JPH0358996A - インドフェニル―β―マルトオリゴシド誘導体、このものを有効成分とするα―アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なインドフェニル−β−マルトオリゴシト
誘導体、このものを有効成分とするαアミラーゼ活性測
定用試薬及び該インドフェニルーβ−マルトオルゴシド
誘導体を用いて、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ
正確に測定する方法に関するものである。

従来の技術 従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象とするα
−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極めて重要であ
り、特に急性や慢性の肝炎、膵臓がん、流行性耳下腺炎
などの鑑別診断においては必須の測定項目となっている
。

このα−アミラーゼ活性の測定方法については、従来よ
り種々の方法、例えば（１）デンプンを基質とし、ヨー
ド−デンプン反応を利用して、有色の減退量を測定する
方法、（２）色素を結合させたデンプンを基質とし、加
水分解により遊離した色素を測定する色素法、（３）デ
ンプンを基質とし、デンプン溶液の還元力の増加を測定
する糖化法、（４）マルトテトラオース、マルトペンタ
オースなとの一連のマルトオリゴ糖を基質として利用し
、α−アミラーゼにより切断したのち、共役酵素系を作
用させ、生成するマルトース、グルコース又はグルコー
ス−６−リン酸を定量する方法、（５）置換又は非置換
のニトロフェニルマルトオリゴシト類を基質として利用
し、σ−アミラーゼにより切断したのち、共役酵素系を
作用させ、生成するニトロフェノール類を比色定量する
方法、（６）ハロゲン化フェニルマルトオリゴノド類を
基質として利用し、α−アミラーゼにより切断したのち
、共役酵素系を作用させ、生成するハロゲン化フェノル
をカプラー、例えば４−アミノアンチピリンと縮合させ
て比色定量する方法、（７）ｐ−アミノフェニルマルト
オリゴシトを基質として利用し、α−アミラーゼにより
切断したのち、共役酵素系を作用させ、生成するｐ−ア
ミノフェノールをカプラ、例えばｐ−キシレノールと縮
合させて比色定量する方法などが知られている。

しかしながら、（１）の方法においては、共存するタン
パク質がデンプンとヨードとの呈色反応を阻害する上、
反応時間が短く、再現性が悪いなどの欠点があるし、（
２）の方法は、基質としての活性が弱く、かつ基質が難
溶性であるため反応系が不均一であり、しかも煩雑な操
作が必要であって、自動分析装匠への適用が困難である
などの欠点を有しており、（３）の方法においては、試
料中に含まれるグルコースにより、α−アミラーゼ活性
値が高い値を示し、かつ煩雑な操作を必要とするなどの
欠点がある。さらに、前記（１）−（３）の方法は、共
通して基質に用いられるデンプンの品質により測定値に
バラツキが生じ、その上α−アミラーゼ反応を真に化学
量論的反応として測定できないなどの欠点を有している
。

これに対し、（４）の方法は、均一な基質を使用するた
めに、前記（１）〜（３）の欠点を補うことができるが
、あらかじめ試料中のマルトース、グルコースなどの糖
質を完全に消去することが必要である上、酵素反応で生
成するグルコースをグルコースオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、クロモゲン系を用いて測定する場合に、試料
中のグルコースの影響を補正する必要があるとともに、
多量のグルコースオキシダーゼを必要とし、さらに、試
料中に存在するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元
物質の影響を免れないなどの欠点がある。

一方、（５）の方法、特に２−クロロ−４−二トロフェ
ニル＝β−マルトペンタオシドを基質として使用する方
法は、現在膜も優れた方法として広く普及しているが、
生成するニトロフェノール類を４００〜４１０ｎｍの波
長域で比色定量する際、試料中に数多く混在する前記波
長の近傍に吸収を示す物質（例えばビリルビンは４５０
〜４９０ｎｍの波長域に吸収を有する）の影響を受けて
測定誤差を生じるおそれがあるという欠点を有している
。

そこで、この（５）の方法における欠点を改良するため
に、それぞれ５００ｎｍ及び６００ｎｍにおいて吸光度
を測定する（６）及び（７）の方法が開発されている。

しかしながら、（６）の方法においては、生成するハロ
ゲン化フェノールを４−アミノアンチピリンと酸化縮合
させ、生成する色素の吸光度を５００ｎｍで測定する場
合、この波長域に光学的な吸収を有する溶血血清中のヘ
モグロビンの影響を受けやすい上、この方法で尿を試料
として尿中のα−アミラーゼの測定を行うと、尿中にし
ばしば認められるフェノール類縁物質が４−アミノアン
チピリンと縮合して発色するため、正の誤差を与えると
いう問題がある。また、（７）の方法においては、生成
するｐ−アミノフェノールをｐ−キシレノールと酸化縮
合させる際、反応液をｐＨｌｏ以上の高アルカリ性とす
るため、酵素反応を停止させなければならず、したがっ
て、酵素活性の測定を連続的に行うレート法（Ｒａｔｅ
　Ａｓ５ａｙ）を採用しにくいという問題がある上、こ
の方法で体液中のアミラーセ活性を測定する場合、体液
中に存在する芳香族アミン類がｐ−キシレノールと縮合
して発色するため、正の誤差を与えるなどの欠点がある
。

本発明者らは、このような従来のび一アミラーゼ活性の
沖１定試薬における欠点を改良した新規な試薬として、
先にインドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体を提
案した（特開昭６４−４２４９７号公報）。

この試薬を用いれば試料に含まれる物質例えばグルコー
ス、マルトース、ビリルビン、ヘモグロビンなどの影響
を受けることなく、簡単に、かつ精度よくα−アミラー
ゼ活性の測定を行うことができるが、これを共役酵素と
共存させた場合にこれと反応して変化するため、両者を
混合したならば可及的速やかに使用しなければならない
という取扱い上の不便さがあった。

発明が解決しようとする課題 本発明は、このような従来のα−アミラーゼ活性の測定
試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服し、
σ−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定しうる
試薬として好適な新規化合物を提供すると共にこれを試
薬とした新規なα−アミラーゼの活性の測定方法を提供
することを目的としてなされたものである。

課題を解決するための手段 本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重
ねた結果、α−アミラーゼ活性測定用試薬として、特定
のインドフェニル−ｐ−マルトオリゴシト誘導体の環状
アセタールが極めて好適であり、これを用いてσ−アミ
ラーゼ活性を測定することにより、その目的を達成しう
ろことを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至っＩこ。

すなわち、本発明は、−船人 ％式％（１） （式中のＲは水素原子又はアシル基、Ｒ１及びＲ２は水
素原子又は炭化水素基であり、それらはたがいに結合し
て環を形成してもよく、Ｘｌ、ｘ２、ｘ３、Ｘ４、Ｘ、
及びＸ、は、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニトロ
基、シアノ基、アジド基、アシル基、スルホン酸基、ニ
トロソ基、スルホニル基、スルホキシル基、チオシアノ
基、インチオシアノ基、イソニトリル基、イミノ基、ア
ゾ基、ジアゾ基、アルキル基、アリル基又はアリール基
であり、ＸｌとＸ。

又はＸ、とｘ６、あるいはＸ、とＸ４及びＸ、とＸ、は
たがいに連結して縮合芳香環を形成してもよく、ｎは１
〜６の整数である） で表わされるインドフェニル−β−マルトオリゴシト誘
導体、及びこのものを有効成分とするσアミラーゼ活性
測定用試薬を提供するものである。

本発明に従えば、σ−アミラーゼ含有試料に、前記−船
人（Ｉ）で表わされる文献未載の新規化合物であるイン
ドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体と共にα−グ
ルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ及び所望に応じグル
コアミラーゼを添加し、酵素反応によって生成する青色
色素を５８５〜６５０ｎｍの波長で測定することにより
、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に求めるこ
とができる。

以下、本発明の詳細な説明する。

ｕＥ−船人（Ｉ）で表わされるインドフェニルーβ−マ
ルトオリゴシト誘導体に用いるマルトオリゴ糖としては
、マルトトリオースからマルトオクタオースまですべて
使用できる。代表的なものとしては、例えばマルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マ
ルトヘキサオース、マノし＋へフ゛タオースなと′が挙
げられるが、これらの中で特にマルトテトラオース、マ
ルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタ
オースが好適である。

一般式（Ｉ）で表わされるインドフェニル−β−マルト
オリゴシト誘導体としては、例えばインプロピリデン−
フェノールインドフェニル−β−マルトペンタオシド、
イソプロビリデンーフェノールイシト−３’−クロロフ
ェニル−β−マルトペンタオシド、インプロピリデン−
フェノールインド−３’、５’−ジクロロフェニル−β
−マルトヘプタオシド、インプロピリデン−テトラデカ
アセチル−（フェノールインド−３’−クロロフェニル
）−β−マルトペンタオシド、イソプロピリデン−テト
ラデカアセチル−（フェノールインド−３’、５’−ジ
クロロフェニル）−β−マルトペンタオシド、イソプロ
ピリデン−テトラデカアセチル−（２，６−シクロロフ
エノールインドフエニル）−β−マルトペンタオシド、
イソプロピリデン−テトラデカアセチル−（２，５−ジ
メチルフェノールインド−３′−クロロフェニル）−β
−マルトペンタオシド、イソフロビリデン−テトラデカ
アセチル（ｌ−ナノトルインド−３′−クロロフエニル
）−β−マルｉ・ペンタオシドなどのイソプロピリデン
−インドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体及びこ
れらに対応するシクロヘキシリデン−インドフェニル−
β−マルトオリゴシト誘導体、エチリデン−インドフェ
ニル−β−マルトオリゴシト誘導体、ベンジリデン−イ
ンドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体などが挙げ
られる。

前記−船人（１）で表わされるインドフェニル−β−マ
ルトオリゴシト誘導体は次に示す各種方法により製造す
ることができる。

Ａ法ニ一般式 により、−船人 ・・・　（Ｉｔ） （式中のｘｌ、ｘ２及びｎは前記と同じ意味をもつ）で
表わされるｐ−ニトロフェニル−β−マルトオリゴシト
誘導体に、−船人 ％式％（） （式中のＲ３はアシル基、Ｒ１、Ｒ７、ｘｌ、ｘ２及び
ｎは前記と同じ意味をもつ） で表わされるアルキリデン又はアリーリデンーｐアミノ
フェニルーアシル化β−マルトオリボンド誘導体を得る
。　次いで、これに、−船人（式中のＲ１及びＲ２は前
記と同じ意味をもつ）で表わされるカルボニル化合物又
はそのアセタールを反応させてアルキリデン又はアリ−
リチン−ｐ−ニトロフェニル−β−マルトオリゴシト誘
導体を得Ｉ；のち、アシル化し、次いで還元すること（
式中のＸｌ、Ｘい つ） Ｘ、及びＸ、は前記と同じ意味をも で表わされるキノン誘導体を反応させたのち、完全又は
部分脱アシル化することにより、前記−殺伐（１）で表
わされるインドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体
が得られる。

この方法においては、前記の完全又は部分脱アシル化を
、−殺伐（ＩＶ）で表わされるアルキリデン又はアリ−
リチン−ｐ−アミノフェニル−アシル化β−マルトオリ
ゴシト誘導体に施したのち、これに−殺伐（Ｖ）で表わ
されるキノン誘導体を反応させて、−殺伐（Ｉ）で表わ
されるインドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体を
得ることもできる。

前記−殺伐（ＴＶ）で表わされるアルキリデン又はアリ
−リチン−ｐ−アミノフェニル−アシル化β−マルトオ
リゴシト誘導体としては、例えばインプロピリデン−テ
トラデカアセチル−（４−アミノフェニル）−β−マル
トペンタオシド、インプロピリデン−テトラデカアセチ
ル−（４−アミノ−２−クロロフェニル）−β−マルト
ペンタオシド、イソプロピリデン−エイコサアセチル−
（４−アミノ−２，６−ジクロロフェニル）−β−マル
トヘプタオシド、イソプロピリデン−ウンデカアセチル
−（４−アミノ−２−ブロモフェニル）−β−マルトテ
トラオシド、イソプロピリデン−ヘプタデカアセチル−
（４−アミノ−２，６−ジフルオロフェニル）−β−マ
ルトヘキサオシド、インプロピリデン−オクタクロロア
セチル−（４−アミノ−２−ヨードフェニル）−β−マ
ルトトリオシトなどのイソプロピリデン誘導体及びこれ
らに対応するシクロへキシリデン誘導体、エチリデン誘
導体、ベンジリデン誘導体などが挙げられる。

まｔ；、−殺伐（ｖ）で表わされるキノン誘導体として
は、例え１ｆｐ−ベンゾキノン、２−クロロ−ｐ−ベン
ゾキノン、２．６−ジクロロ−ｐ−ベンゾキノン、２．
５−ジブロモ−ｐ−ベンゾキノン、２，３，５．６−テ
トラクロロ−ｐ−ベンゾキノン（クロラニル）、２．５
−　ジメチル−ｐ−ベンゾキノン、１．４−ナフトキノ
ン、アンスラキノンなどが挙げられる。

この製造方法において、−殺伐（ＩＩ）で表わされるｐ
−ニトロフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体に、−
殺伐（Ｉ［Ｉ）で表わされるカルボニル化合物又はその
アセタールを反応させる際の条件については特に制限は
ないが、通常ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シド、エチレングリコールジメチルエーテルなどの溶媒
中において、好ましくはＯ″Ｃないし溶媒の沸点、より
好ましくは４０〜１００℃の範囲の温度において反応が
行われる。

この際、触媒として、例えば硫酸、塩化水素、９−トル
エンスルホン酸、無水塩化亜鉛などを用いることができ
る。

このようにして得られたアルキリデン−ｐ−二トロフェ
ニル−β−マルトオリゴシト誘導体又はアリ−リチン−
ｐ−ニトロフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体はア
ンル化されるが、このアシル化剤としては、例えば酢酸
、モノクロロ酢酸、プロピオン酸、α−クロロプロピオ
ン酸、β−クロロプロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸な
どや、これらの酸無水物、酸クロリド、エステルなどの
反応性誘導体が用いられる。アシル化条件については特
に制限はなく、従来アシル化において慣用されている条
件を用いることができる。

このようにして得られたアルキリデン又はアリ−ＩＪ　
ｆンーｐ−ニトロフェニル−アシル化β−マルトオリゴ
シト誘導体は公知の方法、例えばラネニッケルを触媒に
用いる接触還元によって、殺伐（ＴＶ）で表わされるア
ルキリデン又はアリ−リチン−ｐ−アミノフェニル−ア
シル化β−マルトオリゴシト誘導体に導かれる。

この−殺伐（ＩＶ）で表わされるアルキリデン又はアリ
−リチン−ｐ−アミノフェニル−アシル化β−マルトオ
リゴシト誘導体と一般式（Ｖ）で表わされるキノン誘導
体との反応は、これらを通常モル比１：１０ないし１：
５０、好ましくは１：１５ないし１：２５の割合で用い
、中性有機溶媒中において、中性脱水剤及び触媒量の強
酸の存在下、通常１５〜２５℃の範囲の温度において、
０．５〜４時間程度保持することにより行われる。

この除用いる中性有機溶媒としては、例えばジエチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテ
ル類、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、トルエンなどの炭化水
素類、ジクロロメタン、りロロホルム、ジクロロエタン
、四塩化炭素などのハロゲン化炭化水素類、あるいはジ
メチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメ
チルホスホラミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げら
れる。これらの溶媒は１種用いてもよいし、２種以上を
組み合わせて用いてもよい。この溶媒の使用量は、通常
−殺伐（’Ｉ’）で表わされるキノン誘導体に対して、
ｌＯ〜１００重量倍、好ましくは４０〜６０重量倍の範
囲で選ばれる。

また、中性脱水剤としては、例えばモレキュラーシーブ
、アルミナ、シリカ、無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マ
グネシウムなどが挙げられる。これらの中性脱水剤は１
種用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよ
く、その使用量は、通常前記−殺伐（Ｖ）で表わされる
キノン誘導体に対して０．５〜５重量倍、好ましくは０
．８〜１．５重量倍の範囲で選ばれる。

一方、強酸としては、例えばトリフルオロ酢酸、トリク
ロロ酢１Ｌｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸
、発煙硫酸、塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素／エチ
ルエーテル、四塩化チタン、塩化第二鉄などが挙げられ
る。これらの強酸は１種用いてもよいし、２種以上を組
み合わせて用いてもよく、その使用量は、通常前記−殺
伐（Ｖ）で表わされるキノン誘導体に対して、０．０１
〜０．１倍モル当量、好ましくは０．０２〜０，０４倍
モル当量の範囲で選ばれる。

Ｂ法ニ一般式 ％式％（） （式中のＰｌ、Ｒ２、Ｒ１及びｎは前記と同じ意味をも
ち、Ｘはハロゲン原子である） で表わされるハロゲノ−α−マルトオリゴシト誘導体に
、−殺伐 （式中のＹは水素原子、アルカリ金属原子又は銀原子、
ｘ工ないしｘ６は前記と同じ意味をもつ）で表わされる
インドフェニル誘導体を、中性有機溶媒中において反応
させたのち、これを部分又は完全脱アシル化することに
より、前記−殺伐（Ｉ）で表わされるインドフェニル−
β−マルトオリゴシト誘導体が得られる。

前記−殺伐（ＶＩ）で表わされるハロゲノ−α−マルト
オリゴシト誘導体は、例えば該−殺伐（Ｖｌ）のＸがＲ
３であるアルキリデン又はアリーリデンーアシル化マル
トオリゴシト誘導体に三臭化リンなどを作用させること
により製造することができる。

−殺伐（ＶＩ）で表わされるハロゲノ−α−マルトオリ
ゴシト誘導体の具体例としては、インプロピリデン−テ
トラデカアセチル−α−マルトペンタオシルプロミド、
イソプロピリデン−エイコサアセチル−α−マルトへブ
タオシルブロミド、イソプロピリデン−ウンデカアセチ
ル−σ−マルトテトラオシルブロミド、インプロピリデ
ン−ヘプタデカアセチル−α−マルトヘキサオシルブロ
ミド、インプロピリデン−オクタクロロアセチル−α−
マルトトリオシルブロミドなどのプロミド類及びこれら
に対応するクロリド類やフルオリド類、さらにはこれら
のインプロピリデン誘導体に対応するシクロへキシリデ
ン誘導体やアルキリデン誘導体などを挙げることができ
る。

前記−殺伐（■）で表わされるインドフェノール誘導体
は、例えば所望の置換基を有するフェノールニ、所望の
置換基を有するＮ−クロロキノイミンを塩基の存在下で
反応させることにより製造することができる。このイン
ドフェノール誘導体の具体例としてはフェノールインド
フェノール、２−クロロフェノールインドフェノール、
フェノールインド−３７，５ｚ　−シクロロフエノーノ
呟３−ブロモフェノールインドフェノール、２．５−シ
メチル７工ノールインドフェノール、ｌ−ナフトールイ
ンドフェノールなど及びこれらのナトリウム塩、カリウ
ム塩、銀塩などが挙げられる。これらのインドフェノー
ル誘導体の使用量は、通常−殺伐（Ｖｌ）で表わされる
ハロゲノ−σ−マルトオリゴシト誘導体に対し、２〜ｌ
Ｏ倍モル光量、好ましくは３〜５倍モル当量の範囲で選
ばれる。

また、この際用いられる中性有機溶媒としては、例えば
アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、アセト
ニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、ｎ−
ヘキサンなどの炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、あ
るいはジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、
ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホラミドなど
が挙げられるが、これらの中で特にアセトニトリル及び
ベンゼンが好適である。これらの中性有機溶媒は１種用
いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよく、その
使用量は、通常−殺伐（Ｖｌ）で表わされるハロゲノ−
α−マルトオリゴシト誘導体に対し、５〜５０重量倍、
好ましくは１０〜２０重量倍の範囲で選ばれる。

一般式（Ｖｌ）で表わされる化合物と（■）で表わされ
る化合物との反応は触媒の存在下に行うことが好ましく
、この触媒としては、例えば酸化銀、過塩素酸塩銀、硝
酸銀、炭酸銀などの銀化合物、酸化水銀、シアン化水銀
などの水銀化合物、炭酸カドミウムなどのカドミウム化
合物、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどの第３
級アミン類などが挙げられるが、これらの中で特に酸化
銀が好ましい。これらの触媒は１種用いてもよいし、２
種以上を組み合わせて用いてもよく、その使用量は、通
常前記−殺伐（ＶＴ）で表わされる化合物の２〜ｌＯ倍
モル当量、好ましくは３〜５倍モル当量の範囲で選ばれ
る。

この反応における反応温度及び反応時間は一般式（Ｖｌ
）及び（■）で表わされる化合物や触媒の種類などによ
り異なり、−概に定めることができないが、通常３０〜
５０℃の範囲の温度において、ｌＯ〜２０時間程度保持
することにより、反応が行われる。

このようにして得られたアルキリデン又はアリーリデン
ーイノドフェニルーアシル化β−マルトオリゴシト誘導
体を、例えば炭酸カリウムなどの脱アシル化剤を作用さ
せて部分又は完全脱アシル化することにより、前記−殺
伐（Ｉ）で表わされるインドアエニルーβ−マルトオリ
ゴシト誘導体が得られる。

Ｃ法ニ一般式 ス７エラーゼを作用させて、−殺伐 ・・・　（Ｉり （式中のｘｌないしｘ６及びｎは前記と同じ意味をもつ
） で表わされるインドフェニル−β−マルトオリゴシト誘
導体を得たのち、これに、前記（Ａ、）法と同様にして
、−殺伐 ％式％（） （式中のｘｌないしＸ６は前記と同じ意味をもつ）で表
わされるインドフェニル−β−グルコシド誘導体に、シ
クロデキストリン、アミロース、デンプンなどを加え、
酵素シクロデキストリントラン（式中のＲ１及びＲ２は
前記と同じ意味をもつ）で表わされるカルボニル化合物
又はそのアセタールを反応させて、アルキリデン又はア
リーリデンーマルトオリゴシト誘導体を得、次いで所望
により部分アシル化することにより、前記−殺伐（１）
で表わされるインドフェニル−β−マＪレトオリゴシド
誘導体が得られる。

前記−殺伐（■）で表わされるインドフェニル−β−グ
リコシド誘導体は、インドフェニル−β−オリゴシド類
の製法に準じて、４−アミノフェニル−β−グルコシド
類又はテトラアセチル−σ−〇−グルコシルハライド類
から製造することができる。該−殺伐（■）で表わされ
る化合物の具体例としては、フェノールインド−３’　
、５’−ジクロロフェニル−β−Ｄ−グルコシド、フェ
ノールインド−３’−クロロフェニル−β−Ｄ−グルコ
シド、２．５−ジクロロフェノールインドフェニル−Ｄ
−グルコシド、フェノールインｔ’−３’−フルオロフ
ェニル−β−Ｄ−グルコシドなどが挙げられる。

この反応は、水溶液中で緩衝剤の存在下で行われる。前
記−殺伐（■）で表わされる化合物の濃度は、通常０．
０１−１９／ｍα、好ましくは０．０２　〜０．２９／
ｍＱの範囲で選ばれ、一方シクロデキストリン、アミロ
ース、デンプンなどの濃度は、通常１〜２００ｍｇ／ｍ
Ｑ、好ましくは１００−２００ｍ９／　ｍ（ｌの範囲で
選ばれる。また、シクロデキストリングルコシルトラン
スフェラーゼの起源については特に制限はないが、例え
ばバチルス・マセランス、バチルス・メガテリウム、バ
チルス・サーキュランスなどから得られたものが好まし
い。その濃度は、通常０．３〜３単位／　ｍＱｓ好まし
くは０．５　〜１．５単位／ｍＱの範囲で選ばれる。

該緩衝剤としては、例えばβ−グリセロリン酸塩緩衝剤
、酢酸塩緩衝剤などが好ましく用いられる。その濃度は
通常０．０１〜０．０２Ｍ、好ましくは０、０１−０．
０８Ｍの範囲で選ばれ、反応系のｐＨは通常４、９〜６
．０１好ましくは５．２〜５，８の範囲に調整される。

反応温度は、原料の種類や濃度によって異なるが、一般
に２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０°Ｃの範囲で選
ばれ、反応時間は通常３〜２００分程度で十分である。

この酵素反応において、シクロデキストリンを用いた場
合には、インドフェニル−β−マルトヘプタオシド誘導
体が主生成物として生成するが、その他のマルトオリゴ
シト類も副生ずる。また、デンプン又はアミロースを用
いた場合には、各種マルトオリゴシト誘導体が生成する
ので、活性炭、ゲルクロマトグラフィー、有機溶剤など
により、所望のマルトオリゴシト誘導体を得ることがで
きる。

このようにして得られた前記−殺伐（Ｉ）で表わされる
インドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体はα−ア
ミラーゼ活性の測定に、極めて有用であり、このインド
フェニル−β−マルトオリゴシト誘導体を有効成分とす
るβ−アミラーゼ活性測定用試薬、及びこの試薬を用い
てα−アミラーゼ活性を測定する方法を提供することも
本発明の目的の１つである。

ａ−アミラーゼ活性を測定するための有利な系としては
、例えば−殺伐（１）で表わされるインドフェニル−β
ーマルトオリゴシト誘導体ｌ〜２０ｍＭ及び緩衝剤２〜
ｌｏＯｍＭを含有し、かつ共役酵素としてα−グルコシ
ダーゼ１５〜１５０単位／ｍＱとβ−グルコシダーゼ５
〜５０単位／ｍＱとを含有するｐＨ４〜１０の系が挙げ
られる。この系に用いられる緩衝剤としては、例えばリ
ン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−（ヒドロキシメチル
）−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグ
ルタル酸塩などが挙げられる。

ａ−グルコシダーゼは動物、植物、微生物など、いかな
る起源のものを用いてもよいが、特に酵母起源のものが
基質特異性の点から好ましい。β−グルコシダーゼもい
かなる起源のものを用いてもよく、例えばアーモンドの
種子から得たものが使用できる。また必要に応じて黒色
こうじ苗などに由来するグルコアミラーゼ、溶解補助剤
、安定化剤としてグリセリン、牛血清アルブミン、α−
又はβ−シクロデキストリン、トリトンｘｔｏｏなどを
加えてもよい。ざらにα−アミラーゼ活性剤としてＮａ
Ｃ１，　ＣａＣ１２、ＣａＣ１２　・２Ｈ２０などの形
で使用されるＣｔ−イオン、Ｃａ　１　＋イオンなどを
加えてもよい。

本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した形で用いても
よいし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙など
に含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬を
用いることにより、各種の試料に含有されるα−アミラ
ーゼの活性を、簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定
することができる。

次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定方法の好適な
１例について説明すると、まず、α−アミラーゼを含む
試料に、共役酵素としてのα−グルコシダーゼを１５ｍ
１５０単位／ｍα、好ましくは１５ｍ５０単位／ｍ（１
，β−グルコシダーゼを５〜５０単位／ｒｎＱ、好まし
くは５〜１５単位／ｍ（ｌになるように加え、同時又は
順次に前記−殺伐（１）で表わされるインドフェニル−
β−マルトオリゴシト誘導体１〜２ＱｍＭ、好ましくは
２〜６ｍＭ及び緩衝剤を添加したのち、温度２５〜５０
°Ｃ！、ｐ）１４〜ｌＯの条件にて２分間以上、好まし
くは３〜６０分間酵素反応させ、次いで生成する青色色
素（インドフェノール誘導体）を５８５〜６５０ｎｍ１
好ましくは６００〜６２０ｎｍの吸収波長で、連続的若
しくは断続的に吸光度値を測定し、あらかじめ測定した
α−アミラーゼ原品の吸光度値と対比させて試料中のび
一アミラーゼ活性を算出する。

本発明に用いられるα−アミラーゼ含有試料については
、α−アミラーゼを含有するものであればよく、特に制
限はないが、具体的には微生物の培養液、植物の抽出液
、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液などを
用いることができる。

また、緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸
塩、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げ
られる。

発明の効果 本発明のインドフェニル−β−マルトオリゴシト誘導体
は新規な化合物であって、α−アミラーゼ活性測定用試
薬として極めて有用であり、このものを用いることによ
り、試料に含まれるグルコース、マルトース、ビリルビ
ン、ヘモグロビンなどの影響を受けることなく、σ−ア
ミラーゼ活性を自動分析法、用手法などにより、精度よ
く、容易に測定することができる上に、共役酵素を共存
させても長期間にわたって安定状態を維持しうるという
利点がある。

実施例 次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらの例によってなんら限定されるものでは
ない。

実施例１　イソプロピリデン−フェノールインドフェニ
ル−β−Ｄ−マルトペンタオシ ドの製造 （１）　　ｐ−二トロフェニルーβ−Ｄ−マルトペンタ
オシド５．００９　（５，０８ｍＭ）を無水ジメチルホ
ルムアミド７５ｍαに溶解し、アセトンジメチルアセタ
ール６、１０ｍ１２（４９，９ｍＭ）及びトシル酸０．
７７２ｇ（４，４９ｍＭ）を加え、５０°Ｃで１時間、
かきまぜながら反応させる。次いでこの反応液を０．２
４Ｍ！炭酸ナトリウム水７５ｍ１２中へ、氷冷下かきま
ぜながらゆっくりと滴下する。この混合液をジクロロメ
タン２００ｍ＋２で２回洗浄したのち、ジメチルホルム
アミドと水を留去する。この残金をオクタデシル化学結
合型シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し
、アセトニトリル−水混液（容量比３　：　１７）で溶
出した目的区分を濃縮し、メタノールから再結晶すると
、イソプロピリデン−ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシドが２．７１ｇ（２，７４ｍＭ、　５３
．９％）得られる。

融点（’Ｏ）　：　１６４．０〜１６６．０（２）（１
）で得られたインプロピリデン−ｐ−二トロフェニルー
β−Ｄ−マルトペンタオシド１．７５９（１，７７＋ｎ
Ｍ）をピリジン４５ｒｎＱに溶解し、無水酢酸９０　ｍ
１２（０，９５３Ｍ）を加え、室温で２日間反応させる
。次いで反応液のピリジン、無水酢酸、酢酸を留去した
のち、残金をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによ
り精製し、酢酸エチル−トルエン混液（容量比２：ｌ）
で溶出した目的区分を濃縮し、メタノールから再結晶と
すると、インプロピリデン−ｐ−ニトロフェニル−テト
ラデカアセチル−β−Ｄ−マルトペンタオシドが２．２
６ｇ（１，４３ｍＭ。

８０．８％）得られる。

融点（’Ｏ）　＋　１２８．０〜１３１．０（３）（２
）で得られたイソプロピリデン−ｐ−二トロフェニルー
テトラデカアセチルーβ−Ｄ−マルトペンタオシド２．
７７ｇ（１，７６ｍＭ）を１．４−ジオキサン５５ｍＱ
に溶解し、５％パラジウム−カーボン２８２ｍｇを加え
、常圧下に水素ガスを導入しながら室温で２４時間、強
くかきまぜながら反応させる。

次いでパラジウム−カーボンをろ別し、ろ液の１．４−
ジオキサンを留去したのち、残金をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル−トルエン
混液（容量比５：３）で溶出した目的区分を濃縮し、メ
タノールから再結晶とすると、イソプロピリデン−ｐ−
アミノフェニル−テトラデカアセチル−β−Ｄ−マルト
ペンタオシドが２．５５９　　（１，６５ｍＭ、　９３
．８％）得られる。

融点（℃）　：　１３０．０〜１３４．０（４）　ｐ−
ベンゾキノン５４１ｍ９　（５，ＯｌｍＭ）を１，４−
ジオキサン１７＋ｎＱに溶解し、トリフルオロ酢酸９２
．６μＱ（１，２０ｍＭ）　、モレキュラーシーブ（４
Ａ）２．００ｍｇを加え、混和しておく。これに（３）
で得られたインプロピリデン−ｐ−アミノフェニル−テ
トラデカアセチル−β−Ｄ−マルトペンタオシド１．５
８９　（１，０２ｍＭ）を加え、室温下１時間かきまぜ
ながら反応させる。次いでジクロロメタン２５ｍＱを加
え、その混液を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム−０，８５Ｍ
食塩水１５０＋ｎｆ２中へ、水冷下かきまぜながらゆっ
くりと滴下する。水層を除去し、有機層を飽和食塩水１
００ｍＱで２回洗浄する。無水硫酸ナトリウム１０９を
加えて有機層の水分を除いたのち、硫酸ナトリウムをろ
別する。ろ液の１，４−ジオキサンとジクロロメタンを
留去し、残金をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
より精製し、ジクロロメタン−メタノール混液（容量比
９８：２）で溶出した目的区分を濃縮し、メタノールか
ら再結晶とすると、インプロピリデン−フェノールイン
ドフェニル−テトラデカアセチル−β−Ｄ−マルトペン
タオシドが１．２３ｇ（０，７３８ｍＭ、　７３．５％
）得られる。

融点（’Ｏ）　：　１３４．０〜１３７．０紫外部・可
視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ、、、］　　（ｎｍ）　＝２６１　（
ε−１，９Ｘｌｏつ、　２９１　（ε−１，２ＸｌＯ’
）　。

４７１（ε−５，９Ｘ　１０’） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）　　：２９６０、１７
５４．１６４ｇ、　１５００．１３７２．１２４０゜１
０５０、１０３８．９５０．９０２．８７８．８５４核
磁気共鳴スペクトル（２００Ｍ）ｌｚ）　ｐｐｍ　：　
（ＣＤＣ１３）１．３６（３Ｈ，ｓ）、１．４４（３Ｈ
，Ｓ）、　１．８９〜２．３０（４２Ｈ，ｍ）、　３．
６５〜５．４６（３５Ｈ，ｍ）　。

６．５４　（Ｌ　Ｈ，ｄｄ、　Ｊ　−１０，３Ｈｚ、　
２．２Ｈｚ）　。

６．６８（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ−１０，０Ｈｚ、　２．２
＝Ｈｚ）。

６．８９（２８，ｄ、　Ｊ−８，６Ｈｚ）　、　７．０
５（２Ｈ，ｄ。

Ｊ−８，６Ｈｚ）　、　７．１５　（Ｉ　Ｈ，ｄｄ、　
Ｊ−１０，３Ｈｚ、　２．２）１ｚ）　、　７．２９（
ｌＨ，ｄｄ、　Ｊ＝１０．０Ｈｚ、　２．２Ｈｚ） （５）（４）で得られたイソプロピリデン−フェノール
インドフェニル−テトラデカアセチル−Ｄ−マルトペン
タオシド１．０６９（０．６３６ｍＩＪ）を無水メタノ
ール９５＋＋＋Ｉ２に溶解し、無水炭酸カリウム５２．
７１＋９（０．３８２ｍＭ）を加え、室温で４時間かき
まぜながら反応させる。次いで反応液に乾燥アンノ（−
ライトＩＲＣ−５Ｑを反応液の液性が中性になるまで加
えたのち、アンバーライトＩＲＣ−５０をろ別し、ろ液
のメタノールを留去する。この残金をゲル（東洋曹達社
製ＨＷ　−　４０）カラムクロマトグラフィーにより精
製し、エタノール−水混液（容量比１：９）で溶出した
目的区分を濃縮し、メタノールから再結晶とすると、イ
ンプロピリデン−フェノールインドフェニル−β−Ｄ−
マルトペンタオシドが３８３．ｌｕ　（０．３６５ｎ＋
Ｍ，　５７．４％）得られる。

融点（’Ｏ）　：　１９５．０〜２０５．０　（分解）
紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ．．．］　（ｎｍ）−２５８　（ε＝
　１．８Ｘ　１０’）　、　３０３　（　ｔ　＝　ｔ．
ｔｘ　ｔｏつ。

４７７（ε−６．２Ｘ　１０つ 赤外吸収スペクトル（ｃ＋＋＋−り　：３４１５、　２
９３５，　１６４２，　１６１２，　１５９６，　１２
３８。

１１５４、　１０６６、　１０２２．　８４８核磁気共
鳴スペクトル（２００）ＪＨｚ）ｐｐｍ　：　（ＣＤ３
０Ｄ）１、３６（３Ｈ，　ｓ）、　１．４９（３Ｈ，　
　ｓ）、　３．３５＝４．ｌＯ（ｍ）、　４．６８〜５
．１１（ｍ）、　５．１５（４Ｈ，　ｍ）、　５．２３
（ＩＨ，　ｄ，　ｊ−４．９）１ｚ）。

６．５８　（Ｉ　Ｈ，ｄｄ、　　Ｊ＝　ｌＯ，３Ｈｚ、
　２．４Ｈｚ）。

６．６８　（Ｉ　Ｈ，ｄｄ、　　Ｊ−１０，０Ｈｚ、　
２．１Ｈｚ）。

６．９６　（２Ｈ，ｄ、　　Ｊ−８，８Ｈｚ）　　、　
７．０５（２Ｈ。

ｄ、　　Ｊ−８−８Ｈｚ）、７．２７（ＩＨ，ｄｄ、　
　Ｊ＝１０．３Ｈｚ、　　２．１Ｈｚ）　　、　　７．
３３（ＩＨ，ｄｄ、　　Ｊ＝１０．０Ｈｚ、　　２．４
Ｈｚ） 実施例２　α−アミラーゼ活性の測定法Ａ　（ｅｎｄｏ
−ｐｏｉｎｔ法） （１）　　基質液の調製 イソプロピリデン−フェノールインドフェニル−β−Ｄ
−マルトペンタオシド１．５ｍＭをとり、１０＋ｎＭβ
−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ−６，９）を加えて全量
を２５０ｍ＋２として基質液とする。

（２）共役酵素液の調製 ０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭβ−グリセ
ロリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．９）に市販の酵母由来のα
−グルコシダーゼ、市販のアーモンド由来のβ−グルコ
シダーゼ及び市販の黒色麹菌由来のグルコアミラーゼを
それぞれ６００Ｕ、３００Ｕ及び１００ＯＵ加えて全量
をｌＯｍＱとして共役酵素液とする。

（３）試薬液の調製 基質液及び共役酵素液をそれぞれ容量比ｌ：２で良く混
合し、試薬液とする。

（４）標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒト由来のα−アミラーゼを０．０５％ウシ血清
アルブミン含有１（１ｍｌＪβ−グリ七ロリン酸緩衝液
（ｐＨ＝６．９）に加え、０．７５．１５０．３００．
６００．１２００Ｕ／４の濃度に溶解して標品α−アミ
ラーゼ液とする。

（５）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とする。固体の場合は試料５００ｍｇを正確に秤
量し、０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭβ−
グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ−６，９）を加えて全量を
５ｍＱとして試料液とする。

（６）検量線の作成 試薬液１．５ｍ１２を３７°Ｃで５分間加温したのち、
標品α−アミラーゼ液２５μαを加えてかきまぜ、さら
に１０分間３７℃で加温する。これに２００ｍＭ炭酸ナ
トリウム水溶液２ｍＱを加え、ただちに６１０ｎｍにお
ける吸光度を測定する。この際、標品ａ−アミラーゼ液
活性と吸光度の関係より検量線を作成する。ファルマシ
アダイアグノス社製標品ａ　−アミラーゼ活性測定用管
理血清（１２００Ｕ／ｆｆ　）を使用した場合、検量線
の式はＵ−（２，２３・八−０，７７６）　ＸＩＯ”　
［Ｕ　、酵素活性Ｕ／（２、Ａ；吸光度］となる。その
グラフを第１図に示す。

（７）試料液中のα−アミラーゼ活性の測定試薬液１．
５ｉを３７℃で５分間加温したのち、試料液２５μａを
加えてかきまぜ、さらに１０分間３７℃で加温する。こ
れに２００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液２ｍＱを加え、た
だちに６１０ｎｍにおける吸光度を測定する。この測定
値と（６）で作成した検量線から算出して試料液中のα
−アミラーゼ活性の測定を行うことができる。なお、試
料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（０〜１２０
０Ｕ／１２　）を越えた場合は０，０５％ウシ血清アル
ブミン含有１０ｍＭβ−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝
６−９）を用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再
測定を行う。

実施例３　α−アミラーゼ活性の測定法Ｂ（ｒａｔｅ−
ａｓｓａｙ法） （１）　　基質液の調製 インプロピリデン−フェノールインド−３′−クロロフ
ェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド１．５ｍＭをとり
、１０ｍＭβ−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ−６，９）
を加えて全量を２５０ｍ１２として基質液とする。

（２）共役酵素液の調製 ０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭβ−グリセ
ロリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．９）に市販の酵母由来のび
一グルコシダーゼ、市販のアーモンド由来のび一グルコ
シダーゼ及び市販の黒色麹菌由来のグルコアミラーゼを
それぞれ６００Ｕ、　３００Ｕ及び１００ＯＵ加えて全
量をｌｏｗｇとして共役酵素液とする。

（３）試薬液の調製 基質液及び共役酵素液をそれぞれ容量比１：２で良く混
合し、試薬液とする。

（４）標品σ−アミラーゼ液の調製 市販のヒト由来のα−アミラーゼを０．０５％ウシ血清
アルブミン含有１０ｍＭβ−グリセロリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝６．９）に加え、０．７５．１５０．３００．６０
０、１２００Ｕ／Ｑの濃度に溶解して標品α−アミラー
ゼ液とする。

（５）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とする。固体の場合は試料５００ｍｇを正確に秤
量し、０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭβ−
グリセロリン酸緩衝液（、）Ｈ−６，９）を加えて全量
を５ｍＱとして試料液とする。

（６）検量線の作成 試薬液３．ＯｍＱを３７°Ｃで５分間加温したのち、標
品α−アミラーゼ液５０μαを加えてかきまぜ、３７℃
で５分間加温後からの２分間の６１０ｎｍにおける吸光
度の変化量を測定する。この際、標品α−アミラーゼ液
活性と吸光度の変化量関係より検量線を作成する。ファ
ルマシアダイアグノス社製標品α−アミラーゼ活性測定
用管理血清（１２００Ｕ／Ｑ）を使用した場合、検量線
の式はＵ　−３，３８・ΔＡＸＩＯＳ［ｔに酵素活性Ｕ
／Ｑ　、　ＡＡ　；吸光度の変化量］となる。そのグラ
フを第２図に示す。

（７）試料液中のａ−アミラーゼ活性の測定試薬液３．
ＯｍＱを３７°Ｃで５分間加温したのち、試料液５０μ
Ｑを加えてかきまぜ、３７°Ｃで５分間加温後からの２
分間の６１０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定する。

この測定値と（６）で作成した検量線から算出して試料
液中のα−アミラーゼ活性の測定を行うことができる。

なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（０
〜１２００Ｕ／１２）を越えＩ；場合は帆０５％ウシ血
清アルブミン含有１０ｍＭβ−グリセロリン酸緩衝液（
ｐＨ−６，９）を用いて相当する倍数の希釈を行ったの
ち、再測定を行う。

実施例４　測定試薬 （１）　　試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することにより
試薬Ａを調製した。

成　　　　分　　　　　　　　　　濃　度イソプロピリ
デン＝ ７エノールインドー ３′−クロロフェニ ルーβ−Ｄ−マルト ペンタオシド ２．９ｍＭ グルコアミラーゼ　　　　　　　７０Ｕ／ｍασ−グル
コシダーゼ　　　　　　４０Ｕ／ｍＱβ−グルコシダー
ゼ　　　　　　２０Ｕ／ｍＱβ−グリルセロリン 酸緩新液（ｐＨ＝　６．９）　　　　　　　　１０ｍＭ
ウシ血清アルブミン　　　　　　０．０５％精製水に以
下の成分を以下の濃度で溶解することにより試薬Ｂを調
製した。

成　　　　分　　　　　　　　　　濃　度β−グリ七ロ
リン酸緩 新液（ｐＨ＝　６−９）　　　　　　　　　１０ｍＭウ
シ血清アルブミン　　　　　　０．０５％（２）測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とする。固体
の場合は試料５００ｍｇを正確に秤量し、試薬Ｂを加え
て全量を５ｍＱとして試料液とする。次いで試薬Ａ３．
ＯｍＱを３７℃で５分間加温したのち、試料液５０μＱ
を加えてかきまぜ、３７°Ｃで５分間加温後からの２分
間の６１０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定する。こ
の吸光度の変化量とあらかじめ作成した検量線から算出
して試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行うことが
できる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用
範囲（０〜１２００Ｕ／Ｑ　）を越えた場合は試薬Ｂを
用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行う
。

実施例５ 当該物質が測定系内で安定に存在することを実証するた
めに、非還元末端非修飾体を対照として下記の方法に従
って、共役酵素液との反応を行った。

（１）　　基質液Ａの調製 インプロピリデン−フェノールインドフェニル−β−Ｄ
−マルトペンタオシドＯ，１５ｍＭをとり、１０ｍＭβ
−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．９）を加えて全量
を２５ｗＱとし基質液Ａとする。

（２）基質液Ｂの調製 フェノールインドフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシ
ド０．１５＋ｎＭをとり、１０ｍＭβ−グリセロリン酸
緩衝液（ｐｌ（−６，９）を加えて全量を２５ｍαとし
て基質液Ｂとする。

（３）共役酵素液の調製 ０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭβ−グリセ
ロリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．９）に市販の酵母由来のα
−グルコシダーゼ、市販のアーモンド由来のβ−グルフ
シダーゼ及び市販の黒色麹菌由来のグルコアミラーゼを
それぞれ６００Ｕ、　３００Ｕ及び１００ＯＵ加えて全
量を１０ｍＩ２として共役酵素液とする。

（４）共役酵素反応 基質液、共役酵素液を３７℃で５分間加温したのち、基
質液Ａ及びＢをそれぞれ共役酵素液と容量比ｌ二２で良
く混合し、１０分間ごとに１．５ｍ４を採取し、５０１
炭酸ナトリウム水溶液を加えて、１００ｍ１２にフィル
アップし、ただちに６１０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。また、共役酵素液の代りに精製水を加えて同様の反
応を行った。結果を次表に示す。

この表から明らかなように、当該物質は共役酵素と反応
することなく、測定系内で安定に存在する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２におけるα−アミラーゼ活性と生成す
る青色色素の波長６１０ｎｍにおける吸光度の関係を示
すグラフ、第２図は実施例３におけるα−アミラーゼ活
性と生成する青色色素の波長６１０ｎｍにおける吸光度
の変化量の関係を示すグラフであって、図中の直線はそ
れぞれ検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲは水素原子又はアシル基、Ｒ＿１及びＲ＿２
   は水素原子又は炭化水素基であり、それらはたがいに結
   合して環を形成してもよく、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、
   Ｘ＿４、Ｘ＿５及びＸ＿６は、それぞれ水素原子、ハロ
   ゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジド基、アシル基、
   スルホン酸基、ニトロソ基、スルホニル基、スルホキシ
   ル基、チオシアノ基、イソチオシアノ基、イソニトリル
   基、イミノ基、アゾ基、ジアゾ基、アルキル基、アリル
   基又はアリール基であり、Ｘ＿３とＸ＿４又はＸ＿５と
   Ｘ＿６、あるいはＸ＿３とＸ＿４及びＸ＿５とＸ＿６は
   たがいに結合して縮合芳香環を形成してもよく、ｎは１
   〜６の整数である） で表わされるインドフェニル−β−マルトオリゴシド誘
   導体。 ２　請求項１記載のインドフェニル−β−マルトオリゴ
   シド誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用
   試薬。 ３　α−アミラーゼ含有試料に、請求項１記載のインド
   フェニル−β−マルトオリゴシド誘導体とα−グルコシ
   ダーゼ、β−グルコシダーゼ及び所望に応じグルコアミ
   ラーゼを添加し、酵素反応によって生成する青色色素を
   ５８５〜６５０ｎｍの波長で測定することを特徴とする
   、α−アミラーゼ活性の測定方法。