DE2823824C2 - - Google Patents

Description

Alkalische Phosphatase ist ein Leberfunktionsenzym, findet sich aber auch in Knochen und Därmen von Mensch und Tier. Ein erhöhter Gehalt an alkalischer Phosphatase weist meist auf eine Funktionsstörung der Leber hin.

Reagenzien für die Phosphatasebestimmung sind bekannt aus "Die Naturwissenschaften", Jahrgang 40, (1953), Seiten 460 bis 461, und "Röntgen- und Laborpraxis", Jahrgang VII, Heft 4, Seiten 113 bis 121: "Die Bestimmung der Serumphosphatase im klinischen Laboratorium". In "Die Naturwissenschaften" a. a. O. werden als Substrate beispielsweise β-Glycerophosphat, Phenylphosphat, Phenolphthaleinphosphorsäure, Eosionphosphor­ säure- und Fluorescein-phosphorsäureester genannt, während in "Röntgen- und Laborpraxis" a. a. O., Seite 119, Zeilen 6 bis 8, ausgeführt wird, daß die Verwendung von p-nitrophenylphosphor­ saurem Natrium, Eosin und Fluorescein-phosphorsäureestern als Substrate für Phosphatasebestimmungen sich nicht einfüh­ ren konnte. Beide Literaturstellen nennen den Zusatz von Thymol zu der Lösung, wozu aber in "Die Naturwissenschaften" a. a. O., Seite 460, rechte Spalte, Zeilen 15 von unten sq., ausgeführt wird, daß das Substrat in der Kälte (+1°C) in Lö­ sung unter Thymolzusatz nur über 8 Wochen ohne Zersetzung haltbar ist.

Die alkalische Phosphatase spaltet bei alkalischem pH die Phosphatgruppe von dem Substrat ab. Bestimmt wird die Menge der in einer bestimmten Zeit durch Umsetzen des Substrats mit der Phosphatase gebildeten Phosphationen. Die Zeit, die zwischen der Herstellung eines solchen Prä­ parats und seiner Verwendung verstreicht und die die Lage­ rung bei der Herstellerfirma, beim Verteiler und im klini­ schen Labor sowie Transportzeiten umfaßt, ist aber im allge­ meinen wesentlich länger als die 8 Wochen gemäß "Die Natur­ wissenschaften" a. a. O., so daß eine vorzeitige Zersetzung un­ vermeidbar ist.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Herstellung einer unter Kühlen über einen längeren Zeitraum stabilen Lösung von p-Nitrophenolphosphat als Substrat für die Bestimmung alkali­ scher Phosphatase für Diagnosezwecke.

Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren gemäß Patentan­ spruch zur Herstellung einer solchen Lösung.

Gemäß der Erfindung wird also einer p-Nitrophenolphosphat­ lösung, die als Substratlösung für die Bestimmung alkalischer Phosphatase verwendet werden soll, als Stabilisierungsmittel statt des hierfür bekannte Thymols Phenol zugesetzt. Es wur­ de gefunden, daß durch diesen Zusatz bei Einhaltung eines pH der Lösung von 8,0 bis 9,5 Präparate erhalten werden, die über einen Zeitraum von 1 bis 2 Jahren stabil sind.

Die stabilisierte Lösung wird zweckmäßig in bernsteinfarbene Glasflaschen abgefüllt, und diese werden luftdicht ver­ schlossen und unter Kühlen aufbewahrt.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

0,8 Mol 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP) werden zu Magne­ siumaspartat in einem wäßrigen Medium zugesetzt, und die Lö­ sung wird mit einer geringen Menge Salzsäure versetzt, so daß ein Puffer vom pH 10,2 erhalten wird.

Dann wird p-Nitrophenolphosphat mit Phenol in trockener Form vermischt und das Gemisch einer wäßrigen Lösung in solcher Menge zugesetzt, daß das p-Nitrophenolphosphat in einer Menge von 1 Mol/l und das Phenol in einer Menge von 1,5 Mol/l an­ wesend ist. Außerdem wird Triethanolamin zur Einstellung des pH auf 8,6 und weiteren Verzögerung der Hydrolyse des p-Nitro­ phenolphosphats zugesetzt. Die Lösung wird mit destilliertem Wasser zu einer Substratmasse aufgefüllt.

Nachdem eine vollständige Lösung erzielt ist, wird die Puffer­ lösung in einen Plastik- oder Glasbehälter eingebracht, der dann verschlossen wird. In gleicher Weise wird die Substrat­ lösung in einen bernsteinfarbenen Plastik- oder Glasbehälter eingebracht, der dann verschlossen wird. Die Behälter werden abgedichtet und unter Kühlen gelagert. Eine in dieser Weise stabilisierte Masse hat eine Lagerstabilität von bis zu 2 Jahren ohne merklichen Abbau.

Beispiel 2

Substrat und Puffer, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrie­ ben, werden miteinander vermischt, und dem Gemisch wird eine alkalische Phosphatase enthaltende Körperflüssigkeit zuge­ setzt. Der pH des Gemisches dieses Anwendungsbeispiels be­ trägt 10 bis 10,5. Das als Stabilisator anwesende Phenol be­ einträchtigt die Umsetzung mit der alkalischen Phosphatase offensichtlich nicht. Die Phosphatgruppe des p-Nitrophenols wird von dem p-Nitrophenolphosphat abgespalten und ergibt eine Grundlage für die Bestimmung der alkalischen Phosphatase.

Beispiel 3

Magnesiumacetat wird anstelle des Magnesiumaspartats in Bei­ spiel 1 und in der gleichen Menge wie dieses verwendet. Der pH-Wert des Gemisches beträgt 8,6. Auch dieses Substrat zeigt die gleiche Lagerbeständigkeit ohne wesentlichen Abbau.

Beispiel 4

Magnesiumchlorid wird anstelle des Magnesiumaspartats von Beispiel 1 in der gleichen Menge wie das Magnesiumaspartat in Beispiel 1 verwendet (pH des Gemisches 8,6). Auch dieses Substrat zeigt die gleiche Lagerbeständigkeit ohne beträcht­ lichen Abbau.

Beispiel 5

Triethanolamin wird anstelle des AMP von Beispiel 1 in der gleichen Menge wie das AMP in Beispiel 1 verwendet (pH 8,6). Auch dieses Substrat zeigt die gleiche Lagerbeständigkeit ohne beträchtlichen Abbau.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung einer Lösung von p-Nitrophenol­ phosphat mit verbesserter Stabilität als Substratlösung für die Bestimmung alkalischer Phosphatase, dadurch gekennzeichnet, daß man das p-Nitrophenol­ phosphat mit der ein- bis zweifachen molaren Menge an Phenol vermischt und das Gemisch in einem wäßrigen Medium bei einem pH von 8,0 bis 9,5 auflöst.