DE1915803A1

DE1915803A1 - Verfahren zur Herstellung von Zellkulturkonzentraten

Info

Publication number: DE1915803A1
Application number: DE19691915803
Authority: DE
Inventors: Christensen Verle Wayne
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1968-03-28
Filing date: 1969-03-27
Publication date: 1969-10-02
Also published as: US3592740A; GB1205733A

Description

Beschreibung zu der Patentanmeldung

MILES LABORATORIES, INC. 1127 Myrtle Street, Elkhart, Indiana 465H, U.S.A.

betreffend: "Verfahren zur Herstellung von Zellkulturkonzentraten"

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von hoch aktiven Konzentraten von auf einem Milchmedium gezüchteten Bakterienzell'enj die erfindungsgemäßen Zellkulturkonzentrate können auf übliche Weise verwendet werden zur Beimpfung von Großkulturen oder unmittelbar zur Beimpfung von kleineren Einzelansätζen von Milch zwecks Herstellung von Käse und anderen gesäuerten Milchprodukten.

Bei der Käseerzeugung wird Milch mit einer Bakterienkultur

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und mit einem das- Gerinnen der Milch bewirkenden Mittel, wie Rennin (Labferment) behandelt, so daß eich zunächst ein verfestigter Quark bildet, der dann von der Molkeflüssig- ,-. keit abgetrennt wird. Der Quark wird dann weiter verarbeitet und verfestigt und bildet schließlich als Endprodukt Käse. Die Bakterienkultur, die auch als "Ausgangskultur" bezeichnet wird, wird verwendet, um Milchsäure in Freiheit* zu setzen, damit die gewünschten sauren Bedingungen für die Käsebereitung vorhanden sind. Die Ausgangskultur erzeugt auch die gewünschten Eigenschaften des als Endprodukt erhaltenen Käses, wie Aroma, Konsistenz (Körper), Gefüge und Geruch.

In einer typischen Käserei wird eine durch Gefriertrocknung haltbar gemachte Bakterienkultur verwendet, um ein relativ kleines Volumen (etwa 0,6 1) sterilisierter Magermilch zu beimpfen, welche etwa 10 bis 12 % (Gewicht/Volumen) Gesamtfeststoffe enthält* Das Gemisch wird dann bebrütet, um eine Vermehrung der Bakterien im gewünschten Umfang herbeizuführen. Die resultierende Kultur wird dann in einer Menge von 1 %. dazu verwendet, eine Menge von etwa 11,4 1 teilweise sterilisierter Magermilch zu beimpfen. Das Gemisch wird dann bebrütet, um eine "Mutterkultur" zu bilden. Die Mutterkultur wird dann in ihrem ganzen Umfang - dazu verwendet, etwa 1140 1 teilweise sterilisierte Magermilch zu beimpfen. Das beimpfte Gemisch wird dann bebrütet und man erhält eine "Ausgangs-Großkultur", die dann ihrerseits in Mengen von 1 Vol.-$ dazu verwendet wird, kleinere Produktionsansätze von pasteurisierter oder wärmebehandelter Milch zu beimpfen» Diese Produktionsansätze von beimpfter Milche die Insgesamt etwa 114 000 l·, darstellen, werden dann zur Käsebereitung verwendet.

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Das bekannte Verfahren hat mehrere Nachteile für den Käse-

hersteiler. Erstens erfordert es viele einzelne Wachstumsstufen, bis die Ausgangsgroßkultur hergestellt ist, die dann dazu verwendet wird, die einzelnen Milchansätze zu beimpfen. Solche vielfachen Wachstumsstufen erfordern aber Zeit, Laborraum und eine besondere Ausrüstung. Zweitens bietet sich auf jeder Beimpfungs- und Vermehrungsstufe Gelegenheit zur Verunreinigung durch unerwünschte Mikroorganismen und Bacteriophagen.

In einem Versuch, diese Nachteile zu überwinden, wurde bereits vorgeschlagen, man möge ein Bakterienkulturkonzentrat herstellen, das in'kleinem Volumen unmittelbar zum Beimpfen von Milch verwendet werden könnte, um daraus die Ausgangsgroßkultur zu bilden. Dieses Konzentrat wurde im allgemeinen hergestellt durch Vermehren der gewünschten Bakterienkultur in einem anderen Medium als Milch, bis eine gewünschte Anzahl von Bakterienzellen produziert worden waren. Diese Zellen wurden dann von dem flüssigen Teil des Mediums abgetrennt. Das Konzentrat konnte dann unmittelbar dazu benutzt werden, die Großkultur zu beimpfen oder wurde vorzugsweise eingefroren und in gefrorenem Zustand aufbewahrt, bis es benötigt wurde. Das Zellenkonzentrat konnte auf diese Weise an einem beliebigen Ort hergestellt und in gefrorenem Zustand an eine Reihe von. Käsereien an anderen Orten zum Gebrauch verschickt werden. Diese bekannten Zellkulturkonzentrate waren leider im allgemeinen nicht brauchbar. Ihre Wirksamkeit konnte nur zum Teil wieder aktiviert werden und es bedurfte daher meist unerwünscht langer Verarbeitungszeiten, um die nötige Koagulation der Milch und die Käseerzeugung in Gang zu bringen.

Demgegenüber kann das erfindungsgemäße Verfahren *zur Herstellung von Zellkulturkonzentraten unmittelbar dazu verwendet werden,

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große Mengen Milch für die Erzeugung von Käse oder anderen auf Bakterienkultur beruhenden Milchprodukten zu beimpfen.

Das erfindungsgemäß hergestellte Zellkulturkonzentrat ist außerdem hinsichtlich seiner Fähigkeit Milchsäure zu produzieren, wesentlich verbessert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Zeil- . konzentraten ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein flüssiges gepuffertes milchhaltiges Kulturmedium mit einer Milchsäure produzierenden Bakterienkultur beimpft, das beimpfte Medium bebrütet, um darin Bakterienkulturzellen solange zu vermehren,, bis ein gewünschter pH-Wert erhalten ist, worauf man alkalische Stoffe zufügt, um den mittleren pH-Wert auf einen gewünschten Stand zu bringen, das Medium kühlt und die Bakterienkulturzellen von dem flüssigen Teil des Kulturmediums abtrennt, um ein Zellkulturkonzentrat zu erhalten.

Die für das Verfahren verwendbaren Milchsäure produzierenden Bakterienkulturen sind irgendwelche Kulturen, von denen bekannt ist, daß sie bei der Erzeugung von Käse und anderen Milchprodukten verwendbar sind. Beispiele sind u.a. Streptococcus Iactis,.Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis u.dgl.

Ein wesentlicher Teil der Erfindung ist das gepufferte, milchhaltige Kulturmedium. Wenn die Kulturzellen zur Erzeugung des Zellkulturkonzentrates in einem milchheltigen Medium vorhanden sind, erhalten sie keinen Schock hinsichtlich ihrer Milchsäure produzierenden Stoffwechselaktivität, wenn das Konzentrat später einem Milchmedium, z.B. zwecks Erzeugung einer Groß-

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kultur,,. zugegeben wird. Hierdurch wird das Zellkulturkonzentrat instand gesetzt, seine Fähigkeit zur Erzeugung von Milchsäure bei der Verwendung voll-aufrechtzuerhalten.

Das Kulturmedium sollte etwa 3 bis 8 %, vorzugsweise etwa .. 5 °/o (Gewicht/Volumen) nicht fettartige Feststoffe enthalten. Wird der Wert von 3 % unterschritten, so vermehren sich die Zellen ungenügend und die Säureproduktion verlangsamt sich, wenn die Kultur später einem Milchmedium zugefügt wird. Eine Steigerung der nicht fettartigen Feststoffe im Kulturmedium über etwa 8 °/o hinaus bietet keine besonderen Vorteile. Gegebenenfalls kann ein Teil der nicht-fettartigen Milchfeststoffe durch geringere Mengen von entminerälisiertem Molkepulver oder.Lactose ersetzt werden. Die Gesamtmenge an nicht-fettartigen Milchfeststoffen und etwa vorhandenen Ersatzstoffen sollte jedenfalls stets zwischen etwa 3 und 8 fo liegen.

Erfindungsgemäß wird das Kulturmedium durch Zusatz von Phosphatsalzen in einer Menge von etwa 1,25 bis 2 % (Gewicht/Volumen) auf einen Anfangs-pH-Wert von etwa 6,4 bis etwa "( gepuffert. Mindestens 50 Gew.-^ der Phosphatsalze sind Ammoniumphosphate. Die Phosphatsalzej wie Diammoniumphosphat, Monoammoniumphosphat, Dinatriumphosphat u.dgl. sorgen nicht nur für den gewünschten pH-Wert, der das Zellenwachstum begünstigt, sondern sie binden auch die im Kulturmedium anwesenden Calciumionen und andere zweiwertige Kationen. Die Bacteriophagen, welche das normale Zellenwachstum auf das schwerste stören können, brauchen Calcium- und andere zweiwertige Kationen für ihre Vermehrung. Die Anwesenheit der Phosphatsalze in der Kultur verhindert daher -stark die Aktivität der Bakteriophagen .

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Das gepufferte milchhaltige Kulturmedium enthält außerdem ein Acetatsalz, wie Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat u.dgl. in einer Menge.von etwa 0,1 bis etwa 0,4 % ' ■ (Gewicht/Volumen). Zusätzlich enthält es noch etwa 0,5 bis etwa 1,5 $ (Gewicht/Volumen) an einem mehrwertigen Alkohol, wie Glyzerin, Polyäthylenglykol, Ä'thylenglykol, Propylenglykol u.dgl. Das Acetatsalz, vorzugsweise Natriumacetat, und der mehrwertige Alkohol, vorzugsweise Glyzerin, befähigen fc durch ihre Anwesenheit im Medium die Milchsäure produzierenden Bakterien, dickere Zellwände zu bilden. Diese Bakterien sind deswegen gesünder und widerstandsfähiger gegenüber dem Angriff der Bacteriophagen als Bakterien, die ohne derartige Zusätze entstanden sind. In der Praxis konnte folgendes gezeigt werden: Wenn Zellkulturkonzentrate von gepufferten milchhaltigen Kulturmedien mit und ohne Acetatsalz und mit und ohne dem mehrwertigen Alkohol und die Konzentrate zur Käseerzeugung verwendet werden, so hat sich !miner gezeigt, daß die aus den Konzentraten mit obigen Zusätzen erzeugten beimpften Milchmedien wese/itlich weniger Bacteriophagen enthielten als beimpfte Milchmedien, die aus den Konzentraten ohne die obigen Zusätze erzeugt worden waren.

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Das gepufferte milchhaltige Kulturmedium enthält ferner etwa 0,25 bis 0,3 % (Gewicht/Volumen) an einem Kulturstimulans, wie Hefehydrolysat, trockenem Pancreasextrakt u.dgl.j der Zusatz unterstützt den Stoffwechsel der Kulturzellen, indem er ihnen genügend assimilierbaren Stickstoff verschafft. Ferner enthält das Medium etwa 1,9 bis etwa 6,9 % (Gewicht/Volumen) Dextrose. Die Dextrose wird verwendet, um in dem Medium einen Gesamtfeststoffgehalt von etwa 8 bis etwa 12 fo₃ vorzugsweise von etwa 10 bis 12 % aufrechtzuerhalten. Da der Feststoff gehalt

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auf der Gewicht/Volumen-Basis des bei der Käsebereitung verwendeten Milehmediums etwa 8 bis 12 % beträgt, kann die Aktivität der Kulturzellen auf einem hohen Stand gehalten werden, wenn, sie bei einem Feststoffgehalt gezüchtet wer- · den, der demjenigen vergleichbar ist, bei dem sie später verwendet werden. Es fällt auf diese Weise jeder osmotische Schock für die Zellen weg, wenn das Zellkulturkonzentrat dem Produktionsmedium zugesetzt wird. Die Zellulose stellt außerdem eine Quelle von Kohlehydrat-Nährsubstanz für das Zellenwachstum dar.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das beschriebene gepufferte milchhaltige Kulturmedium mit der gewünschten^Milchsäure produzierenden Bakterienkultur beimpft und dann solange bei etwa 20 bis 24°C, vorzugsweise bei 21 ois 22⁰C bebrütet, bis ein mittlerer pH-Wert von weniger als 5 erhalten worden ist. Dies dauert im allgemeinen etwa 15 dxs Io Stunden. Dieser Inkubationstemperaturbereich ermöglicht es, Zellenkonzentrate zu erhalten, die hinsichtlich ihrer Milchsäure produzierenden Wirksamkeit stabiler sind als Konzentrate, die oei höheren Inkubationstemperaturen hergestellt sind.

Das Bebrüten wird unterbrochen, wenn der mittlere pH-Wert weniger als etwa 5, vorzugsweise 4,7 bis 5 erreicht'. Es wurde gefunden, daß man durch Unterbrechen der Bebrütung an diesem Punkt Zellkonzentrate von besonders guter Wirksamkeit erhalten kann. Gemäß der bisher bekannten Arbeitsweise wurde das Bebrüten fortgesetzt, bis man eine maximale Zellenanzahl (Anzahl von Bakterienzellen je ml) erhalten hatte oder bis alle fermentablen Zucker verbraucht waren.

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Die unter diesen bekannten Bedingungen hergestellten Zeilkonzentrate schwankten in ihrer Milchsäureproduktion und waren überhaupt weniger aktiv, selbst bei höherer Zeilenzahl, als die erfindungsgemäß hergestellten Konzentrate.

Bricht man das Bebrüten bei einem pH-Wert von etwa 4,7 ab, so sind, wie gefunden wurde, die Zelleneigenschaften denjenigen der ursprünglichen Impfkultür gleich. Setzt man ' dagegen das Bebrüten fort, bis sämtlicher fermentierbarer Zucker verbraucht oder eine maximale Zellenahzahl erreicht ist, so erhält man Zellen mit Eigenschaften, die im allgemeinen von denjenigen der ursprünglichen Kultur verschieden 'sind j dies ist im allgemeinen nicht wünschenswert.

Die erfindungsgemäße Verwendung eines milchhaltigen Mediums zur Erzeugung von Zellkulturkonzentraten ist überraschend und gegenüber dem Stand der Technik eine entschiedene Verbesserung. Gemäß dem Stand der Technik wurde zum Züchten der Kulturzellen stets ein nicht-milchhaltiges bzw. nichtmilchähnliches Medium verwendet. Wurden die resultierenden Zellen dann dazu benutzt, ein Milchmedium zu immpfen, wie dies bei der Käseerzeugung der Fall-ist, dann mußten sich die Zellen immer an das neue Kulturmedium akklimatisieren. Dies führte oft zu einer unerwünschten Verlängerung der Arbeitszeit und verursachte Schwankungen in der Wirksamkeit der Kultur. Bisher wurde stets absichtlich die Verwendung eines milchhaltigen Mediums zur Erzeugung von Zellkonzen- . traten vermieden. Die durch das Zellenwachstum erzeugte Milchsäure verursacht ein Koagulieren des Milchproteins. Diese Feststoffe verdünnen dann das Zellkonzentrat, wenn die Zellen zusammen mit den Feststoffen von dem flüssigen Teil des Mediums abgetrennt werden.

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Dieser'*potentielle Nachteil, den die Verwendung eines miIchhaitigen Mediums bei der Herstellung von Zellkonzentrationen aufweisen könnte, wird erfindungsgemäß dadurch überwunden, daß man die .koagulierten Milchproteine durch Zusatz eines alkalischen Stoffes, der zu einem pH-Wert des Kulturmediums von mehr als 6, vorzugweise von 6 bis 6,8 führt, solubilisiert. Wie erwähnt, kann jeder alkalische Stoff, wie Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid, Natriumcarbonat u.dgl. zur Erhöhung des pH-Wertes verwendet werden, es hat sich jedoch gezeigt, daß Kaliumhydroxid zu bevorzugen ist, da es im Gegensatz zu anderen alkalischen Stoffen keine toxische Wirkung gegenüber den Bakterienzellen aufweist.

Gemäß einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das beimpfte Medium bebrütet, bis der pH-Wert unter 5 sinkt, worauf man als Alkali vorzugsweise Kaliumhydroxid zufügt, um den pH-Wert auf einen Wert von mehr als etwa 6 anzuheben, worauf das Medium wieder bebrütet wird, bis der pH-Wert unter 5 sinkt, was etwa 1 bis 2 Stunden Inkubation bei 20 bis 24°C erfordert, worauf dann nochmals Alkali, vorzugsweise Kaliumhydroxid, zugegeben wird, um den pH-Wert des Kulturmediums auf einen Wert von mehr als etwa 6 heraufzusetzen. Mit Hilfe der obigen Arbeitsweise erhält man Zellkonzentrate von besonders hoher Wirksamkeit.

Nach Beendigung des Bebrütens wird das Kulturmedium so rasch wie möglich auf- etwa 4 bis 7°C abgekühlt. Im allgemeinen ist das Kühlen in höchstens 30 Minuten beendet. Falls sich das Kühlen etwa 1 Stunde hinziehen sollte, kann die Kultur bis zu 10 bis 20 % ihrer Fähigkeit, Milchsäure zu produzieren, verlieren.

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Das gekühlte Kulturmedium wird dann auf übliche Weise, z.B. mittels einer Zentrifuge, behandelt, um die Zellen der Bakterienkultur von dem flüssigen Teil abzutrennen. Das so erhaltene Zellkulturkonzentrat kann unmittelbar dazu verwendet werden, ein Milchmedium zwecks Erzeugung von Käse oder entsprechenden anderen Milchprodukten zu beimpfen. Vorzugsweise wird aber das Konzentrat nocii weiter heruntergekühlt, nämlich mindestens auf eine Temperatur h unter -"JJt⁰C₃ vorzugsweise auf mindestens -184°C, und bei dieser niederen Temperatur bis zur weiteren Verwendung · gelagert. Es kann dann auf die gewünschte Temperatur, etwa

den.

etwa 10 bis 21°C, angewärmt und zum Beimpfen verwendet wer-

Die technische Anwendbarkeit eines besonderen Zellkultur-Konzentrates, beispielsweise bei der Käsebereitung, kann leicht auf folgende Weise bestimmt werden: Das betreffende Konzentrat wird in einer Menge von 0,1 Vol.-$ dazu verwendet, eine Portion von 100 cnr eines sterilisierten Magermilchmediums zu beimpfen, das etwa 12 % (Gewicht/Volumen) Gesamtfeststoffe enthält. Das beimpfte Medium wird dann bei ^l bis 32°C bebrütet. Die Fähigkeit des Zellenkonzentrates zur Erzeugung von Milchsäure sollte so groß sein, daß die Konzentration von 0,1 Vol.-$ in etwa 4 1/2 Stunden anfängt, die Milch zu koagulieren. Es ist ferner wünschenswert, daß ein beimpftes Milchmedium mit 12 % Feststoffen, das 0,1 Vol.-$ Zellenkonzentrat enthält, nach 6stündigem Bebrüten bei J51 bis j52°C einen Säureanstieg von mindestens 0,75 % (Gewicht/Volumen) entwickelt.

Die Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.

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- 11 Beispiel 1

. Es wurde ein gepuffertes milehhaltiges Kulturmedium bereitet durch Zusammenmischen der folgenden Bestandteile und Zugabe von genügend Wasser^ um ein Gesamtvolumen von 379 1 zu erreichen:

nicht-fettartige Milehfeststoffe

Hef ehy dr oly s ir t Diammoniumphosphat Monoammonlumphosphat Dinatriumphosphat Dextrose

Natriumacetat

Glyzerin

43,92kg

Das so angesetzte Gemisch enthielt 11,67 % (Gewicht/Volumen) gelöste Peststoffe und hatte die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile % (auf Basis GewichtAolumen)

nicht-fettartige Mileh-

feststoffe . 4,5 ·

Hefehydrolysat 0,27

Diammoniumphosphat 1,92

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17,0	kg
1,0	kg
4,0	kg
2,0	kg
1,1	kg
13,6	kg
1,25	kg
3,97	'kg

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Bestandteile $ (auf Basis Gewicht/Volumen)

Monoammoniumphosphat . 1*92'

Dinatriumphosphat . ·> l.,92 - -

Dextrose -3*6

Natriumacetat 0,33

Glyzerin - ; 1,05

In diesem Gemisch stellten die Ammoniumphosphate 84,4 Gew.-% der gesamten Phosphatsalze dar.

Das obige Kulturmedium, das einen pH-Wert von etwa 6,8 hatte, wurde dann bei 132 bis 135°C 30 Sekunden sterilisiert und in einen sterilisierten Fermenter eingebracht, wo es auf 21°C abgekühlt wurde. Das Medium wurde dann mit 1 Vol.-$ einer Kultur, die ein Gemisch aus verschiedenen handelsüblichen Stämmen von Streptococcus cremoris darstellte, beimpft. Das beimpfte Kulturmedium wurde nun unter sterilem Luftdruck von 0,35 atü und bei einer Temperatur von 21°C unter periodischem Rühren 16 Stunden stehengelassen. Der pH-Wert ) des Kulturmediums war 4,8* Das Medium wurde dann innerhalb ' 30 Minuten auf 7°C abgekühlt. Beim Kühlen wurde der pH-Wert des Mediums durch Zugabe von Kaliumlauge auf 6,8 eingestellt. Hierzu wurden insgesamt 3,86 kg Kaliumhydroxid benötigt. Das Kulturmedium wurde dann unter sterilen Bedingungen in eine sterile Zentrifuge überführt, worin die Zellen der Bakterienkultur von dem flüssigen Teil abgetrennt wurden.

' Zwecks Prüfung der so erzeugten Kultur auf ihre Wirksamkeit wurde eine Menge von 0,1 Vol.-# Konzentrat zu einem sterili-

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' , .„_lA-;55 754 ·

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sierten Milchmedium zugegeben, was zu einem Koagulatlonsbegirin innerhalb 4 Stunden und 50 Minuten bei 31 bis 32⁰C führte, ein durchaus annehmbarer"Wert. Bei einem'weiteren Wirksamkeitstest entwickelte das Konzentrat eine Säurezunahme von mindestens 0,75 % (Gewicht/Volumen) nach 6 Stunden Bebrüten bei 31 bis 32⁰C Das Zellenkonzentrat wurde dann abgefüllt und in sterilen Dosen verschlossen und durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff auf eine Temperatur von -185°C eingefroren. Die gefrorenen Dosen wurden dann bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff gelagert.

Beispiel 2 . .

Eine Dose mit 75 ml eines eingefrorenen Zellkonzentrates nach Beispiel 1 wurde aus der Lagerung unter flüssigem Stickstoff herausgenommen und durch Einbringen in Leitungswasser von 10 bis 20⁰C, dem etwa I5 bis 20 ppm Chlor zugesetzt worden waren, aufgetaut. Nach 5 bis 10 Minuten war der Doseninhalt genügend von der Dosenwand abgelöst, so daß er in etwa II36 1 eines teilweise sterilisierten Mager-Äilch-Mediums für eine Ausgangsgroßkultur eingebracht werden konnte. Das Medium wurde stark gerührt, um das Zellkonzentrat gleichmäßig zu verteilen. Das Medium wurde dann bei 21°C 13 bis 15 Stunden bebrütet, worauf es verwendet wurde, um einzelne Ansätze von pasteurisierter Milch zu beimpfen. Nach Zugabe von Rennin wurde der Käsebereitungsprozeß fortgesetzt, bis ein Cheddarkäse von guter Qualität erhalten worden war.

Beispiel 3 . .

Ein gepuffertes milchhaJLtiges Kulturmedium nach Beispiel 1 wur-

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de sterilisiert, in einen sterilen Fermenter eingebracht, mit der Kultur aus Beispiel 1 beimpft und' I5 Stunden unter periodischem Rühren bei 21°C bebrütet. Der pH-Wert betrug 4,8 bis 5,0. Dann wurde eine Lösung von Kaliumhydroxid unter Rühren zugesetzt, bis der pH-Wert auf 6,8 gestiegen war. Das Bebrüten wurde noch 1 bis 1 1/2 Stunden fortgesetzt, wobei der pH-Wert wieder auf 4,8 bis 5,0 sank. Eine nochmalige Zugabe von Kaliumhydroxid erhöhte den pH-Wert wieder auf 6,8. Das Medium wurde dann abgekühlt und zentrifugiert. Das erhaltene Zellkonzentrat hatte in einer Konzentration von 0,1 Vol.-$ eine Koagulationswirksamkeit von 4 Stunden und J50 Minuten bei 31 bis 32⁰C. Das Konzentrat wurde dann in sterile Dosen eingelötet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Diese Dosen wurden dann nacheinander auf Raumtemperatur gebracht und ließen sich mit Erfolg in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise verwenden zur Herstellung von Großkulturen, mit denen man guten Cheddarkäse herstellen konnte. '

Neben den in den. Beispielen beschriebenen spezifischen Bakterienkulturen können auch anders zusammengesetzte Kulturen und einzelne Stämme von anderen Organismen verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Zellkonzentrationen, die für die- Herstellung von Cheddarkäse und anderen Käsearten sowie von anderen mit Bakterienkulturen erzeugten Milchprodukte, wie Buttermilch und Sauerrahm, geeignet sind. Im letzteren Fall, d.h. bei anderen Milchprodukten, kann das Zellkonzentrat ohne weiteres unmittelbar dem Produktionsmedium zugesetzt werden, ohne daß man vorher eine Großkultur ansetzt.

PATENTANSPRÜCHE

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Claims

DR. ING. F. WTrBSTECOFF DIFIj. ING. G. FlTIiS DRÄ.T.PBOHMANN τ****ακ asoeei DR ING. D. BKHRENS «^ JK" ΜΚΪΤΧΟΤΓΑΤΒΗΤ JCÜNOHKK PATBHTANWXKFE yf^ 1A-35 754 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Zellkulturkonzentraten, dadurch gekennzeichnet , daß man ein flüssiges gepuffertes milchhaltiges Kulturmedium mit einer Milchsäure produzierenden Bakterienkultur beimpft, das beimpfte Medium bebrütet, um darin Bakterxenkulturzellen solange zu vermehren, bis ein gewünschter pH-Wert erhalten ist, worauf man alkalische Stoffe zufügt, um den mittleren pH-Wert auf einen gewünschten Stand zu bringen, das Medium kühlt und die Bakterienkultur als Zellkulturkonzentrat von dem flüssigen Teil des Kulturmediums abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zellkulturkonzentrat auf mindestens -73⁰C , vorzugsweise auf -184-⁰O oder tiefer, abkühlt und es bei dieser Temperatur lagert.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das beimpfte Mediumbei etwa 20 bis 24⁰C, vorzugsweise bei 21 bis 22⁰C, bebrütet. _v

4· Verfahren "nach Anspruch 1, 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß man das beimpfte Medium bebrütet, bis ein pH-Wert von weniger als 5 erreicht ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man nach Erreichen des pH-Wertes von weniger als 5 den pH-Wert mit Hilfe von alkalischen Zusätzen, vorzugsweise von KOH, wieder auf über 6 anhebt.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man das durch den alkalischen Zusatz auf einen pH-Wert von über 6 gebrachte Medium erneut solange "bebrütet, bis der pH-Wert unter 5 gesunken ist, worauf man den pH-Wert wieder mit Hilfe eines alkalischen Zusatzes, vorzugsweise von KOH, auf über 6 anhebt.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man das Medium nach Beendigung des Bebrütens rasch auf 4 bis 7°C abkühlt, bevor
man die Bakterienzellen von dem flüssigen Anteil des Kulturmediums abtrennt.

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