゼ
活性を有する患者では相応する対照血清よりも高
い。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ α−グルコシダーゼの存在下に、一般式： ［式中Ｒ及びR1は一緒になつてメチレン橋を
形成し、この架橋基はメチル基又はフエニル基に
よつて置換されており、R2はグルコース単位２
〜７個を有するオリゴグルコシド基を表わし、Ｘ
は水素原子又は光学的に測定される基を表わす］
の化合物を試料に添加し、かつ該試料中のα−ア
ミラーゼの存在又は不存在もしくはその量を、測
定尺度としてのＸを測定することにより確定する
ことを特徴とするα−アミラーゼの測定法。 ２ Ｘがニトロフエニルである特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３ Ｘが３，４−ジニトロフエニルである特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ４ Ｘが水素である特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ５ Ｒ及びR1がメチル基により置換されたメチ
レン橋を表わしてエチリデンを形成する特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ６ Ｘがニトロフエニルである特許請求の範囲第
５項記載の方法。 ７ Ｒ及びR1がフエニル基により置換されたメ
チレン橋を表わしてベンジリデンを形成する特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ８ R2がグルコース単位３，４又は６個を含有
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９ R2がグルコース単位６個を含有するオリゴ
グルコシド基である特許請求の範囲第８項記載の
方法。 １０ R2がグルコース単位６個を含有するオリ
ゴグルコシド基であり、かつＲ及びR1がエチリ
デン基である特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ R2がグルコース単位６個を含有するオリ
ゴグルコシド基であり、かつＲ及びR1がベンジ
リデン基である特許請求の範囲第９項記載の方
法。 １２ 式の化合物が４，６−エチリデン−４−
ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドで
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３ 式の化合物が４，６−エチリデンマルト
ヘプタオシドである特許請求の範囲第１項記載の
方法。 １４ 一般式： ［式中Ｒ及びR1は一緒になつてメチレン橋を
形成し、この架橋基はメチル基又はフエニル基に
よつて置換されており、R2はグルコース単位２
〜７個を有するオリゴグルコシド基を表わし、Ｘ
は水素原子又は光学的に測定される基を表わす］
の化合物及びα−グルコシダーゼを含有するα−
アミラーゼ測定用試薬。 １５ Ｘがニトロフエニルである特許請求の範囲
第１４項記載の試薬。 １６ Ｘが３，４−ジニトロフエニルである特許
請求の範囲第１４項記載の試薬。 １７ Ｒ及びR1がメチル基により置換されたメ
チレン橋を表わしてエチリデンを形成する特許請
求の範囲第１４項記載の試薬。 １８ Ｒ及びR1がフエニル基により置換された
メチレン橋を表わしてベンジリデンを形成する特
許請求の範囲第１４項記載の試薬。 １９ R2がグルコース単位３，４又は６個を含
有する特許請求の範囲第１４項記載の試薬。 ２０ R2がグルコース単位６個を含有するオリ
ゴグルコシド基である特許請求の範囲第１９項記
載の試薬。 ２１ R2がグルコース単位６個を含有するオリ
ゴグルコシド基であり、かつＲ及びR1がエチリ
デン基である特許請求の範囲第２０項記載の試
薬。 ２２ R2がグルコース単位６個を含有するオリ
ゴグルコシド基であり、かつＲ及びR1がベンジ
リデン基である特許請求の範囲第２０項記載の試
薬。 ２３ 式の化合物が４，６−エチリデン−４−
ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドで
ある特許請求の範囲第１４項記載の試薬。 ２４ 式の化合物が４，６−エチリデンマルト
ヘプタオシドである特許請求の範囲第１４項記載
の試薬。
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| DD (2) | DD232512A5 (ja) |
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| ES (1) | ES8504211A1 (ja) |
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| JPS6183195A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-04-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを基質として用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 |
| DE3621271A1 (de) * | 1986-06-25 | 1988-01-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von alpha-amylase |
| JPS637797A (ja) * | 1986-06-27 | 1988-01-13 | Toyobo Co Ltd | α−アミラ−ゼの活性測定法 |
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| DE3743908A1 (de) * | 1987-12-23 | 1989-07-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue oligoglucoside |
| JPH0676431B2 (ja) * | 1988-06-17 | 1994-09-28 | 東洋紡績株式会社 | 糖エステル誘導体および加水分解酵素活性測定用試薬 |
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-
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