CH631208A5

CH631208A5 - Process for stabilising a labile coenzyme and enzyme

Info

Publication number: CH631208A5
Application number: CH1111877A
Authority: CH
Inventors: Ivan Endre Modrovich
Original assignee: Ivan Endre Modrovich
Priority date: 1976-09-13
Filing date: 1977-09-12
Publication date: 1982-07-30
Also published as: GB1570971A; DE2740957A1; CA1102225A; JPS5843078B2; SE7711853L; JPS5352685A; FR2364457B1; JPH0147999B2; JPS60105494A; FR2364457A1; DE2740957C2; SE446742B

Description

La présente invention concerne, dans son ensemble, un procédé perfectionné de stabilisation d'enzymes ou de co-enzymes labiles, dans un milieu unique formé d'eau et d'un solvant organique.

Dans l'état actuel de la technique industrielle, on stabilise l'aptitude réactive d'enzymes ou de co-enzymes en les emprisonnant dans un substrat solide, par lyophilisation, mélange à sec du type utilisé pour transformer en comprimés des poudres séchées, principalement dans le domaine du diagnostic pharmaceutique et dans les applications apparentées, et immobilisation par emprisonnement de la structure chimique de l'enzyme dans un substrat solide. Contrairement aux apparences, ces voies d'accès ne sont ni pratiques ni avantageuses, et elles sont également coûteuses. Le fabricant est obligé d'éliminer l'eau et de fournir un produit partiel, en abandonnant ainsi une partie du cycle d'obtention de la qualité dans la dilution et dans l'utilisation du produit final. Les laboratoires sont contraints de payer les frais importants de l'emballage, des pertes de réactifs, de la lyophilisation et de la formulation à sec,et l'intérêt du produit est encore limité par les modes d'emballage et par les dimensions.

En outre, une bonne uniformité du produit est difficile à réaliser. Cela est illustré par le fait que pour la plupart des sérums témoins lyophilisé du commerce (sérum de référence), les variations acceptables d'une bouteille à l'autre, en ce qui concerne les constituants enzymatiques, sont fixées à plus ou moins dix pour-cent de la valeur moyenne.

La présente invention permet de trouver une composition liquide renfermant des co-enzymes et/ou des enzymes qui sont stabilisés dans un seul et même récipient.

Elle permet en outre d'offrir une composition d'enzymes et de co-enzymes/labiles du type défini dans un milieu formé d'eau et d'un solvant organique et dans laquelle la stabilisation de l'enzyme et du co-enzyme n'affecte pas la réactivité enzymatique après une période notable.

Finalement la présente invention permet d'offrir un procédé de stabilisation d'enzymes et/ou de co-enzymes labiles en présence d'autres co-enzymes labiles ou d'autres enzymes labiles, cette composition ayant une longue durée de conservation.

Des enzymes et des co-enzymes labiles, traités conformément à l'invention, acquièrent une stabilité durable sans que leur réactivité enzymatique ou co-enzymatique ni leur absorption photométrique soit affectée. L'obtention de réactifs enzymatiques et co-enzymatiques sous une forme liquide stable favorise l'application colorimétrique de méthodes actuelles basées sur le couple NAD/NADH, ainsi que d'autres méthodes, principalement à cause de la facilité d'exécution de la séparation des ingrédients. Des réactifs liquides stables sont particulièrement avantageux lorsque la consommation de NADH ou d'un autre co-enzyme est la base de la mesure et que le réactif coloré doit être séparé de NADH et du milieu réactionnel. Dans le mode ultraviolet, le milieu liquide offre une meilleure homogénéité des réactifs et facilite l'emballage, de même qu'il offre une souplesse d'utilisation qui contraste avec les préparations lyophilisées ou en milieu sec.

Le milieu liquide qui est conçu pour permettre la stabilisation d'enzymes et de co-enzymes comme défini ci-après est remarquablement formulé de manière qu'un ou plusieurs co-enzymes puissent être stabilisés dans ce milieu. Par ailleurs, on ou plusieurs enzymes peuvent être stabilisés dans le milieu liquide. En outre, co-enzymes peuvent être stabilisés dans le même milieu liquide dans un seul et unique récipient.

Dans un mode d'exécution préféré, la stabilisation des enzymes et/ou des co-enzymes est effectuée en dissolvant un polymère tel qu'une gélatine dans de l'eau distillée. La gélatine est de préférence dissoute en proportions de 0,1% en s

10

1S

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

631208

poids/poids. Ensuite, la gélatine solubilisée dans l'eau est chauffée à environ 30° en vue de sa dissolution totale. Dans quelques cas, on peut utiliser un azide qui sert non seulement d'agent bactériostatique, mais tout aussi bien d'agent stabilisant. Ensuite, on laisse refroidir cette solution essentiellement à la température ambiante ou à environ 20°C.

Dans un cas, le co-enzyme, à savoir le nicotinamide-adé-nine-dinucléotide (NAD) est ajouté à la solution en même temps qu'un agent tampon tel que le tris-(hydroxymé-thyl)-amino-méthane, afin d'ajuster le pH. Le pH est alors ajusté approximativement entre environ 6,0 et environ 8,5, sa valeur étant de préférence égale à 7,5.

Après l'addition du co-enzyme, on ajoute avantageusement un polyol tel que le glycérol en quantité d'environ 30% sur base volumique.

Après l'addition du polyol, on peut de nouveau ajuster le pH à environ 7,5.

Conformément à la présente invention, on peut stabiliser plus d'un co-enzyme dans la solution. Dans ce cas, l'autre de ces co-enzymes peut être ajouté avant ou après l'addition de NAD. Par exemple, dans une forme de réalisation de la présente invention, du triphosphate d'adénosine (ATP) peut être ajouté comme autre co-enzyme.

Après l'addition des co-enzymes et lorsque le pH du liquide a été ajusté, on peut aussi ajouter un enzyme tel que l'hexokinase (HK). Par exemple, l'hexokinase doit être ajoutée en suspension, par exemple sous la forme d'une suspension dans le glycérol, ou sous la forme d'une suspension dans le sulfate d'ammonium. On peut aussi ajouter un autre enzyme tel que la glucose-6-phosphate-déshydrogénase.

Lorsque la solution d'enzyme et/ou de co-enzyme stabilisés en milieu liquide a été préparée, on la distribue de préférence dans des flacons en verre opaque que l'on ferme de façon étanche. De plus, ces flacons sont ordinairement maintenus dans un réfrigérateur. La longévité envisagée des enzymes et co-enzymes stabilisés va jusqu'à quatre ans dans ces conditions, sans dégradation notable.

Dans le domaine du diagnostic clinique, l'application commerciale de la présente invention est illustrée par les réactifs diagnostiques utilisés pour déterminer la concentration d'un substrat, par exemple des concentrations de glucose dans des liquides biologiques, etc. Néanmoins, des compositions préparées conformément à la présente invention peu-vent être utilisés pour l'analyse qualitative et quantitative d'autres constituants biologiques tels que les constituants suivants, contenus dans des liquides biologiques:

1. Transaminase glutamique-oxalacétique (SGOT) 15 2. Transaminase glutamique-pyruvique (SGPT)

3. Déshydrogénase lactique (LDH-P)

4. Déshydrogénase lactique (LDH-L)

5. Créatine-phosphokinase (CPK)

6. Déshydrogénase a-hydroxybutyrique (a-HBD)

25

7. Glucose (par l'intermédiaire de l'hexokinase nase-G-6-PDH)

Les réactifs identifier ci-dessus réagissent souvent de façon similaire, ils contiennent certains ingrédients labiles communes et certaines des réactions chimiques impliquées sont communes.

Le schéma réactionnel chimique suivant est donné comme modèle pour illustrer la nature générale des réactions impli-3s quées.

Schéma réactionnel 1 - modèle général Enzyme 1

(1) SUBSTRATI) c > PRODUIT(S)

pH

Enzyme 2

(2) PRODUIT/ SUBSTRAT+ NAD-NADH2 ^ > NADH2-NAD+ produit pH

(3) NADH2+ CHROMOGENE Catalyseur CHROMOGENg + NAD

(oxydé) < (réduit)

Toutes les réactions enzymatiques énumérées ci-dessus suivent ce schéma général, selon lequel la réaction (2) est habituellement considérée comme la réaction de couplage, les réactions (2) ou (3) sont les réactions de mesure et la réaction (1) peut être caractérisée comme étant la réaction principale.

Toutefois, il y a lieu de remarquer que ces trois réactions ne sont pas toutes requises pour la mesure; en fait, elles peuvent être limitées à deux ou à une seule. Dans le cas de la mesure ultraviolette de l'activité de déshydrogénase lactique (LD), seule la réaction (2) est impliquée, comme suit:

Schéma réactionnel 2 - LDH LDH

LACTATE+NAD ^ > NADH2+PYRUVATE

65

Inversement, d'autres réactions peuvent être impliquées, en plus des trois qui ont été mentionnées, comme dans le cas de la créatine-phosphoquinase (CPK):

631208

4

Schéma réactionnel 3 - CPK CPK

(1) GP+ADP^ > ATP+CREATINE

HK

(2) APT+GLUCOSE^Z^GLUCOSE-6-PHOS.+ ADP

(3) GLUCOSE-6-PHOS.+ NAD ^G~6'PP>NADH2 10

(4) NADH2+INT (ox.) r?lNT+NAD (réd.)

Symboles:

CP

= phosphate de créatine

CPK

= créatine-phosphokinase

ADP

= 5'-diphosphate d'adénosine

AM

= monophosphate d'adénosine

ATP

= triphosphate d'adénosine

HK

= hexokinase

NAD

= nicotinamide-adénine-dinucléotide

NADP

= phosphate de nicotinamide-adénine-dinu-

cléotide

NADH2

= nicotinamide-adénine-dinucléotide, forme

réduite

GLDH

= glutamate-déshydrogénase

G-6-PDH

= glucose-6-phosphate-déshydrogénase

G-6-P

= glucose-6-phosphate

INT

= sel de tétrazolium

PEP

= pyruvate de phosphoenol

PMS

= méthosulfate de phénazine

PK

= pyruvate-kinase

Dans ce cas, les réactions (2) et (3) peuvent être considérées comme les réactions de couplage, les réactions (3) ou (4) peuvent être considérées comme les réactions de mesure, et la réaction (1) peut être considérée comme la réaction principale.

Si l'on se réfère au schéma réactionnel 1 (modèle général), il est évident et du domaine des connaissances générales que l'utilisation de cette séquence réactionnelle permet l'analyse quantitative des substrats et des produits réactionnels ou des enzymes catalytiques.

L'analyse quantitative de ces constituants dans des liquides biologiques et un outil diagnostique bien admis et largement utilisé dans le diagnostic et dans le traitement de maladies chez les être humains et les animaux.

Les enzymes sont des molécules de protéines complexes de grand poids moléculaire, habituellement de structure chimique inconnue. On les classe d'ordinaire d'après leur activité catalytique et leur spécificité extrême envers des substrats. Les enzymes peuvent aussi être définis comme étant des catalyseurs biologiques capables de catalyser une réaction d'un seul substrat ou une réaction d'un groupe similaire de substrats.

Les co-enzymes sont des substances chimiques organiques, de poids moléculaire assez faible et de structure bien définie, dont les réactions ou les interactions sont nécessaires pour un titrage ou une réaction enzymatique spécifique. Ils sont catalysés, ce qui entraîne une modification réversible de leur structure et/ou de leur composition atomique. Les co-enzymes sont très utiles dans les méthodes cliniques de titrage. Certains ont une forte absorption, leurs réactions sont stoechiométriques avec le substrat et, par conséquent, la création ou la disparition de la forme absorbante peut être suivie par photométrie. Le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) et sa forme réduite (NADH2) sont utilisés dans de nombreux titrages cliniques importants, par exemple les titrages de S.G.O.T., de S.P.G.T. et de LHD décrits ci-dessus. Les composés NAD et NADH2 ont un poids moléculaire d'environ 700 et sont des molécules organiques très complexes. NADH2 présente une forte absorption à 340 nm, tandis que NAD n'absorbe pas à cette longueur d'onde.

Les substrats sont des composés chimiques organiques de structure connue, dont les réactions ou interactions sont catalysées par des enzymes, avec, pour conséquence, une modification de la structure, de la composition atomique ou de la rotation stéréochimique. En général, les substrats sont enclins à subir une dégradation microbiologique et servent ainsi d'aliments aux bactéries, aux champignons et à d'autres micro-organismes. Autrement, ces composés restent stables en milieu aqueux à un pH neutre ou voisin de la neutralité, (c'est-à-dire dans une gamme de pH de 4 à 10). Des exemples représentatifs de substrats comprennent le glucose, un lactate ou l'acide lactique, un gluconate, etc.

Les schémas réactionnels suivants illustrent la recherche du glucose par l'utilisation des co-enzymes ATP et NAD.

20

25

30

HK

GLUCOSE+ATP^ZZZZÎG-6-P+ADP G-6-PDH

n-ft-P+NTAn c ■> NADH+ACIDE 6- PHOSPHOGLUCONIQUE

L'enzyme qui produit la réaction principale et l'hexoqui-nase, et l'enzyme qui déclenche la réaction de couplage et de mesure est l'enzyme G-6-PDH. Dans la réaction ci-dessus, le glucose est dosé par mesure de la quantité de NADH qui est formée dans la réaction de mesure. On laisse la réaction s'accomplir et on mesure essentiellement la quantité formée du co-enzyme NADH.

Le co-enzyme NAD, bien qu'étant instable dans l'eau et sous la forme sèche lorsqu'il est exposé à des milieux humides, est loin d'être aussi instable que la forme réduite NADH2. Par conséquent, cette dernière forme doit être maintenue à l'abri de l'humidité, tandis que le co-enzyme NAD peut être emballé dans un récipient avec une solution aqueuse, mais stabilisée conformément au procédé de l'invention. La stabilité est meilleure à un pH acide, tandis qu'à

un pH alcalin, le co-enzyme NAD a tendance à se décomposer. Le mécanisme exact n'a pas plus d'importance que n'en ont les produits finals, excepté que le co-enzyme NAD décomposé ne peut plus fonctionner efficacement comme un co-enzyme, pas plus qu'il ne possède le coefficent d'extincion à la longueur d'onde nécessaire.

L'un des avantages remarquables de la présente invention réside dans le fait que tous les composants peuvent être stabilisés dans un seul et même flacon à réactif. Généralement, il y a deux considérations principales dans la formulation d'un enzyme ou d'un co-enzyme stabilisé. La première de ces considérations est d'obtenir un enzyme ou co-enzyme très stable dans un milieu liquide et la seconde est de limiter autant que possible le nombre d'emballages. Dans la stabilisation de co-enzymes tels que NAD, on a observé que le co-

60

5

631208

enzyme NAD est beaucoup plus stable que NADH. En conséquence, il n'est pas nécessaire d'utiliser des techniques complexes de stabilisation qui s'imposent pour NADH. Tous les réactifs peuvent donc être emballés en une solution unique.

Dans la stabilisation des enzymes et des co-enzymes selon la présente invention, un polymère tel qu'une gélatine est avantageusement dissous dans l'eau distillée. Le polymère est de préférence présent dans la solution stabilisée en proportion telle qu'il reste en suspension homogène à l'état réfrigéré, sans précipitation. Le polymère est par exemple présent en une quantité d'environ 0,01 à environ 0,5% sur la base de la coposition totale, de préférence en proportions de 0,05 à environ 0,25%. Tous polymères hydrosolubles qui n'inhibent pas l'activité enzymatique et qui sont capables d'emprisonner l'enzyme dans la masse polymère sont intéressants à utiliser dans cette forme d'exécution de la présente invention. Le polymère peut être une matière synthétique ou organique, par exemple la polyvinylpyrrolidone ou un dextrane d'origine biologique, par exemple gélatine, qui consiste en colla-gène dénaturé.

Le polymère peut être dissous dans l'eau par chauffage, généralement au-dessus de 30°C. La vitesse à laquelle le polymère est dissous augmente avec la température.

Lorsque le polymère s'est complètement dissous dans l'eau, on peut ajouter un azoture tel que l'azoture de sodium, de préférence en quantité d'environ 0,1% en poids/poids. Toutefois, la quantité d'azoture que l'on ajoute peut aller d'environ 0,01 à environ 0,5%. On a constaté, que l'azoture a pour effet surprenant de favoriser la stabilité des enzymes. Auparavant, on pensait que l'azoture jouait le rôle d'un agent bactériostatique ou bactéricide. Néanmoins, bien que le mécanisme complet de stabilisation avec l'azoture, en association avec les autres ingrédients, ne soit pas entièrement élucidé, il a été établi que l'azoture confère une meilleure stabilité. Dans de nombreux cas, l'azoture n'est pas nécessaire et peut être éliminé. Ainsi, le polymère.et le solvant organique en milieu aqueux sont souvent suffisants pour stabiliser les composants labiles. Dans quelques cas peu nombreux, l'azoture doit être éliminé dans la mesure où il peut avoir tendance à interférer avec la stabilisation, ou à affecter matériellement d'une autre façon un substrat tel que le glucose, par exemple. Outre ce qui précède, d'autres agents bactéricides ou d'autres fongicides qui ne réagissent pas chimiquement avec un substrat ou qui n'inhibent pas la réaction enzymatique peuvent être utilisés. Par exemple, certains des agents que l'on peut utiliser en plus de l'azoture de sodium sont l'acide benzoïque, le phénol, le thymol ou le pentachlorophénol.

Dans quelques cas, il peut être désirable d'utiliser un métal tel que le magnésium, que facilite le déclenchement d'une réaction lorsque la composition stabilisée est utilisée. Le magnésium, sous la forme saline de chlorure de magnésium, constitue l'un des agents que l'on préfère utiliser à cette fin. Cet agent n'a pas à être incorporé aux compositions stabilisées et peut être ajouté au moment de l'utilisation.

Cet agent qui active les enzymes de couplage devrait être utilisé en une quantité d'environ 0,01 à environ 1% et de préférence en quantité d'environ 0,03%.

A ce stade du procédé, la solution peut être refroidie à une température de l'ordre de la température ambiante, par exemple entre environ 20 et environ 25°C au bain-marie. Lorsque la solution s'est refroidie, on peut y ajouter un agent tampon tel que le tris(hydroxyméthyl)aminométhane. Cet agent tampon est ajouté, par exemple, en quantité d'environ 50 à environ 200 mmoles, mais au moins suffisante pour maintenir le pH dans une gamme de 6,0 à environ 8,5. D'autres agents tampon connus et d'autres formes d'agents tampons peuvent aussi être utilisés dans le procédé. Dans quelques cas, des sels tampons du type défini ci-après peuvent être utiilsés. Le sel tampon est ajouté en quantité nécessaire pour maintenir le pH entre 6,0 et 8.5. Généralement, le tampon consiste en une association de 0,1 à 1% d'un hydro-xyde de métal alcalin et de 0,5 à 3% d'un carbonate ou phosphate acide de métal alcalin. La teneur totale en sel affecte également la quantité de polymère requise.

Pour une teneur plus forte en sel, par exemple au-dessus de 4% en poids, une moins grande quantité de polymère est requise à cause de la stabilisation électrostatique produite par le sel. Toutefois, pour une teneur élevée en sel, le polymère peut troubler la solution ou précipiter, et sa redissolution nécessite de chauffer la solution.

Lorsque le pH de la solution a été ajusté à la valeur désirée, le premier des co-enzymes, par exemple ATP ou NAD, etc., peut être ajouté. Dans ce cas, le co-enzyme ATP est ajouté sur une base d'environ 0,3 à environ 30 mmoles, par rapport à la composition totale.

Comme indiqué dans ce qui précède, il est possible de former des solutions des enzymes et des co-enzymes stabilisés. Ainsi, deux ou plusieurs co-enzymes et doux ou plusieurs enzymes peuvent être stabilisés dans la même solution. Par exemple, le co-enzyme ATP peut être stabilisé de la manière décrite dans le présent mémoire. Par ailleurs, le co-enzyme NAD peut aussi être stabilisé individuellement de la manière décrite dans le présent mémoire. Néanmoins, lorsqu'on stabilise deux ou plusieurs co-enzymes, ces co-enzymes peuvent en général être ajoutés simultanément ou dans un ordre quelconque. Le co-enzyme NAD est de préférence ajouté en proportion comprise entre environ 0,6 et environ 60 mmoles sur la base de la composition totale.

A ce stade du procédé, le pH devrait là encore être ajusté à une valeur au moins comprise dans la gamme de 6,5 à environ 8,0 ou moins et de préférence à une valeur de 7,5.

Après avoir ajusté le pH, on peut ajouter un solvant organique convenable tel que le glycérol. On l'ajoute alors en proportion comprise dans la gamme de 25 à 40% en volume/ volume, bien que dans le cas le plus avantageux, la proportion ajoutée de solvant organique soit de 30% en volume/ volume. Toutefois, la quantité de solvant organique peut aller d'environ 5 à 70% en volume/volume.

Le solvant organique devrait présenter les caractéristiques suivantes:

1. Gamme de pH de 4 à 10

2. Liquide à la température ambiante et à la température du réfrigérateur

3. Pas de réaction avec NAD ou ATP, etc, hormis la formation de liaisons électrostatiques (c'est-à-dire de liaisons hydrogène)

4. Miscible à l'eau

5. L'énergie libre normale de solvolyse est faible (une résonance normale est établie)

Des solvants intéressants à utiliser sont en général des solvants organiques stables tels que des éthers, des cétones, des sufones, des sulfoxydes et des alcools tels que le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, l'acétone, le dioxanne, le diméthyl-sulfoxyde, la diméthylsulfone et le tétrahydrofu-ranne. Toutefois, les solvants du type des polyols liquides ont une plus grande activité pour une plus faible concentration en solvant dans l'étape de traitement. On donne la préférence à des polyols liquides contenant deux à quatre groupes hydroxyle et deux à dix atomes de carbone, tels que le glycérol, l'éthylène-glycol, le propylène-glycol ou le butane-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

631208

6

diol. Le glycérol, le propylène-glycol, le 1,2-propane-diol ont toutes ces qualités et constituent les solvants de choix.

Lorsque le solvant organique choisi est un polyol, il n'est pas nécessaire d'utiliser l'azoture ni d'autres agents actério-statiques, attendu que le polyol joue effectivement le rôle d'un agent bactériostatique. Néanmoins, bien que le solvant choisi et le polymère offrent la stabilité requise dans une solution aqueuse, l'azoture est parfois préférable, pour autant qu'il semble favoriser le couplage entre le polymère et les enzymes.

Lorsque le glycérol ou un autre polyol a été ajouté, le pH de la solution ainsi formée est réajusté. Par exemple, le pH peut être légèrement basique et on peut donc l'ajuster par addition d'acide chlorhydrique normal. De même, si le pH est légèrement acide, une base convenable peut être ajoutée pour qu'il atteigne la valeur de 7,5.

Le co-enzyme NAD devrait être résent en excès. Comme indiqué, le dosage du glucose est effectué par mesure de la formation de NADH à partir de NAD. La forme NADH est instable en milieu acide et elle se dégrade à un pH égal à 6; sa dégradation est même extrêmement rapide à un pH égal à 4. Le pH de la solution est donc maintenu au-dessus d'un pH neutre (au-dessus de 7). Bien que le co-enzyme NAD soit réellement plus stable en milieu acide, on a constaté, qu'il ne se dégrade pas notablement dans un milieu légèrement basique de pH égal à 7,5. Néanmoins, le co-enzyme NAD est ajouté de préférence en excès considérable, de sorte qu'il y a toujours une quantité suffisante de NAD non dégradé, même après un séjour de plusieurs années dans ce milieu liquide.

Généralement, tous les co-enzymes sont présents en une quantité au moins suffisante pour effectuer le dosage désiré. Il n'existe normalement pas de limite maximale concernant la quantité de co-enzyme qui est présente, la quantité maximale étant toutefois limitée par des conditions d'ordre commercial.

Après que les co-enzymes ont été ajoutés à la solution liquide liquide, les enzymes choisis peuvent être introduits. Comme dans le cas des co-enzymes, les enzymes peuvent être ajoutés dans un ordre quelconque. Là encore, un ou plusieurs enzymes peuvent être ajoutés à la solution. Selon l'aspect préféré de l'invention, et conformément au système enzymatique identifié ci-dessus, les deux enzymes sont HK et G-6-PDH. L'enzyme HK est également ajouté, de préférence en une quantité qui n'est pas inférieure à 111 unités internationales par litre (pH 7,6,25°C). Toutefois, il est préférable d'ajouter au moins 1000 unités internationales de HK par litre.

L'enzyme G-6-PDH doit de préférence être formé à partir de bactéries du type L-mesenteroides et il doit être concentré dans une gamme d'environ 100 à environ 30 000 unités internationales par litre ou plus. Selon un aspect avantageux de l'invention, on utilise normalement environ 3000 unités internationales de G-6-PDH de ce type, à un pH d'environ 7,8 à 25°C.

Les enzymes devraient être présents, chacun en une quantité d'au moins 100 unités internationales par litre, bien que dans la plupart des réactifs commerciaux, l'enzyme tel que l'hexoquinase doit être présent au moins en une quantité de 1000 unités internationales par litre. Dans les emballages commerciaux normaux, l'enzyme est présent en quantité d'environ 1000 à 10 000 unités internationales à un pH égal à 7,6 et à une température d'environ 25°C. Toutefois, la quantité maximale d'enzyme est illimitée, bien que normalement, dans presque toutes les applications la quantité d'enzyme ne dépasse pas 100 000 unités internationales.

Bien que le mécanisme entier d'accomplissement de la stabilisation des enzymes et des co-enzymes ne soit pas entièrement élucidé, on suppose que le solvant choisi stabilise l'enzyme dans le milieu liquide en protégeant le site d'un groupe fonctionnel, c'est-à-dire la partie de la molécule où une réaction peut réellement avoir lieu avec un substrat ou est autrement catalysée.

On suppose que la stabilisation a lieu par protection des enzymes et des co-enzymes d'une contamination microbienne et, par conséquent, d'une dégradation.

Le co-enzyme NAD diffère du co-enzyme NADH en ce que NAD ne se dissout pas en quantité notable dans le solvant choisi tel que le propylène-glycol. Toutefois, le co-enzyme NAD est plus stable dans l'eau et il ne semble pas être stabilisé par le polyol. Un polyol pur dénature les enzymes, mais en présence d'une solution aqueuse telle qu'un mélange d'eau et d'un solvant, les enzymes ne sont pas dénaturés. Apparemment, un groupe populaire doit être présent dans le solvant organique pour maintenir les sites actifs des enzymes dans un état stable. Evidemment, une certaine forme de réaction physique ou chimique a lieu dans le milieu concentré formé d'eau et d'un solvant organique, pour autant que les enzymes et les co-enzymes gardent leur activité catalique et ne se dégradent pas aux concentrations spécifiées.

Outre les indications données ci-dessus, le polymère semble réagir d'une certaine façon avec l'azoture pour former une liaison électrostatique ou liaison de covalence entre les enzymes et le polymère. Il peut apparaître également que le polymère s'allonge en encapsulant en quelque sorte, et par conséquent en protégeant, les sites actifs des enzymes. De cette façon, une dénaturation des enzymes ou toute autre forme de dégradation est inhibée ou n'a pas lieu.

Comme indiqué ci-dessus, il est possible de stabiliser au moins deux ou plus de deux co-enzymes ou au moins deux ou plus de deux enzymes dans la même solution.

En outre, et cela importe davantage, il est possible de stabiliser à la fois des enzymes et des co-enzymes dans la même solution. On présume que la solution aqueuse du solvant organique est le facteur principal dans la stabilisation du co-enzyme, bien que le polymère ne semble pas exercer d'effet stabilisant. Dans la stabilisation de l'enzyme, le solvant organique et le polymère semblent être les principaux facteurs desquels la stabilisation résulte. En outre, et dans de nombreux cas, l'azoture contribue à améliorer la stabilisation. Dans les deux cas, on peut observer que les enzymes et les co-enzymes se trouvent encore à la fois dans la même solution unique.

Quelques-unes des autres réactions qui ont été conduites avec les compositions d'enzymes et de co-enzymes stabilisés sont indiquées ci-après. La réaction impliquant la phospho-rylation de la créatine est la suivante:

CK

CREATINE+ATP ^ > CP+ADP ^ph 8-9

Les autres réactions s'expliquent toutes d'elles-mêmes et se réfèrent à la liste des symboles donnés ci-dessus. Pour une réaction de NADP, le schéma est le suivant:

G-6-PDH

G-6-P+NADP t *> NADPH+Acide

6- phosphogluconique pour une réaction de ADP, le schéma est le suivant:

CK

CP+ADP / >CREATTNE+ATP

1 ph 6-7

Pour le schéma suivant, la réaction de départ créatine + ATP serait utilsée pour produire le co-enzyme ADP:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

631208

PK

ADP+PF.P ^ ^ ATP+pyruvate LDH

Pyruvate+NADH ^ZZZZ^Lactate+NAD

Les réactions suivantes illustrent l'utilisation des enzymes uréase et GLDH dans les compositions liquides stabilisées.

UREASE UREE c *> 2NH4++CO2

pH 6-8

GLDH

NH4++ a-cétoglutarate+ NAD ^ZZZZZZZZÉ Glutamate+

NADH

L'invention est illustrée en outre par les exemples suivants.

Exemple 1

On ajoute environ 0,7 g d'un polymère de gélatine à environ 700 ml d'eau. Cette solution est ensuite chauffée au-dessus de 30°C pour dissoudre le polymère de gélatine.

Après l'addition du polymère, la solution est plongée dans un bain-marie de manière à réduire sa température à environ 22°C.

Le pH est ensuite ajusté entre 6,5 et 8,0. Lorsque la température a été réduite et que le pH a été ajusté, on ajoute environ 2,0 g de ATP à la solution puis 4,0 g de NAD. On ajoute 3 g de chlorure de magnésium en même temps que le co-enzyme NAD. On ajoute ensuite 300 ml de glycérol.

Après l'addition du glycérol, on ajuste le pH à environ 7,5 par addition d'acide chlorhydrique IN. Après dissolution totale, on verse la solution dans un récipient en matière plastique ou en verre, qu'on ferme ensuite. On rend les récipients étanches et on les conserve au réfrigérateur. On a constaté qu'une composition de co-enzyme stabilisé préparée de cette manière a une stabilité à l'entreposage qui atteint quatre ans sans dégradation notable.

Exemple 2

L'échantillon produit conformément à l'exemple 1 est additionné de l'enzyme exoquinase puis placé dans le récipient étanche en verre. On obtient la même durée de conservation, sans dégradation notable.

Exemple 3

Le même échantillon de l'exemple 2 est également additionné de l'enzyme G-6-PDH puis enfermé de façon étanche dans le récipient en verre; on obtient la même longévité, sans dégradation appréciable.

Exemple 4

On ajoute environ 1,0 g d'un polymère de dextrane à environ 700 ml d'eau. On chauffe ensuite cette solution au-dessus de 30°C pour dissoudre le polymère. On maintient la solution au bain-marie pour réduire la température à environ 22°C.

Lorsque la température a été réduite, on ajoute environ 2,2 g de NADP à la solution puis 4,0 g de ATP. On ajouste le pH de la solution dans la gamme de 6,5 à 8,0. On ajoute ensuite 325 ml de glycérol.

Après l'addition du glycérol, on ajuste le pH à environ 7,5 par addition d'acide chlorhydrique IN. Lorsque la dissolution totale a été obtenue, la solution est introduite dans un récipient en matière plastique ou en verre qui est ensuite fermé. Les récipients sont bouchés de façon étanche et conservés au réfrigérateur. On a trouvé qu'une composition de co-enzyme stabilisé est à peu près aussi efficace que la composition de l'exemple 1, bien que l'azoture n'ait pas été ajouté.

Les exemples suivants sont présentés de façon schématique pour indiquer les réactifs et les quantités ajoutées dans les diverses étapes importantes de production des compositions stabilisées de la présente invention.

Exemple 5 ADP, AMP et NAD stabilisés environ 700 ml d'eau 0,5 g de gélatine dissoudre à chaud 0,7 g d'azoture de sodium laisser refroidir à la température ambiante 50 g de phosphate de créatine 4 g de ADP 20 g de AMP 15 g de NAD

dissoudre et ajuster le pH entre 7 et 9 300 ml de glycérol agiter et réajuster le pH

verser dans une bouteille et boucher de façon étanche

Exemple 6

ADP, AMP, NAD, HK et G-6-PDH stabilisés On ajoute environ 300 à environ 15 000 unités internationales de G-6-PDH par litre et environ 100 à environ 10 000 unités internationales de HK par litre à la solution de l'exemple 5, avant la mise sous emballage.

Exemple 7

1,5 g de NAD

dissoudre dans 5ml d'eau ajouter 5 ml de glycérol ajuster le pH à une valeur inférieure à 5

Exemple 8 Stabilisation de NAD et HK 1,5 g de NAD

Dissoudre dans 10 ml de tampon (ph 7) d'acide pipéra-

zine-[bis]-éthane-sulfonique 0,1 M

ajuster le pH à 6-7

ajouter 10 ml de glycérol réajuster le pH

ajouter et dissoudre 10 mg de HK d'activité égale à 150 unités internationales par milligramme.

Exemple 9

Stabilisation de la créatine, de ATP et de PEP 1000 ml d'eau ajouter 12,1 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane ajouter 1,0 g de gélatine dissoudre en chauffant au-dessus de 30°C

laisser refroidir à la température ambiante ajouter 2,0 g de ATP

ajouter 2 g de PEP

ajouter 10,0 g de créatine dissoudre et ajuster le pH à 9.

Exemple 10

On ajoute à la solutionj stabilisée de l'exemple 9 100 à

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

631208

10000 unités internationales de LDH par litre etlOOàlOOOO unités internationales de DK par litre, avant la mise sous emballage.

Les compositions des exemples 5 à 10 ont toutes la même longévité, sans aucune dégradation appréciable. De plus, chacun des exemples précédents a été basé sur des échantillons réellement préparés et éprouvés conformément à la présente invention.

B

Claims

631208

2

REVENDICATIONS

1. Procédé de stabilisation d'une composition contenant un co-enzyme labile, un enzyme labile ou un mélange des deux utilisés dans des dosages pour le diagnostic biologique, cet enzyme et ce co-enzyme coopérant pour agir sur la réactivité d'un constituant biologique utilisé dans un dosage pour diagnostic biologique et étant normalement instables dans un milieu aqueux, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste:

(a) à mélanger de l'eau avec un solvant organique inerte miscible à l'eau pour former une solution aqueuse dudit solvant organique, ledit solvant étant liquide au moins à la température ambiante;

(b) à ajouter une quantité au moins suffisante par litre d'un co-enzyme labile, d'un enzyme labile ou de leur mélange à ladite solution pour effectuer un dosage, par dissolution dans ladite solution et participation à une réaction de dosage,

(c) à ajuster le pH dans une gamme de 6,0 à 8,5 et

(d) à placer la composition sous emballage étanche.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que

(a) le solvant est présent dans une proportion de 5 à 70% en volume par volume de solution,

(b) qu'on ajoute au moins 100 unités internationales par litre de l'enzyme labile ou du co-enzyme labile.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit enzyme est choisi entre la glucose-6-phosphate-dés-hydrogénase, l'hexokinase, la glutamate-déshydrogénase, la créatine-phosphokinase, la pyruvate-kinase et une Phosphatase alcaline et ledit co-enzyme est choisi entre le nicotina-mide-adénine-dinucléotide, le triphosphate d'adénosine, le 5'-diphosphate d'adénosine, le phosphate de nicotinamide-adénide-dinucléotide et le monophosphate d'adénosine.
4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste également à ajouter un second enzyme ou co-enzyme à ladite solution, qui y est également stabilisé, après ajustement du pH.
5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en outre en ce que le solvant a un pH compris 4 et 10, est liquide à la température ambiante et à la température du réfrigérateur, ne réagit pas avec les enzymes ou les co-enzymes autrement que par formation de liaisons électrostatiques (c'est-à-dire des liaisons hydrogène), est miscible à l'eau et a une faible énergie libre de solvolyse (résonance normale).
6. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à dissoudre dans ladite composition un polymère hydrosoluble qui n'inhibe pas sensiblement l'activité enzymatique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère et de la gélatine présente dans la solution dans une proportion comprise entre 0,01 et 0,5%.
8. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en outre en ce que le solvant est ajouté de manière à être présent en quantité 25 à 50 et de préférence 25 à 40% en volume.
9. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le solvant est un polyol contenant deux à 10 atomes de carbone et 2 à 4 groupes hydroxyles.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on ajoute un agent bactériostatique par exemple un azoture, qui joue également le rôle d'un agent stabilisant l'enzyme.