JPS60105494A - 不安定な酵素及び助酵素を含む生化学的診断測定に使用される組成物を安定化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的には、＃累と助酢索の安定化と安定化の
方法のぞシる新しく、かつ有ｊ’ＣＩな改良にかかるも
のである。更に詳しくは、単一の水溶性有４役溶媒中で
、不安定な酵素と助醪累を安定化するものである。

現在、商業ベースで行なわれている酵素又は助酪索の反
応油力を安定化させる方法は、主とトリックスに酵素等
を固定化するものとソリッドマトリックス中にｈ￥索の
化学構造をｌ＋’＋］定化フるものである。これらの方
法は、実際的でも望ましいものでもないし、コストが高
くつく軍兵合本ある。メーカーは水分を除去したり、不
完全な製品を供給せざるを１４ないのが晩秋であり。

希釈中の品質１管地工程の部分を放棄したり、決定的な
薬品の使用を放棄している。製本用では。

包装、試薬ロス、凍結乾燥及び乾燥混合に高いコストを
かけざるを得ないし、ＪＡ品の有効性は玄 包装様式とサイズにより更に制約される。

更に、製品の均一を良くすることは困難である。このこ
とは大抵の商業ベースの凍結乾燥の標準血清のびん間の
酵素成分の許容度は平均で±１０％であると配録されて
いることからも分る。

従って、単一の容器の中に安定化した助酵素及び、又は
酵素が液体組成を供給することが。

本発明のオーの目的である。

酵素と助＃累の安定化が相尚の期間経過後もその酵素活
性に影舎を与えないような、水溶性有機浴ａｄ、　’７
用いたタイプの不安定な酵素及び助酵素組成物を供給す
るのが１本発明のオニの目的である。

その他の不安定な助＃素又はその外、他の不安定酵素が
共存しても、不安定な酵素及び、又は助酔索を安定化で
きる方法を供給し、かつその組成物のイ♀存性が優れて
いるということが。

本発明の次の目的であり、崩著なところである。

本発明に従って不安定な酵素と助酵素を処理すると、そ
の結果、酵素又は助酵素の反応性や光学的吸収能力に影
響を与えることなく長期間安定となる。安定な液体状の
＃累と助−素試楽を提供することは境在、他の系統的分
類法と同様にＮＡＤ／ＮＡＤＨの一緒になった系統的分
類法の比色適応能力を高める。これは主にその成分の分
離が容易にできるからである。安定な液体試楽は・Ｎ　
Ａ　Ｄ　Ｈと他の助酵素の消費が測定の基質であり、カ
ラー試薬がＮ　Ａ　Ｄ　Ｈとその主反応から分４せねば
ならないような時には特に有利でおる。紫外線モードで
は、准体系は。

凍結乾燥又は乾燥媒体の調整品とくらべて使用の柔軟性
があるだけでなく、薬の均一性と包装性に潰れている。

以下に述べるような酵素と助障素の安定性を与えるよう
計画されている准謀では、一つ又はそれ以上の助ｔｗ水
がその媒ガｐの中で、安定化できるというように２全く
特異な系をとるものである。この他一つ又はそれ以上の
酵素がその液体媒地で安定化される。史に助酵素も階累
も単−容器中で、同じＩＰｌ媒地で安定化される。

／Ｖになるように俗ｍするのがよい。その接水にとかし
たゼラチンをゼラチンが全部溶けるように約３０’（：
壕で加熱する。ある場合には、殺菌剤としてだけでなく
、安定剤としても輸くアジド化合物を用いてもよい。そ
の後、この溶液を景温即ち、４’Ｊ　２０℃に冷やすこ
とが必要である。

一つのケースとして、助醇素ニコチンア建ドーアグニン
　ジヌクレオタイド（Ｎ　Ａ　１）　）を。

ｐｆ（のｌ整のためにトリス（ハイドロキシメチル）ア
ミノメタンのようなａ！＠削と共に、この溶液に加える
。この場合、　ｐｋ４　は、望ましいｐＨは、７．５で
あるが、約６．０から約８．５の間で／Ａ整する。ＪＬ
゛、Ｉ醸累を添加した後で、グリセロールのようなポリ
オールをＦＪ３０％Ｖ／Ｖになるように加える、ポリオ
ールを加えた優に。

ｐＨを再び約７．５になるよう調整する。

＆ 本発明によると、一つ以上の助酵素が、上記の溶媒中で
安定化される。この場合助酵素の他のものはＮＡＤの添
加前又は後でも加えることができる６例えば１本発明の
他の実施例として。

アデノシン　トリフオス７エー）（Ａ’ｒＰ）を他の助
は累として翻身ることができる。助酵素を添加し、液体
のｐＨを＃ＪＪ４ＩＭシた後に１例えにヘキソナーゼ（
１１Ｋ　）のような＃累も加えることかできる０代表的
な例として、ヘキソナーゼヲクリセロールサスベンジョ
ン又は−低酸７ンモニウムサスベンジョンのようなサス
ベンジョンにして加えることができる０例えば、グルコ
ース−６−フォスフェート　デヒドロゲナーゼのような
他のｍ累も加えられてもよい。

安定化した融状の酵素及び、又は助酵素浴液を準備した
横、アンバーガラスぴんに移し、密封の状態にシールす
る。四に、これらのびんは。

代表的な場合には、冷凍下で貯献される。安定化した酵
素と助酵素の保存性は、顕著な減電なしに、これらの粂
件下で４年間までのびる。

２ 本虻明を更に詳細に説明する。臨床診断の分野における
本発明の商業的応用は、これに限定される本のではない
が１例えば生物分秘液のグルコース礎度などというよう
に基質濃度を決めるために用いられる診断試峯で示され
る。ｓＫも拘わらず１本発明に関連して調整された組成
物は、他の生物的成分を決定し１足置することができる
。例えば生物分必液中の次のような成分を決定し、定量
できる。

１　グルタミツクーオキザロアセテイツクトランスアば
ナーゼ（Ｓ　Ｇ　ＯＴ　）２　グルクミツクービルビツ
ク　トランスアばナーゼ（ＳＧＰＴ） ３　ラクテインク　デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）１−Ｐ） ４　ラクテインク　デヒドロゲナーゼ（Ｌｌ）１−（−
Ｌ　） ５　クレアチン　フオスフオキナーゼ（ＣＰＫ） ６　α−ハイドロキシプテイリツク　デヒドロゲナーゼ
（α−ＨＢ　Ｄ　） ７　グルコース（ヘキソナーゼーＧ−５−ＰＤ■　経由
） これら上述の試薬は、しばしば同じように反応し、いく
つかの共通な不安定成分を含み、そこに含まれているい
くつかは共通している。次の化学反応式は、含まれる反
応の一般的な性質を図示するモデルとして示す。

Ｎ　Ａ　ｌ）　Ｈ十生成物 上にあけたすべての酵素反応は１本発明と一致して、こ
の一般式に従うであろう、ここでの反応（２）は、常に
カップリング反応として参照され１反応（２）又は（３
）は、測定反応として、又反応（１）は、初期反応とし
て％似づけられる。しかしながら、これら３つのすべて
の反応が測定に必要なのでなく、季央それらは、二つ又
は一つに＃ｉ定してもよいということが分っている。ラ
フティック　デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）活性の紫外線測
定の９４合には１反応（２）のみが含まれ、下記の通シ
である。

ラフチー）　−１−Ｎ　Ａ　ｌ）　→Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ２
＋ビルパート 逆に、上述の３つの反応以上のものが、クレアチン　フ
オスフオキナーゼ（ＣＰに）の場合のように、含まれる
かもしれない。

＋２１ＡＴＰ＋グルコース＃グルコース−６−フォスフ
ェート＋ＡＤＰ ＭＳ ＣＰＫ、クレアチン　フォスフェート ＡＤＰ−アデノシン−５′−シフオスフェートＡＭ＝、
アデノシン　モノフォスフェートＡＴＰ−アデノシン　
トリフオスフェートｔｌＫ−ヘキンナーゼ ＮＡ　％ニコチンアばドーアデニン　ジヌクレオタイド
ＮＡＩ）Ｐ＝ニコチンアξドーアデニン　ジヌクレオタ
イド　フォスフェート ＮＡＩ）Ｉｆ２−ニコチンアばドーアデニン　ジヌクレ
オタイト。

還元形 ＧＬＤＨ＝グルタメート　デヒドロゲナーゼＧ−６−ｐ
　１）Ｈ＝ニブルコース６−フォスフェート　デヒドロ
ゲナーゼ Ｇ−６−Ｐ＝ニブルコース６−フォスフェートＩＮＴ＝
テトラゾリウム塩 ＰＥＰ−７オスプ益ノール　ピルベートＰＭＳ−フェナ
ジン　メンサルフェートＰＫにピルベート　キナーゼ この場合に１反応（２）と（３）はカップリング反応と
考えられ１反応（３）とｆ４１は測定反応、そして反ム
ムｉｌ＋は初期反応であろう。

反応幻−−一般民を参照して、この反応順序を利用する
ことで１反応基’ｊｆ／生成物か又は触媒酵素かのいず
れかの電縫分析をすることができるということを明らか
となり、一般に知られている。

生物学の分野におけるこれら構成ＩＩｉ、Ｘの電析化は
人又は動物の病状の診断や処置の手段として広く受け容
れられ使用される。

酵素は大きな分子量をもつ複雑な蛋白質分子で１通宮ぞ
の化♀構１冑は未知のものが多く、籾４仕その触媒能力
と、基Ｔ１特異性で分類されている。ｊＶＴ素は単一の
基質、又は類似の連装群の反応をり１口φすることので
きる体物的触媒として再定義きれるであろう。

助酵素はよく定義づけられた構造をもつ低分子量の生物
的化学物質で、その反応又は相互作用は、特殊な酵素の
分析又は反応に必要である。

助ｍ素は触媒として、その構造又は脈子組成に不可逆的
な変化を生じる。助酵素は、臨床分析処置に非常に有用
である。おるものは非常ＥＣ強い吸光をもち、その反応
は基質に従い化学量論的であり、それ故、吸光形の出現
と消失を測定分所的に追跡できる。ニコチンアミド−ア
デニン　ジヌクレオタイド（ＮＡＤ）と、その還元形（
ＮＡＩ）口２）は、上述のＳ　、　Ｇ　、０　、−１−
０、Ｓ。

Ｐ、Ｇ、’１”、、　Ｌ　Ｄ　Ｈ分析のような多くの重
要な臨床分析に用いられている。ＮＡＤとＮ　Ａ　ｌ）
　Ｈ２は約７００の分子量をもつ非常に桟雑な体物分子
である。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ２は３４　Ｑ　ｎｍ　に強い吸
収をもち、一方ＮＡＤはこの波長では吸収しない。

基質は既知の構造をもつ有機化合物で、それらル、応物
又は相互反応物力ｉ酵素によって朋謀≧れて、その／７
Ｖ分の構造や原子＃１成や、立体的化゛字ローテーショ
ンに変化を生じないものである。

一般（（基質（す、それらライバクテリアや菌類や。

他の微生ｑ０の食物として更われて彼生′（グ的減或を
するｌＪ＋向がある。ゲ菖すれば、これらの化合物は水
媒中又は、中性に近いｐｉ−１（ｐＨ４からｌＯのｉｉ
シ囲）内で安定を保つ。顕著な基質（ま。

グルコース、ラクテート、又はラフティックコース・２
矢示することを図示したものである。

−７オスフオクルコ醒 初期反応を起こ丁＃累はへキソキナーゼでわり、そして
カッグル反■６及６１１Ｉ定反応を２こ了゛酵素は、Ｇ
−ａ−ＰＤＨで凌）る、上の反応においてグルコースは
測定反応でダ−じたＮ　Ａ　Ｄ　Ｈを測定することで決
足される。実際は、この反■６は。

完全に終了するまで行ない、　ｌＡ：成した助酪素ＮＡ
　１）　ｉ−１の１を本質的に測定すればよい。

Ｎ　Ａ　Ｉ）　ｌＪ、水の中と乾燥状輻では不安定であ
るが、湿気のある状態にさらされた時には、ＮＡＤＨ２
から還元されたものほどそう不安定ではない、従って、
ＮＡＤＨ２は湿気のあるところで保存しなければならな
い、一方ＮＡＤは１本発明に従って、水溶液中で容器に
バックでき。

安定化される。＃Ｉ性ＰＨでは安定性は良いが。

アルカリＰＨ１ではＮＡＤはこわれやすい傾向がある。

正確なメカニズムも、最終生成物も明らかではないが、
破壊されたＮＡＤは、もはや助＃累として効果的に働く
ことカイできないということだけで充分だし、必要な波
長で有効な影響本もっていない。

本発明のユニークな利点の一つは、すべての成分が、一
つの試薬びんの中で安定化できるということである。一
般に、安定化した酵素又は助酵素を間型に述べる瓢と二
つの重要な価値がある。これらの価値の一つは、水Ｕ中
で非富に安定性の１憾い酵＊又は助酵素を供給するとい
う仁とであり、オニの価値は、可能な限り包装の数を制
限できるということである。ＮＡＤのような助酵素の安
定性について、ＮＡＤはＮＡＤｕｊｂもずっと安定であ
るということが観察されている。それ故、Ｎ　Ａ　Ｄ　
Ｈの場合に、必要な初雑な安定化の技術を使う必要はな
い、従って。

すべての試薬は、一つの溶液中にバックでとる。

本発明の酵素と助酵素を安定化するに際し。

均一な混合物でいられる貧″だけ、安定した溶液に添加
するのが望ましい。このポリマーは、全７４１成物に対
して、約０．０１％から約０．５％の童だけ存在すべき
であり、０．０５％から０．２５％のｉｒ！囲が適当で
ある０本発明に用いられる安定剤として有用な水溶性ポ
リマーはいずれも酵素活性を１ｆｆｌ害しないものであ
り、かつポリマーマトリックス中で、酵素を固定するこ
とができるものである。このポリマーは、ポリビニール
ビロリジ／のような合成物情又は、変性したコラーゲン
であるゼラチンのような生物的に生成したデキストラン
のような有機物質であってもよい。

ポリマーは、一般的に約り０℃捷で加熱することにより
、水に溶かす。ポリマーの水に対するｍ解度は温度の増
加に伴ってふえる。

ポリマーが完全に水にとけためと、アジド塩のようなア
ジド化合物を加えることができる力ξその量は約０．１
チＷ／Ｗが望ましい、しかしながらアジド化合物の量は
０．０１％から約０゜５％の範囲であってもよい、アジ
ド化合物は。

＃巣の安定性を助けるのＫむしろ驚＜ハどの効果を示す
ことが１本発明で見出された。従来はアジド化合物は単
にバクテリアの動きをとめるもの又は殺劇剤として動く
と考えられていた。

他の成分とのくみ合わせ下で、アジド化合物の安定化の
完全なメカニズムは完全に１ｉ理解されていないが５ア
ジド化合物が安定性を増すということが確立された。多
くの場合、アジド塩は必要でなく、除去することもでき
る。かくして多くの場合、水媒中のポリマー及び有機溶
媒だけで不安定成分の必要な安定性を与えるのに充分で
ある。ある二三の場合には、アジド塩は安定化を妨害し
たり、例えばグルコースのような基質に本質的な影響を
与える傾向があるので。

除去しなければならない。

前述に加え、基質と化学的に反応しない又は。

酵素反応を阻害しない他の殺菌剤や殺憎剤が採用される
。例えばアジド塩に添加して用いられるこれらのｆｆＭ
剤等のいくつかは、安、は香酸。

フェノール、チモール又は、ペンタクロフェノールであ
る。

ある場合には、安定化したａ１成物を使うとき。

反応の開始を助長するマグネシウムのような金属を採用
するのが望ましい。塩化マグネシウムという塩の形で用
いられるマグネシウムは、この目的のために提供された
試薬の一つである。

この試薬は１本発明の安定化した組成物に加えるのでな
く、使用の際に加えるのである。カップルする酵素を活
性化するこの試薬は、約０６０１％から約り％捷での量
で使うべきでめるが。

約０．０３％が望ましい。

Ｑ このプロセス中のこの時点で、溶液を、水浴中で約２０
℃から２５℃くらいの室温に冷や丸この溶液を冷やした
後で、トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタンのよ
うな緩衝剤を加える０代表的には、この緩衝剤は約５０
ミリモルから２００ミリモルの１・を加えるが、少くと
もｐＨを６．０から約８．５の範囲内に保つのに光分な
楡である。他の既知の緩衝剤及び他の形の緩衝剤がこの
プロセスに採用することができる。ある歩合に、緩衝壌
をＰＨを６．０から８゜５の間に＃ａ持するのに必要な
量だけ加える。一般的に、緩衝剤は、０．１から１．％
のアルカリ金属の水酸化物と、０．５から３チのアルカ
リ金属の酸性炭酸塩の組み合わせである。全塩容譬は必
要とするポリマーの針にも影響される。

更に高い塩容量例えｈｉｔで番チ以上では、塩によって
与えられる静電安定化のためにポリマーの必要量は少な
くなる。しかしながらこの高い塩容竜では、ポリマーが
溶液を濁らせたり。

沈澱したりするので、　′Ｎ溶解するために、ｆ８ｍ１ をあたためる必要がある。

浴液のＰＨをパｉ望の範囲に調整してから２ＡＴＰ又は
ＮＡＤ等のような、最初の助］Ｒを加える。この場合、
ＡＴＰは、全組成物の約０゜３ミリモルから約３０ばリ
モルの間で加える。

前述のように、安定化した酵素及び助酵素相方を３゛む
溶液を形成することができる。このようにして、２以上
の助酵素及び２以上の酵素を−ｊ−溶液中で安定化でき
る。例えば、助酵素Ａ１°Ｐは、ここで述べる方法で安
定化される、他方、ＮＡＤも又ここで述べる方法によっ
てａ自に安定化される。しかしながら、２以上の助酵素
を安定化するとき、その助＃Ｐ素は、一般的に同時に加
えてもよいし、どんな順序で加えてもよい、ＮＡｊ」は
、全組成物の約０．６−ミリモルから約６０ミリモルの
範囲で加えるのが望まし。

い。

このプロセス中のこの時点で、ＰＨは少くと本６．５か
ら約８．０以下の範囲に調整するべきであり、７．５の
Ｐａ−ｆが望ましい。

ＰＩ（Ｐｌ＋ｌＩ後、クリセロールのような適当な有機
Ｍ媒を加える。この場合、２５チから４ｏチＶ　／　Ｖ
の範囲内であるが、一番望ましいのは。

有機溶媒を３０％Ｖ　／　Ｖ加えることでおる。しかし
ながら、有機溶媒の量は、約５％から）０慢Ｖ／Ｖの間
で変化させうる。

有機溶媒は次の特性をもつべきである。

Ｉ　ＰＨが４からｌｏｏ範囲： ２　舅温又は冷凍温度下で液体であること；３　静電気
結合（水素結合）を生成する以外は。

ＮＡＤ又はＡＴＰ及び同様のものと反応しない； ４　水と混和しゃすい； ５　加浴媒分解の標準フリーエネルギーが低い（ノルマ
ルレゾナンスが決っている）。

溶剤は、水にとけ、室温又は冷凍温度下で液体で、かつ
＃電気結合を形成する以外は、酵素と助Ｈ累の反応基と
反応して減成しないものでなければならない、有効な溶
剤は一般に、エーテル類、ケトン類、スルホン類、スル
ホキシ２２ ド類のような安定な冶機浴媒と、メタン、エタノール、
グロバノール、ブタノールのようなアルコール類、アセ
トン、ジオキサン、、ｏＭＡ９゜ジメチルスルフォン及
び−Ｉ’　ＨＦである。しかしながら、この処理段階で
の溶媒の濃度が低い／ｆど高い活性が、解体ポリオール
％　ｔｉの間合に見出されている。例えば、グリセロー
ル、エチレングリコール、プロピレングリコール又はブ
タンジオールのような２ないし４の水酸基と２ないし１
０の戻水原子を含むＭ体ポリオール類が望ましい。グリ
セロール、ノロピレン　クリコール、１．２−ノロパン
ジオールは、これらすべての時性をもっていることが分
っており、よりぬきの溶媒である。

違ばれた鳴機浴媒がポリオールであるとき。

アジド化合物や他のＩｔｉ菌削をこのために用いる必要
はない、というのは、ポリオールがｈｍ剤として有効に
働くからである。しかしながら。

選ばれた溶媒及びポリマーが、水溶液中で必要な安定性
を与えるとはいえ、ポリマーとＲｆＡ間ノを 特開昭６Ｏ−１０５４９４（７） のカップリングを増加すると考えられる＠シにおいては
アジド化合物が時として望ましいものである。

グリセロール又は他のポリオールを飽加稜。

できた溶液のＰＨを再１１１整する０代表的には。

ＰＨはわずかに塩基性に傾くので、１規定のｌｌＣ１ｇ
加してＰＨ−ｔ−１整する。同様にして。

もしＰＨがわずかに酸性になるならＦｉ適当な塩基を加
えて、　ＰＨを７．５にＭｌする。

重要なことの一つは、助酵素ＮＡＤが過剰量存在すると
いうことである。前述のようにグルメ コール決定は、ＮＡＩ）から生成するＮＡＤＨを測定す
ることで達成される。ＮＡＤＨは、酸性環境では小安定
で、ＰＨ５で減成しはじめるし。

更に、ＰＨ４では非常にすみゃかに減成する。

従って、浴数のＰＨは、中性ｐｉ　７以上を保つべきで
ある。ＮＡＤは、酸性環境下で夾除には安定であるが１
本発明によると、ＰＨ７，５のわずかに塩基性の環境下
でも本質的に減成しないことが分っている。ＮＡＤは、
かなり過剰に２を 加えても、この液体環境下で、数年経過後にも常に充分
な減成しないＮＡＤが存在する。

一般にいって、所望の決定を行なうのに少なくとも十分
な量ですべての助ｎ９素を含ませる。

助＃累の最大量は商業的な夾用件によって制限されるが
１本質的に最大量はない。

助＃紫を液体溶液に加えた後１選んだ酵素を加える。２
助酵素の場合と［ｒｉ１様、酵素はどんな順序で加えて
もよい、又１つ又はそれ以上の酵素を１ｆ１１−の沼ハ
に加えてもよい。本発明による望ましい観点および、上
述の酵素系によると、二つの＃素は、ＨにとＧ−Ｊ−Ｐ
ＤＨである。　ＨＫはリットル当り１１ユＩ、Ｖ、以上
加えるのが望ましい（ＰＨが７．６．２５℃）、シかし
ながら、少なくともリットル当り１．０００１．Ｌｌ。

のＨＫを加えるのが望ましい。

Ｇ　−６−Ｐ　１）　Ｈは、Ｌ−メセンテロイド菌から
形成し、リットル当り約１００１．Ｕ、から３０．０Ｏ
Ｏｆ、Ｕ、又はそれ以上の範囲に＃縮するのが望ましい
０本発明によると１通常ＰＨが約７．８で２２５℃で使
われるとき、２つのタイプ＋７）Ｇ　−６−Ｐ　ＤＨｃ
ＤＩｔｊｉ約３　、０００　１．Ｕ。

が望ましい。

酵素の量は少くともリットル当りｌ　ＯＯ１，Ｕ。

（インターナショナルユニット）存在すべきであるが、
大抵の商業ベースの試薬では、酵素例えばヘキソキナー
ゼは、少くとイリットル当り１．０００　１．Ｕ、存在
すべきである０適音の商業ベースの包装品では酵素はＰ
Ｈ７、ｆ３で約２５℃の温度下で約１．０００から１０
．０ＯＯ１，Ｕ、存在する。しかしながら、伺常大抵の
Ｖ１合、酵素の廿はｘｏｏ、ｏｏｏｔ、Ｕ、を越さない
ものでめるが、酵素の最大量には制限はない。

本発明のプロセスでは、酵素は最終のＰ）（が調整され
たあとで加えるということ力ｆ重要である。酵素と助酵
素の安定化成就する全メカニズムは、壕だ完全には分っ
ていないが、基質反応が現実に起反分子の一部であるか
又は他に触媒化される官能基をその選ばれた溶媒が保護
することによって、酌煉中の酵素を安定化させると２ｂ 考えられる。史Ｐこ、安定化は、＃累と助酵素を倣生物
的汚染を防ぎ、かつ減成を防ぐことによって、得られる
と考えられる。助酵ｇ　Ｎ　Ａ　Ｄは、助酵素Ｎ　Ａ　
Ｄ　ＨとＮＡＤがプロピレングリコールのような芯剤に
多少溶けにくいという点で異っている。しかし、ＮＡＤ
は、水に対し史に安定であり、助酵素はポリオールによ
って安定化されるようだ、純粋なポリオールは、酵素を
変性するが、水と溶媒の混合物のような水溶液の存在下
では、酵素は変性しない、極性基が安定状態に＃＊ｖ活
性基を維持するために有機溶媒中に必要であるというこ
とは明らかである。明らかに１醇索及び助陣素は、触媒
活性を保持し。

指定製置に減成しない限りにおいて、ある形の物理的又
は化学的反応が＃帰した水性有機溶媒中で起っている。

史に、ポリマーは酵素とポリマーの間に静電気又は共有
結合が生じるために、アジド化合物とある形で反応了る
ようだ。実際は、ポリマーは酵素の活性基をいくらかカ
プセル化するため計 ＃Ｃひつばシ、それＫよって、保腰するようである。こ
うして酵素の減成又は、他の形の減成が防止されたり、
あるいは起らなくなる。

上述のように、同一溶液中において少なくとも２匂上の
助酵素又は２以上の＃累を安定化させることができる。

ｑ！にイ、つと重要なことは。

１ｈＪ−溶液で酵素と助酵素双方を安定化することが可
能であるということである。ポリマーがある程度の安定
効果を子守つよう六が、有機溶媒の水＃液が助酵素を安
定化する主な要因であると考えられる６醇索の安定化に
おいて、有機溶媒とポリマーの双方が、安定化を生じる
主な要因であるようた。加えて、多くの場合、アジド塩
が安定伯：を増すことを助ける。いずれの場合にも、酵
系も助酔索もまた同一の浴液にあることが観察できる。

安定化された酵素及び助酵１ｇ組成物で達成されるその
彷の反応のいくつかは以下の通りである。クレアチンの
リン酸化を含む反応は次の通りである。

Ａ？。

グルコン酸 次の反応においては、クレアチン＋ＡＴＰの出発反応が
ＡＤＰを供給するために採用される。

次の反応は、安定化した液体組成物中で、ウレアーゼと
Ｇ　Ｌ　１ｊＨ酵素を使用した場合を示す。

Ｎ　Ｈ４＋＋α−ケトグルタレート＋ＮＡＤＧ　Ｌ　ｌ
）　）１ ＝＝ゴグルタメート十ＮＡＤＨ 本発明はこれに限るものではないが、更に示すと次のよ
うな実施例がある。

笑施例　（１） 約Ｏ０γ２のゼラチンポリマーＥ約７ｏｏ＋＋４の氷に
加える。この＃液を、ゼラチンポリマーを溶解するため
て約３０℃以上に加熱する。

ポリマー添加後、温胛を約２２℃に下げるために水浴に
入れる。

それからＰＨを６．５から８．０の範囲内に調整する。

温度が下がり、　ＰＨ画整後、約２ｙのＡ　ＴＰをこの
溶液に加え１次に４ノのＮＡＤを加える。３ｙ（９塩化
マグネシウムをＮＡＤと共に加える。それから３００−
のグリセロールを加える。

グリセロール添加後、ＰＨをｌ規足の塩酸を添加して約
７．５に調整する。

完全なｆＪｆＮができた佐、溶液はグラスティック又は
ガラスの容器に移し、密閉する。容器は。

密閉して冷凍下で貯蔵する。このようにして。

安定化された助＃素紹成物は、特別な減成本な＜　＃ｉ
？ｉ　４年まで安定して貯蔵できることが分っている。

’＃ｊイｌｊ　ｖＡｌ　（２） 埴施例ｆｌ）で作ったサンプルは、ガラス容器に密閉す
る前に、＃素ヘキソナーゼも加えることがで西る。保存
性も特別な′ＯＥ、Ｈ，なしに同じである。

実施例　（３１ 実施ν！ｌ　ｆ２１のサンプルは又、カラス容器に密閉
するＭｆｒに、＃素Ｃ−５−ＰＤＨを加えることがで轡
、保存性も杓別な減成なしに同様にながいものが得られ
る。

″’Ａ施例　（４） 約１．０ノのデキストランポリマーを約７００　ｍｌの
水に加える０次にこのｇ液を３０℃以上に加熱して、ポ
リマーを溶解する。この浴液を温度を約２２℃に下ける
ために水浴に入れる。

ＩＦＩが下った後に、約２．２ｙのＮＡＤＰを浴液に加
え２次に、４ｙのＡ　−ｒ　Ｐを加える。溶液のＰＨを
６．５から８．０の範囲にｉ”ｌＡｔ整した≧ 後、３２５ｆｎｌのグリセロールを加える。

グリセロール添加袋、Ｐｆｆを１却、定の塩酸で約７．
５に調帯する。

完全な溶液ができた後、溶液をプラスチック又はガラス
容器に移し、フタをする。′ｇ器は９気が入らないよう
Ｖこ密閉し、冷凍下で保存する。

アジド塩を加えてないが、安定化された助酵素の組成物
はほとんど実施例（１）の組成物と同様に有効であると
いうことが分っている。

次の例は１式の形で表しであるが１本発明の安定化され
た組成物を作る種々の重要な段階で加えられる試薬及び
その祭を示している。

実施例　１５） 安定化したＡｔ）Ｐ、ＡんＩＰ及びＮＡＤ約７００ｄの
水 ０．５９のゼラチン 加ＦＰｌ溶解 ０．７７のアジド塩 室温まで冷却 ５０ｆ！のクレアチンフォスフェート １３ ４ノのＡＤＰ ２ＯｆのＡＭＰ １５ｐのＮＡＤ 解ｐＨ−後、　ＰＨを〒から９の間で！＃４！ｊＥ３０
０−のグリセロール 混合後Ｐ）ｌ　を豊刺整 びんに移し、密閉する 実施例　（６） リットル当り約３００１．Ｕ、から約１５．０００１、
Ｕ、　ノＧ　−６−Ｐ　ｉ）　Ｈ及ヒリットル当り約１
００１．０．から約１０　、０００１　、ＬＪ、Ｑ）　
ＨＫをパック前の実施例（４）の液に加える。

実施例　（７） １．５ｐのＮＡＤ ５−の水に＃解 δ−のグリセロールを酪加 ＰＨを５以下に調銚 実施例　１８） ＮＡＤ及び）ＩＫの安定化 １．５ｙのＮＡＤ ０．１モルのＰＨ７のピペラジン　ビス　エタン　２ル
アオン酸緩衝液の１０−に溶解ＰＨ６６から７ＫＩＮＷ ２°′ １０−のギリセロールを添加 ＰＨを再調整 ばリグラム当ｆｉ、１５０１．Ｕ、の活性を吃っＨＫを
１０キｈ添加し溶解 実施例　（９） １．０００−の水 １２．１ｐのトリス（ハイドロキシ　メチル）アきツメ
タンを添加 １．０ｙのゼラチンを添加 ３０℃以上に加熱溶解 室温に冷却 ２．０２のＡＴＰを添加 ２ｙ−のＰＥＰを添加 ３午 １０．ＯＦのクレアチンを添加 俗解＋＆ＰＨを９に調整 実施例　Ｏａ 実尻例（９）の安定化した溶液に、リットル当り１００
から１０．０００１．Ｕ、のＬｌ））Ｉを加え。

そしてリットル当り１００から１０．０ＯＯ１，Ｕ。

のＰにを加え、包装する。

からＱＱｌの紹成物は、各々何ら本質的な減成もなく、
４年近くの長期保存性を有し、その保存安定性は現在市
販されている凍結乾燥品より以上のものであった。

次に、本発明を利用した診断測定試薬について実施例を
示す。

実施例（１１１ 水組成からなる水性複合試薬を作成した。

ンテロイド類） マグネシウム（Ｍｇ＋＋）　１゜ｍＭ アジ化ナナトリウム　０．１％Ｗｇｔ／ｖ２．４−クロ
ロフェノール　０．０１％ｗｇｔ／Ｖグリセロース　６
〜ｌα％Ｖ／Ｖ この複合溶液は２６〜８℃で４ケバ、２３℃で１ｏ日間
安定であった。

実施例Ｏｚ クレアチン　キナーゼ　試薬 クレアチン７オスフエートとグｙコーヌヲｐＨ約９．８
の３０％Ｖ／Ｖグリセロール水溶液に含む水性助酵素試
薬溶＃１０容量部と、ｐ）（６，０〜６゜２の６％グリ
セロール水溶液に酵素を含む水性基質試薬９０容量部を
用いて、下記の紹成からなる安定な複合試薬を作成した
。（前記助酵素試薬及び基質試薬の貯蔵寿命はいずれも
１８〜３６ケ月であった。） 成分　濃度 ３０’Ｃ（７）［）Ｈ６，８±０．１ タレアチン　フオヌフエート　３０ｍＭＤ−グルコース
　２０ｍＭ ヘキソキナーゼ　：５ｏｏｏＩＵ／１（３ｏ℃）Ｎ−ア
七チル　システィン　ｚｏｍＭ 酢酸マグネシウム　１０ｍＭ イミダゾ−μ緩衝剤　１００ｍＭ ＢＤＴＡ　１ｍＭ グリセロ　、、　６′ｖ１０容１″％ アジ化ナトリウム　０．１％ｗｇｔ、／Ｖこの複合試薬
は２〜８°Ｃで約２ケ月の貯蔵寿命を有する本のであっ
た。

実施例ａ３ 下記のＣＫ−ＵＶ基質、助酵素及び緩衝剤水溶液はいず
れも２〜８℃で１８−３６ケ月の貯Ｒ寿命を有するもの
であった。

ｌ　ＣＫ−ＵＶＸＪＩｔ：　クレアチン　フォスフェー
ト３００ｍＭＢアデノシン−５／−シフオスフェートＣ
Ａ　Ｄ　Ｐ　）　２８　ｍ　Ｍ　＋　７デノシンーぎ−
七ノフオス７エー）（ＡＭＰ）２５ｍＭＨグ／７：Ｉ−
７．−５−７オス７エート　デヒドロゲナーゼ（Ｌ、メ
センテロイド類）≧４００００ＩＵ／ｌ蓚アジ化ナトリ
ウム１％ｗｇｔ、／Ｖ　＋グリー１ｚＯ−／Ｌ／３０容
量％。

デニン　ジヌクレオチド（ＮＡＤ）３０ｍＭ；アデノシ
ン−ぎ−モノフォスフェート（Ａ　Ｍ　Ｐ　）　２２　
ｍ　Ｍ　：　ペキン＊　＋−セ（イー　ヌ　ト　）　≧
　１　ａｏｏｏｏＩＵ／ｌ　（ｐＨｓ、ｏ）　。

マグネシウム２００　ｒｎ　Ｍ　＋グリセロー／Ｌ１５
０賽量％。

３　ＣＫ−ＵＶ　：　Ｄ−グリコース８３ｍＭＢＮ−ア
セチルシスティン１２ｍＭ＋ジチオトレイトーｉｖ　６
ｂ　ｒｎ　Ｍ　：イミダゾー！　２５　ｍ　Ｍ　ＨＥＤ
ＴＡ、デキストリｙ、ｆｉ５゜３゜ 容量比１：１：１０の割合でこれらを用すて、下記の糺
成の複合溶液を作成した。

クレアチン　フォスフェート　２５ｍＭへキソキナーゼ
（ＨＫ）　１ｓｏｏｏＩＵ／ｊ７ＰＤ） Ｄ−グルコース　６９ｍＭ マグネシウム　１７ｍＭ ジチオトレイトー／Ｉ／　５４ｍＭ イミダゾ−／Ｉ／　２１ｍＭ Ｎ−アセチル　シスディン　１０ｍＭ グＩＪ　−ｋ　Ｏ−／ｌ／　６〜１０％Ｖ／Ｖデキヌト
リン　１．２％ｗｇｔ／Ｖ ｐＨ６−０ 複合溶液は２〜８℃で１ｏ日間安定であった。

なお、実施例ぐυ〜（１３１に貯蔵寿命１８〜３６ケ月
とあるのは、測定された貯蔵寿命が３６ケ月で、市販時
に保証される寿命が１８ケ月であることを示す、Ｊｔ被
補正夕〆 特許出願人　イワン　エントレ　モドロピッチ手続補正
書 昭和５９年１０月２９日 参 特許庁長官　殿 ■、小事件表示　昭和５９年特許願第２０５４５０号２
、発明の名称　安定化した液体酵素及び助酵素組成物の
製法３、補正をする者 事イ′１との関係　特許出願人 氏名（名　称）　イワン　エントレ　モトロヒッチ４、
代理人　〒６０４ ６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容 別紙の通り 補正の内容 （１）明細書、特許請求の範囲の項を別紙の通り補正す
る。

（２）同書、第４頁第５行、「不安定な酵素と助酵素」
とある後に、「Ｃすなわちレイビル酵素とレイピル助酵
素）」を加入する。

２、特許請求の範囲 （ａ）　水性媒体に溶解した、生化学的診断を実施する
のに少なくとも十分な量のレイピル助酵　′素、 （ｂ）　上と同じ又は異なる水溶性媒体に溶解した少な
くともｌ○ｏ　Ｉ、Ｕ、のレイビル酵素で、該酵素と上
記助酵素が協同して測定反応に関与するもの、及び （ｃ）　上記水性媒体中に存在する少なくとも室温で液
体であり、上記酵素及び助酵素と反応しない少なくとも
５　％　Ｖ／Ｖ　の水混和性有機溶媒 を含む、ｌ又はそれ以上の組成物から形成される糸であ
って、結合されたとき、上記酵素と助酵素の混合物が上
記有機溶媒を含むｐＨ約６．○〜８．５の水性媒体中に
存在し、その結果上記酵素と助酵素が安定されること、
及び上記酵素がグルコース−６−フォスフェートデヒド
ロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルタメートデヒドロゲ
ナーゼ、タレアチンフオスフオキナーゼ、クレアチンキ
ナーゼ、ピルベートキナーゼ及アルカリフオスフオヌフ
オターゼからなる群カラ選ばれ、上記助酵素がニコチン
アミドーアデニンジヌクレオタイド、アデノシン　トリ
フオスフェート、アデノシン−５′−シフオスフェート
、＝　：ｌ　４−　：ｙ　ア　、　）、　−７７”　＝
　：ｙ　Ｊ　ツ　ケ　、　オ　ヶ　イ　、８戸丁フォス
フェート及ヒアデノシン　モノフオヌフ工−トからなる
群から選ばれるととを特徴・とする水性媒体中で通常不
安定な少なくとも一種のレイヒル酵素と少なくとも一種
のレイピル助゛酵素を含む、生化学的診断に使用する安
定化された液体系。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 擬ａ）水を少くとも室温で液体である水混和性の非反応
   性有機溶剤と混和して、水混和性の有機溶媒溶液を生成
   し。 ｂ）この水混和性有ｔＳ浴媒溶液中にポリマーを溶解し
   。 Ｃ）上記溶液に溶解し測定反応に協同して働き測定を遂
   行できるように上記溶液にリットル当り充分な童の不安
   定助酵素を加え。 ｄ）助酵素が安定であるように、６．０から８゜５の範
   囲内にｐＨを調整し。 ｅ）更に、上記溶液に、少くとも１リットル当り、１０
   ０１．Ｕ、の不安定酵素を加え、その酵素が溶液に溶解
   して測定反応に協同して動くようにし。 ｆ）そして、得られた組成物を密閉することからなり、
   かつ ｇ）　上記酵素カ！ルコース−６−フオス７エート　デ
   バイドロゲナーゼが、ヘキソキナーゼ。 グルメメイト　デバイドロゲナーゼ、クレアチン　フオ
   スフオキナーゼ、ピルベート　キナーゼ、及びアルカリ
   　７オスフアターゼからなるクラスから選ばれ、上記助
   酵素が、ニコチンアミド−アデニン　ジヌクレオタイド
   、アテンシン　トリフオスフェート、アデノシン−５′
   −シフオスフェート、ニコチンアミド−アデニン。 ジヌクレオタイド　フォスフェート及びアデノシンモノ
   フォスフェートからなるクラスカラ運ばれることを％埜
   とする通常水性媒体中で不安定な酵素及び助ｔＪ素を、
   生化学的診断測定に使用できるように安定化する方法。 ％１ＬＪＣ