DE2845156A1 - Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von alkalischer phosphatase - Google Patents
Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von alkalischer phosphataseInfo
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Description
PATENTANWÄLTE
WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHKEN S - GOETZ
professional representatives before the european patent office agr6es pres l'office europeen des brevets
D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2
telefon: (009) 662a ji
telex: j24070
1Α-5Ϊ 500
Patentanmeldung
Anmelder :
ISTITUTO SIEROTEBAPICO E VACCIUOGEITO TOSCANO
"SCLAVO" S.p.A.
Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von alkalischer Phosphatase
9093 3 0/0567
PATENTANWÄLTE . Λ
WUESTHOFF-v.PECHMATNiiN -BEHRENS-GOETZ dipping. g.rhard puls (1952-1971)
DIPL.-CHEM. PR. E. FREIHERR VON PECHMANN PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS
D-8000 MÜNCHEN 90
SCHVEIGERSTRASSE 2 telefon: (089) 66 20 ji
telex: j 24 070
U-51 500
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der Aktivität von alkalischer Phosphatase mit Hilfe eines Gemisches
aus einem Salz der para-Nitrophenylphosphorsäure, einem Magnesiumsalz,
Natriumborat und 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Dosieren der Aktivität der alkalischen Phosphatase, wobei das oben beschriebene
Gemisch verwendet wird.
Bekanntlich konzentriert sich die alkalische Phosphatase vorwiegend im Darmepithel, in den Teilen des Knochengerüstes,
die noch wachsen, in der Nierenrinde, in den Brustdrüsen, der leber und der Galle sowie im Blut und in der Plazenta. Die
Wirkung der alkalischen Phosphatase besteht in der Katalyse von Reaktionen zur Hydrolyse von Orthophosphaten gemäß folgendem
Reaktionsschema:
R-O- PO(OH)2 + H2O
<^ R - OH + H5PO4^
und ihre Anwesenheit in hoher Konzentration im Blut ist ein Anzeichen von gewissen pathalogischen Zuständen im menschlichen
Körper. So ist ein Ansteigen der Phosphataseaktivität beispielsweise
ein Anzeichen für das Auftreten von Erkrankungen, die ihren Ursprung in der Niere, dem Terdauungstrakt oder dem Knochengerüst
haben.
Die erste Bestimmung der alkalischen Phosphatase im menschlichen Blutserum erfolgte bereits 1930 (Kay, H.D., J.Biol.
Chem., 89, 235 (1930) und innerhalb dieses langen Zeitraumes
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ORIGINAL INSPECTED
waren die Untersuchungsmethoaen für die enzymatisch^ Aktivität
mancherlei Änderungen unterworfen, die insbesondere auf den Einfluß
des Mediums, in dem die Reaktion durchgeführt -wird, zurückzuführen
sind.
Eine Anzahl Ton Verfahren, die gegenwärtig zur Bestimmung
der Phosphataseaktivität angewandt werden, beruhen (s. J.Biol.,
Chem., 172, 1, /fi948/ ) auf der Entdeckung von Axelrod, daß das
Phosphataseenzym auch die Fähigkeit hat, die Transphosphorylierunge
reaktion zwischen dem in der obigen Gleichung (1) angegebenen Orthophosphat und einem Alkohol der als Rezeptor wirkt, katalytisch
zu beschleunigen.
Bei einer z.Zt. weit verbreiteten optischen Methode zur Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase- werden
als erstes Substrat zur Durchführung der oben erwähnten Transphosphorylierung p.Nitrophenylphosphate verwendet. Bei diesem
Verfahren ist vorgesehen, das erste Substrat mit dem zweiten, dem Akzeptor, und dem Enzym unter entsprechenden Bedingungen
zu vermischen und die optische Dichte bei 400-415 nm abzulesen, wobei die Ablesungen fortlaufend während des Reaktionsverlaufes
vorgenommen werden. Der im Verlauf der Zeit zu beobachtende Anstieg der optischenDichte ist proportional der umgesetzten Produktmenge,
so daß eine entsprechende Auswertung der Daten die Bestimmung der Aktivität des Enzyms ermöglicht.
Es ist nun bekannt (s. z.B. das Lehrbuch "The Enzymes", Academic Press, 1961, S. 55 und ff), daß die alkalische Phospha tase
in der Nähe eines pH-Wertes von 10 eine optimale Wirkung entfaltet und daß ihre Wirksamkeit durch die Anwesenheit von
Mineralsalzen, insbesondere Magnesiumsalzen, verbessert wird. Aufgrund dieser Tatsache müssen für alle zur Bestimmung des
Phosphaj-taseenzyms im Handel befindlichen Präparate Bestandteile
verwendet werden, die sowohl genauestens definiert wie laut Gesetz
obligatorisch sind.
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Man hat daher in großem Umfang Derivate der p-Nitrophenylphosphorsäure
im Verein mit organischen Magnesiumsalzen und Puffern, die nötig sind um den pH-Wert in obigen Bereich zu
halten, verwendet. Bei den bisherigen Reagentien wurden weitgehend Natriumsalze der Säure und anorganische Puffer verwendet.
Da es sich jedoch herausgestellt hat, daß das Natriumnitrophenylphosphat
nicht sehr stabil ist, werden in neuerer Zeit Salze der infrage kommenden Säure mit Aminverbinüungen
verwendet.
Die Herstellung von p-Nitrophenylphosphaten einschließlich
derjenigen von Aminverbindungen und ihre Verwendung in biologisch
wirksamen Aufbereitungen ist seit langem bekannt, (s. z.B., JACS, 79, (1957) S. 3741).
Bekannt wurden auch Versuche hinsichtlich der Verbesserung des Verlaufes der Transphosphorilierungsreaktion, wozu man im
Anfangsgemisch die Akzeptorsubstanz so lange variierte bis man schließlich zur Verwendung von Puffern kam, die eine Doppelwirkung
entfalteten, d.h. gleichzeitig den pH-Wert konstant hielten und als Akzeptoren für die Transphosphorlierung wirkten.
Die Sorgfalt, die man bei der Herstellung der verschiedenen Puffern walten lassen muß, darf nicht übersehen werden, und
diese Sorgfalt wirkt sich natürlich auf die Gesamtwirtschaftlichkeit
der Reagentien und der Analyse aus. Sämtliche bisher verwendeten
Gemische weisen jedoch immer noch eine Anzahl Nachteile auf, unter denen der einschneidendste die geringe zeitliche
Stabilität des Mittels ist. Selbst wenn man die verschiedenen Aufbereitungen unter drastischen Bedingungen lagert, kann man
sich höchstens 2 bis 3 Tage lang darauf verlassen, daß die Resultate
reproduzierbar sind.
Viele der üblichen Reagentien, z.B. diejenigen bei denen Mannitol und ähnliche mehrwertige Alkohole als Akzeptoren in der
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ORIGINAL INSPECTED
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Transphosphorilierungsrealction verwendet v/erden, haben außerdem
die Fähigkeit, die aus der Plazenta stammende alkalische Phosphatase mit guter Empfindlichkeit quantitativ nachzuweisen.
In der Mehrzahl der Fälle wird der Nachweis der alkalischen Phosphatase durchgeführt um die pathalogischen Veränderungen
festzustellen, die dem Lebersystem (Stauungsikterus ), dem Knochengerüst (z.B. Tumoren und Paget'sche Krankheit) oder dem Verdauungssystem
zugeschrieben werden können. Im Fall einer Schwangerschaft kann somit die hohe physikalische Aktivität der alkalischen
Phosphatase im Blut eine oder mehrere der oben erwähnten pathalogischen Erscheinungen maskieren.
Demgegenüber wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß ein auf neuartige Weise zusammengesetztes Mittel die Bestimmung
der alkalischen Phosphatase mit reproduzierbaren Resultaten ermöglicht ohne daß man einen der oben erwähnten Nachteile in Kauf
nehmen muß.
Das erfindungsgemäße Mittel setzt sich zusammen aus einem
Salz der p-Nitrophenylphosphorsäure, einem Magnesiumsalz, Natriumborat
und 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol.
Das Gemisch ist stabil und seine anfänglichen Eigenschaften bleiben viele Tage lang aufrechterhalten, es ist nur wenig
empfindlich gegenüber der Anwesenheit von aus der Plazenta stammende Phosphata3en, dia die oben erwähnten Fehler verursachen, und setzt
außerdem nicht eine genaue Herstellung eines Puffers voraus, da der pH-Wert der Transphosphorilierungsreaktion durch die Bestandteile
des Mittels selbst eingestellt wird.
Für die erfindungsgemäße Bestimmung der Phosphataseaktivität
gilt offenbar folgendes Schema:
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| OPO3 | ROH - | ALP^ | OH | + ROPO3 |
| I I + | Mg++ | O | ||
| Ύ | NO2 | |||
| NO2 | ||||
worin ALP die alkalische Phosphatase (EC 5.15.1.) ist und
ROH das erwähnte Propandiol bedeutet. Da die Umsetzung bei
alkalischem pH-Wert stattfindet, kann man die Hydrolyse des p-Nitrophenylphosphats zu p-Iiitrophenol einfach an der Extinktion
bei 4-05 ntn ablesen: Praktisch ist unter alkalischen pH-Bedingungen
das p-Nitrophenol stark gelb gefärbt, während das p-Nitrophenyl~
phosphat farblos ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Messung
der Aktivität der alkalischen Phosphatase mit Hilfe eines einfachen Reagentiengemisches; dieses kann von Hand verwendet werden,
kann aber ebenso gut auch in automatische , Vorrichtungen mit diskretem oder kontinuierlichem Durchfluß eingeführt werden.
Es eignet sich auch für kinetische Bestimmungen und ebenso,nach
Zusatz eines BlockierungsmittelSffür "Pestzeitbestimmungen".
Zur Durchführung des Verfahrens können viele Ausgangssubstrate verwendet werden, obwohl man selbstverständlich vorzugsweise
die Verwendung des Natriumsalzes der p-Nitrophenylphosphorsäure vermeidet, da dieses dazu neigt, spontan hydrolisiert
zu werden. So kann man beispielsweise die Salze ( bzw. Ester ) der obigen Säure mit 2-Araino-2-methyl-1,5-propandiol, von 2-Amino-2-äthyl-1,5-propandiol,
von 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,5-propandiol oder von Cyclohexylamin verwenden, um nur einige davon zu erwähnen.
Das Donorsubstrat kann demnach praktisch beliebig aufgebaut sein, da es für die Affinität gegenüber dem Enzym weniger auf den
salzbildenden Bestandteil als auf den p-Nitrophenylphosphorsäurerest
ankommt.
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Ebenso kanu das Magnesiumsalz unter einer größeren Anzahl von Verbindungen, wie dem Acetat, dem Asparaginat, dem Chlorid,
dem Sulfat usw. gewählt werden.
Besonders gute Resultate wurden beispielsweise erhalten mit dem Cyclohexylaminosalz von p-Mtrophenylphosphorsäure als
Donorsubstrat und Magnesiumacetat als Aktivator der Enzymreaktion.
Das als Akzeptor wirkende 2-Amino-2-
hydroxytnethyl-1, 3-propandiol ist in den erfindungsgemäßen Gemische^
in 0,7- bis 2,0-molarer Konzentration enthalten.
Die Beispiele dienen zu näheren Erläuterung der Erfindung. Beispiel 1
Das Beispiel betrifft die Herstellung von 50 kg Reagens pulver, wobei ausgegangen wird von den Salzen der p-Nitrophenylphosphorsäure
(pNPP) mit 2-Amino-2-äthyl-1,3-propandiol (2A2E1, 5PD) mit 2~Amino-2-methyl-1,3-propandiol (2A2M1, 3PD)
und mit Cyclohexylamin (GEA). Der Akzeptor, d.h. das 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol^ist
hier mit TRIS abgekürzt. 1,5 kg pNPP-CEA.HgO wurden unter Yakuum und über P2O5 bei nicht
mehr als 300G unter Lichtabschluß 48 Stunden getrocknet. Der
Feuchtigkeitsgehalt darf dann 1,5$ nicht mehr übersteigen.
Was das pNPP-2A2E1, 3PD bzw. das pEPP-2A2E1, 3PD, bzw. das
pNPP-2A2M1, 3PD betrifft, so muß die Trocknung nur dann erfolgen,
wenn der Feuchtigkeitsgehalt des Produktes über 0,5 0A beträgt.
Die Körnung der verschiedenen Bestandteile (TRIS, pNPP,
Mg-Acetat, Na-Borat) wurde durch Vermählen und/oder Absieben
einheitlich gestaltet.
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Anschließend wurden 48,35 kg TRIS mit 68,6 g. Mg-Acetat
4HpO und 683.5 g ITa-Tetraborat .1OHpO solange vermischt "bis ein
einheitliches Pulver erhalten worden war.
Das Pulver wurde auf einer Unterlage aus rostfreiem Stahl
etwa 14 Stunden lang "bei 70° getrocknet, worauf man es in wasserfreier
Umgebung abkühlen ließ und auf einheitliche Korngröße absiebte. Der Feuchtigkeitsgehalt mußte zum Schluß unter 0,6 $
liegen.
Man erhielt auf diese Weise 48,76 kg basisches Pulver, das unter innigem Vermischen kombiniert wurde mit 1,37 kg
pNPP-CAE (bzw. 1,49 kg pNPP-2A2E1, 3PD bzw. 1,40 kg pNPP-2A2Mi,3PD)
Die Homogenität des Gemisches wurde überprüft indem man Probai von 3,5 g des Geraisches in 2o ml Wasser löste und den
pH-Wert, das Magnesium und die plTPP quantitativ bestimmte.
Zum Schluß betrug der Feuchtigkeitsgehalt höchstens 0,8 a/o.
Verteilung
Mit den verschiedenen pITPP-Salzen wurden erhalten:
50.13 kg bei Verwendung von pNPP-CEA I
50.25 kg " " » pNPP-2A2E , 3PD II
50.16 kg " " » PNPP-2A2M1, 3PD III
Zweoks praktischer Verwendung der Reagentien wurde folgende
Überlegungen angestellt: Ein einzelner AIP-Test (3 ml) entspricht 483 mg I oder III und 484 mg II.
Da sich beim Auflösen des Pulvers in einem gewissen Volumen Wasser das Gesamtvolumen um etwa 12,5 $ vergrößert, kann man das
Gewicht des in den Kolben zu verteilenden Pulvers berechnen, wozu 20 ml HpO addiert werden müssen, so daß man, wenn alles
aufgelöst ist, 22,5 ml erhält.
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jio 284515S
- jB -
4-83 mal 22,5 : 3 = 3622 mg I oder III je Kolben;
484 mal 22,5 : 3 = 3630 mg II je Kolben.
In den Zwei-Liter-Kolben mit klarer Lösung müssen also verteilt sein:
322 g I oder III bzw.
323 g II.
Eines der nach Beispiel 1 hergestellten Reagentien wurde verwendet zur Bestimmung der Aktivität von alkalischer Phosphatase.
Das Reagens wurde vorher auf Reaktionstemperatur erwärmt, eine Menge von 3 ml mit 0,05 ml der zu testenden Probe vermischt
wurde. Das Ganze wurde dann in eine Einrichtung zur photometrischen Ablesung bei 405 nm bei der vorgewählten konstanten Temperatur
eingebracht.
Die Ablesung der optischen Dichte (Zjt O.D. min" ) wurde
gemessen. Für /L O.D.min" höher als 0,750 (Äquivalent etwa
2,500 mü/ml) wurde die Messung wiederholt an einer 1:10 verdünnten
Probe. In diesem EaIl mußte das Resultat mit 10 multipliziert
werden.
A -1 wurde
Der für/1 O.D.min gefundene Wert/in die folgende Berechnung
eingeführt, so daß man den Viert für mU/ml erhielt:
1000 .T+
Λ ""1
/\ O.D.min mal = mU/ml
18.6 .Lp .T8
In obiger Gleichung bedeuten:
1000 den zum Übergang von Einheiten zu tausendstel Einheiten notwendigen Faktor:
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ΛΑ
V+ das gesamte Reaktionsvolumen, das heißt 3,05 ml;
18,6 den millimolaren Extinktionskoeffizienten von pNP;
Lp den Weg des Lichts, der 1 cm beträgt;
V das Volumen der zu testenden Probe, das 0,05 ml "beträgt,
s
Es folgt daher:
mU/ml =/jO.D.min~1, multipliziert mit 3280.
Es wurden Vergleichsversuche durchgeführt zwischen dem erfindungsgemäßen Gemisch und einem üblichen Gemisch zur Bestimmung
der alkalischen Phosphatase, wobei das übliche Gemisch mit dem Salz von pNPP mit CEA, Magnesiuraasparaginat und einem
Carbonatpuffer bereitet worden war. Die Temperatur betrug 37°C und es wurden die gleichen Mengen wie im obigen Beispiel verwendet.
Die Resultate wurden grafisch in Pig. 1 aufgetragen, worin die Abszissen die mU/ml-Werte anzeigen, die erhalten wurde,
wenn man das erfindungsgeraäße Gemisch verwendet, während die Ordinaten die mU/ml-Werte bedeuten, die erhalten wurden bei Verwendung
des üblichen Gemisches.
Die gerade Linie 1 ist die Idealkurve, die man erhalten würde, wenn beide Mittel die gleichen Resultate ergeben würden.
Die Markierungen Q) beziehen sich auf Proben von aus der Plazenta stammender Phosphatase. Die gerade Linie 2 bezieht sich auf die
tatsächliche lineare Regressionskurve des üblichen Geraisches, relativ zu dem erfindungsgemäßen Gemisch. Eine derartige Regression
ist ein Anzeichen dafür, daß das erfindungsgemäße Verfahren
empfindlicher ist als das übliche, und zwar um mehr als 20$
(s. die Winkelabweichung, relativ zur Idealkurve).
Eine derartig verbesserte Empfindlichkeit ergibt sich nicht
für die aus der Plazenta stammenden Phosphatasen: Im Falle der vorliegenden Erfindung ist daher die Plazentaphosphatase, relativ
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zu den üblichen Methoden, unterdosiert. Die nicht von einem
Kreis umgebenen Punkte in Fig. 1 beziehen sich auch tatsächlich auf Proben, die Phosphatate verschiedener Herkunft enthalten,
z.B. solche aus der Leber, dem Knochengerüst oder den Eingeweiden. Die Kurve 2 entspricht der Gleichung ϊ = 0,727x + 9.01, während
bei der Kurve 1 offensichtlich Y = χ ist.
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Claims (4)
- DR.-ING. FRANZ KUESTHPATENTANWÄLTE 2KjLDR. PHIL.WUESTHOFF-v.PECHMANxN-BEHRENS-GOETZ DIP,.ING.G£!llIARD Pül.sDIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMAN PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENSMANDATAIRES AGREES PRES l'oFFICE EUROPEEN DES BREVETS DIPL.-ING.; DIPL.-VnRTSCH.-ING. RUPERT GOt fZD-3000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2telefon: (0S3) 66 20 ji telegramm: protectpatent telex: j 24 0701A-51 500 Anmelder: SOLAVO Patentansprüchef1.J Verfahren zur Analyse von alkalischer Phosphatase,"^dadurch gekennze ichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit einem ü-emisch in Berührung bringt, das sich zusammensetzt aus einem Salz der p-Nitrophenylphosphorsäure, einem Magnesiumsalz, Natriumborat und 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol in 0,7- bis 2,0-molarer Konzentration vorhanden ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in dem Gemisch anwesende Magnesiumsalz Magnesiumacetat, -asparaginat, -chlorid oder-sulfat ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3 dadurch gekennzeichnet, daß das Salz bzw. der Ester der p-Witrophenylphosphorsäure der 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiolester, der 2-Amino-2-äthyl-1,3-propandiolester oder da3 Cyclohexylaminsalz ist.909830/0567ORIGINAL INSPECTED
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