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Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur oxidativen Freisetzung von CO aus einer CO-freisetzenden Verbindung, das sich insbesondere zur CO-Freisetzung aus gering wasserlöslichen bzw. schwer wasserlöslichen CO-freisetzenden Verbindungen eignet. Ferner betrifft die vorliegende Verbindung Gasfreisetzungssysteme zur Erzeugung von CO, sowie deren therapeutische Verwendung.
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Hintergrund der Erfindung
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Kohlenstoffmonoxid (CO) wurde bisher als ausschließlich schädliches Gas aufgefasst. Diese Auffassung hat sich jedoch in jüngster Vergangenheit gewandelt und Kohlenstoffmonoxid wird zunehmend im Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen untersucht, beispielsweise in der Behandlung entzündlicher Erkrankungen wie der Colitis ulcerosa, der gastritischen Ulcera, des postoperativen Ileus oder der diabetischen Gastroparese (STEIGER, C. et. al.: Prevention of colitis by controlled oral drug delivery ofcarbon monoxide. In: Journal of Controlled Release, Vol. 239, 2016, S. 128 - 136 - ISSN 1873-4995). Daneben kann CO zur Minimierung von Ischämie-/Reperfusionsschäden in Organtransplantaten verwendet werden oder in der Behandlung von Lebensmitteln, wie beispielsweise Fleisch (
WO 2016 / 110 517 A1 ).
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Für die therapeutische Verabreichung von CO existieren zwei grundlegende Prinzipien: die (i) Inhalation des Gases sowie die (ii) systemische Verabreichung von Kohlenstoffmonoxidfreisetzenden Molekülen (STEIGER, C. et. al.: Prevention of colitis by controlled oral drug delivery ofcarbon monoxide. In: Journal of Controlled Release, Vol. 239, 2016, S. 128 - 136 - ISSN 1873-4995).
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Die Implementierung der Inhalation von CO in die klinische Praxis ist aufgrund der schwierigen Handhabung des Gases und aufgrund sicherheitsrelevanter Aspekte jedoch schwierig (STEIGER, C. et. al.: Prevention of colitis by controlled oral drug delivery of carbon monoxide. In: Journal of Controlled Release, Vol. 239, 2016, S. 128 - 136 - ISSN 1873-4995). Kohlenstoffmonoxid-freisetzende Verbindungen, sogenannte CORMs (kurz für CO-releasing molecules) stellen eine Alternative zur Inhalation von Kohlenstoffmonoxid dar.
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Solche CORMs umfassen beispielsweise Aldehyde, Oxalate, Boranocarboxylate, Silacarboxylate und Metallcarbonyl-Verbindungen (
WO 2013 / 127 380 A1 ).
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US 2007 / 0 207 993 A1 offenbart ein Gasfreisetzungssystem zur Erzeugung von CO, umfassend eine Metallcarbonyl-Verbindung und ein Oxidationsmittel.
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JIN, Z. et. al.: Intratumoral H2O2-triggered release of CO from a metal carbonyl-based nanomedicine for efficient CO therapy. In: Chemical Communications, Vol. 53, 2017, S. 5557 - 5560 - ISSN 1364-548X offenbart ein Gasfreisetzungssystem zur Erzeugung von CO, umfassend einen Mangan-Carbonyl-Komplex (Mn2(CO)10) und ein Oxidationsmittel (H2O2).
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WO 2012 / 145 520 A2 offenbart CO-freisetzende Molybdäncarbonyl-Verbindungen.
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FAYAD-KOBEISSI, S. et. al.: Vascular and angiogenic activities of CORM-401, an oxidantsensitive CO-releasing molecule. In: Biochemical Pharmacology, Vol. 102, 2016, S. 64 - 77 - ISSN 0006-2952 offenbart ein Gasfreisetzungssystem zur Erzeugung von CO, umfassend eine Mangancarbonyl-Verbindung (CORM-401) und ein Oxidationsmittel (z,B. H2O2).
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NOBRE, L. S. et. al.: Antimicrobial Action of Carbon Monoxide-Releasing Compounds. In: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 51. 2007, S. 4303 - 4307 - ISSN 1098-6596 offenbart CO-freisetzende Metallverbindungen.
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BRIMM, E. O. et. al.: Preparation and Properties of Manganese Carbonyl. In: Journal of the American Chemical Society, Vol. 76, 1954, S. 3831 - 3835 - ISSN 1520-5126 offenbart Herstellung und Eigenschaften der Mangancarbonyl-Verbindung Mn2(CO)10.
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Die
WO 2016 / 110 517 A1 offenbart eine Vorrichtung zur Freisetzung von CO, umfassend eine CO-freisetzenden Verbindung, beispielsweise eine Molybdäncarbonyl-Verbindungen, und ein Oxidationsmittel.
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Allerdings ist auch die therapeutische Verwendung von CORMs bestimmten Limitationen unterworfen. So müssen CORMs einige pharmazeutisch-chemische Parameter erfüllen, um für die klinische Anwendung in Betracht zu kommen. Diese betreffen beispielsweise die Wasserlöslichkeit, Stabilität, Unbedenklichkeit sowie die Menge an CO, die pro CORM freigesetzt wird.
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Eine zentrale Herausforderung bei der Entwicklung von CORM-basierten Freisetzungssystemen zur therapeutischen Anwendung von Kohlenstoffmonoxid ist eine Mindestmenge an CO zu generieren und freizusetzen. Bereits in der
WO 2013 / 127 380 A1 wurde erkannt, dass manche CORMs wasserunlöslich sind, was die Freisetzung von CO aus diesen Molekülen erschwert. Die
WO 2013 / 127 380 A1 schlägt in diesem Zusammenhang die Einbettung von Metallcarbonyl-Verbindungen in Polymere oder Polymer-Mischungen vor, aus denen CO durch Lichtanregung freigesetzt werden kann. Nachteil hierbei ist natürlich, dass solche eingebetteten Metallcarbonyl-Verbindungen zunächst synthetisiert werden müssen.
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Die
WO 2015 / 188 941 A1 beschreibt die CO-Freisetzung aus CORMs insbesondere von Metallcarbonyl-Verbindungen unter Zuhilfenahme einer „Trigger“-Verbindung, also einer freisetzungsbeschleunigenden Verbindung. Die Trigger-Verbindung, bei der es sich insbesondere um eine Schwefelverbindung, vorzugsweise um Natriumsulfit, handelt, bewirkt in dem Metallcarbonyl-Molekül einen Liganden-Austausch, der die CO-Freisetzung aus dem Molekül vereinfacht. Obgleich Metallcarbonyl-Verbindung und Trigger-Verbindung gemeinsam in einer Tablette bereitgestellt und oral verabreicht werden können, ist die Voraussetzung für den Ligandentausch jedoch auch, dass CORM und Trigger-Verbindung in gelöster Form miteinander wechselwirken. Ist die Metallcarbonyl-Verbindung schwer löslich in der Körperflüssigkeit, in der sich die Tablette auflöst (also z.B. Magensaft), so verlangsamt dies die Freisetzung von CO aus dem CORM, was höhere Dosen oder die häufigere Verabreichung erfordert. Dies ist im Hinblick darauf, dass die metallhaltigen Produkte des Ligandenaustausches häufig toxisch sind, unerwünscht, da dies verstärkte Maßnahmen zur sicheren Handhabung erfordert.
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Daher besteht ein Bedarf für ein CORM-basiertes Freisetzungssystem bzw. für ein Verfahren, das es ermöglicht, aus Metallcarbonyl-Verbindungen, insbesondere aus gering wasserlöslichen und schwer wasserlöslichen Metallcarbonyl-Verbindungen schnell eine große Menge an CO freizusetzen.
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Überraschenderweise wurde nun ein Verfahren gefunden, das durch Umsetzung einer Metallcarbonyl-Verbindung mit einem Oxidationsmittel in wässriger Phase, wobei die Metallcarbonyl-Verbindung in einer Konzentration verwendet wird, die über der Sättigungskonzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase liegt, die CO-Freisetzung signifikant aus dieser Verbindung verbessert. Das nachfolgend im Detail beschriebene erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insbesondere, dass die Auflösung von gering wasserlöslichen bzw. schwer wasserlöslichen Metallcarbonyl-Verbindung gefördert wird und damit die Umsetzung solcher Verbindungen unter schneller CO-Freisetzung erhöht wird.
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Kurze Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft, wie in Anspruch 1 definiert, ein Verfahren zur oxidativen Freisetzung von CO aus einer CO-freisetzenden Verbindung, wobei es sich bei der CO-freisetzenden Verbindung um eine Metallcarbonyl-Verbindung handelt, wobei es sich bei der Metallcarbonyl-Verbindung um eine Molybdäncarbonyl-Verbindung der allgemeinen Formel (I)
handelt, wobei:
- jeder Rest R1 unabhängig voneinander Wasserstoff, eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe oder eine mit-CO2RA1 oder-C(=O)N(RA1)2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe ist, wobei RA1 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine C1-C10-Alkylgruppe ist;
- jeder Rest R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe oder eine mit -CO2RA2 oder-C(=O)N(RA2)2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe ist, wobei RA2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine C1-C10-Alkylgruppe ist;
- oder ein Rest R1 und ein Rest R2, welche an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden sind, unabhängig von den weiteren Resten R1 und R2 einen C3-C4 Kohlenstoffring bilden,
- wobei besagte Metallcarbonyl-Verbindung mit einem Oxidationsmittel in wässriger Phase umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der eingesetzten Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase die Sättigungskonzentration der besagten Metallcarbonyl-Verbindung in der besagten wässrigen Phase übersteigt, jedoch nicht größer als 500 mg/mL ist.
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Eine oxidative Umsetzung von CORMs ist bereits in der
WO 2016 / 110 517 A1 und der
WO 2015 / 188 941 A1 beschrieben. Allerdings wird die oxidative Umsetzung darin lediglich als eine Methode zur Anregung von CORMs im Allgemeinen (die auch hierin nicht beanspruchte CORMs wie beispielsweise Aldehyde umfassen) neben einer Reihe weiterer Methoden aufgeführt, wie beispielsweise der Anregung mit Schwefel- oder Stickstoffenthaltenden Verbindungen oder sogar Wasser (welches nicht zur CO-Freisetzung aus den hierin beschriebenen CORMs führt, wie im Beispiel 1 aufgezeigt). Nicht offenbart in der
WO 2016 / 110 517 A1 ist die oxidative Umsetzung von Metallcarbonyl-Verbindungen in den erfindungsgemäßen Konzentrationsbereichen, die über der Sättigungskonzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase liegen, was die Freisetzung einer großen Menge CO in kurzer Zeit ermöglicht, insbesondere auch aus gering oder schwer wasserlöslichen Metallcarbonyl-Verbindungen.
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Entscheidender Systemparameter bei der Entwicklung von Gasfreisetzungssystemen, insbesondere therapeutischen Gasfreisetzungssystemen, sind neben der Auflösungs- und Umsetzungsrate auch der praktisch freisetzbaren Anteil an CO am theoretisch freisetzbaren Anteil an CO pro CORM der davon freisetzbare Anteil (Nutzlast). Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Erhöhung der Nutzlast gegenüber konventionellen Freisetzungssystemen. So liegt die Nutzlast gewöhnlicher Freisetzungspaare (CORM + freisetzungsbeschleunigende Verbindung) im Bereich von 10-50 % (STEIGER, C. et. al.: Oral drug delivery of therapeutic gases - carbon monoxide release for gastrointestinal diseases. In: Journal of Controlled Release, Vol. 189, 2014, S. 46 - 53 - ISSN 1873-4995: Metallcarbonyl-Verbindung CORM-2 ([Ru2(CO)6Cl4]), freisetzungsbeschleunigende Verbindung: Natriumsulfit (Na2SO3), Nutzlast 12 %; BOTOV, S. et. al.: Synthesis and Performance of Acyloxy-diene-Fe(CO)3 Complexes with Variable Chain Lengths as Enzyme-Triggered Carbon Monoxide-Releasing Molecules. In: Organometallics, Vol. 32, S. 3587 - 3594 - ISSN 1520-6041: Metallcarbonyl-Verbindung: ET-CORM („enzyme-triggered“ CORM), freisetzungsbeschleunigende Verbindung: Esterase, Nutzlast: 20%). Die oxidative Freisetzung von CO aus Metallcarbonyl-Verbindungen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht dagegen eine Nutzlast von ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 90, insbesondere ≥ 95 %, welche innerhalb von 20 Minuten, vorzugsweise innerhalb von 15 Minuten, insbesondere innerhalb von 10 Minuten erbracht wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die effektive Umsetzung von Metallcarbonyl-Verbindungen, bei denen es sich um Molybdäncarbonyl-Verbindungen der allgemeinen Formel (I) handelt, unter Freisetzung großer Mengen CO in kurzer Zeit. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, gehen die Erfinder davon aus, dass die hohen Nutzlasten, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt werden, in der schnellen Überführung der Metallcarbonyl-Verbindungen in wasserlösliche Produkte begründet liegen. Dadurch, dass die Metallcarbonyl-Verbindung in einer Konzentration, die über der Sättigungskonzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase liegt, umgesetzt wird, kommt es zum Auftreten von Gaskavitäten innerhalb der festen Metallcarbonyl-Verbindung während der oxidativen Umsetzung und damit zur Disruption des Feststoffes unter erheblicher Zunahme der Oberfläche der Verbindung. Eine vergrößerte Oberfläche bedeutet eine größere Angriffsfläche für das Oxidationsmittel, was die Überführung der schwer wasserlöslichen Metallcarbonyl-Verbindungen in wasserlösliche Produkte unter CO-Freisetzung begünstigt. Dieser Effekt wird verstärkt, je höher die Konzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase ist, wobei im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren die Konzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase bis zu 500 mg/mL betragen kann. Daher eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere auch für die Umsetzung von gering wasserlösliche bzw. schwer wasserlösliche Metallcarbonyl-Verbindungen, welche über ihrer Sättigungskonzentration in einem geringen Volumen einer wässrigen Phase unter schneller Freisetzung großer Mengen CO umgesetzt werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Freisetzungssysteme zur Erzeugung von CO, wie in Anspruch 8 definiert. Die erfindungsgemäßen Freisetzungssysteme eignen sich beispielsweise für die Verwendung zur Therapie, wie in Anspruch 9 definiert.
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Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert. Die Erfindung wird in der nachfolgenden Beschreibung weiter erläutert.
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Definitionen
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Die Abkürzung „CORM“, wie im Rahmen der vorliegenden Erfindungsbeschreibung verwendet, bedeutet „carbon monoxide releasing molecule“, zu Deutsch „Kohlenstoffmonoxid (CO)-freisetzende Verbindung“. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den CORMs um schwer wasserlösliche CO-freisetzende Metallcarbonyl-Verbindungen, die an späterer Stelle dieser Erfindungsbeschreibung detailliert beschrieben werden.
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Unter einem „Oxidationsmittel“ ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Stoff zu verstehen, welcher in der Lage ist, Metallcarbonyl-Verbindungen zu oxidieren, also die Oxidationsstufe des Metalls in der Metallcarbonyl-Verbindung zu erhöhen.
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Das Oxidationsmittel liegt im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens „in gelöster Form“ in wässriger Phase vor. Eine „Lösung“ bezeichnet ein homogenes Gemisch aus mindestens zwei chemischen Stoffen. Im vorliegenden Fall bilden Oxidationsmittel und wässrige Phase eine Lösung. Das Oxidationsmittel kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung als (vorformulierte) wässrige Lösung bereitgestellt werden, die auch als „oxidative Freisetzungslösung“ bezeichnet wird.
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Der Begriff „Löslichkeit“ bezieht sich darauf, in welchem Umfang eine (feste) Substanz in einem Lösungsmittel (hierin insbesondere Wasser) gelöst werden kann. Das hierin beschriebene erfindungsgemäße Verfahren eignet sich vorzugsweise für die CO-Freisetzung aus gering wasserlöslichen Metallcarbonyl-Verbindungen, welche (bei 15 - 25 °C) eine Löslichkeit in Wasser von weniger als 25 g/L (25 mg/mL) aufweisen. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die CO-Freisetzung aus „schwer wasserlöslichen“ Metallcarbonyl-Verbindungen. Eine „schwere Wasserlöslichkeit“ bedeutet dabei, dass (bei 15 - 25°C) weniger als 10 g/L (10 mg/mL) der Metallcarbonyl-Verbindung in Wasser löslich ist.
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Die „Sättigungskonzentration“ der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase ist überschritten, wenn die Menge an fester Metallcarbonyl-Verbindung pro Volumeneinheit der wässrigen Phase über der Löslichkeit der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase liegt. In diesem Fall liegt ein heterogenes Gemisch aus Feststoff und wässriger Phase vor, oder, in anderen Worten, die Metallcarbonyl-Verbindung liegt in „Suspension“ in der wässrigen Phase vor.
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Unter dem Begriff „Suspension“ ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung also ein heterogenes Gemisch aus einem Feststoff, der in einer Flüssigkeit dispergiert ist, zu verstehen. Insbesondere handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung um die Suspension einer Metallcarbonyl-Verbindung in einer wässrigen Phase. Eine Suspension liegt dann vor, wenn die Konzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase die Löslichkeit der Verbindung in Wasser übersteigt. In „Suspension“ bedeutet also, dass die Metallcarbonyl-Verbindung in einem Konzentrationsbereich, der über der Löslichkeit der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase bzw. über der Sättigungskonzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase liegt, mit dem Oxidationsmittel umgesetzt wird. Dies schließt allerdings nicht aus, dass sich ein Teil der eingesetzten Menge der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase löst. Dieser lösliche Teil wird durch die Löslichkeit der Metallcarbonyl-Verbindung in Wasser bestimmt.
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Die Konzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bis zu 500 mg/mL beträgt, bezieht sich auf die eingesetzte Menge der Metallcarbonyl-Verbindung pro Volumeneinheit der wässrigen Phase, und umfasst demzufolge einen gelösten und einen ungelösten Teil.
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Eine bestimmte Metallcarbonyl-Verbindung (z.B. die Molybdäncarbonyl-Verbindung „Beck1“, die nachfolgend beschrieben wird) und ein bestimmtes Oxidationsmittel (z.B. Wasserstoffperoxid) bilden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein „CO-Freisetzungspaar“ oder kurz „Freisetzungspaar“.
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Der Begriff „Nutzlast“ wurde bereits oben verwendet und bezeichnet den praktisch freisetzbaren Anteil an CO am theoretisch freisetzbaren Anteil an CO pro CORM. Die Nutzlast kann beispielsweise nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode bestimmt werden. Als „theoretisch freisetzbarer Anteil“ werden dabei alle chemischen Struktureinheiten innerhalb der Metallcarbonyl-Verbindung verstanden, die sich durch eine chemische oder physikalische Reaktion als CO abspalten lassen.
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Die Begriffe „Auflösungsrate“ und „Umsetzungsrate“ bezeichnen im Rahmen der vorliegenden Erfindungsbeschreibung die Geschwindigkeit, mit der sich die Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Lösung des Oxidationsmittels auflöst und damit einhergehend umgesetzt wird. Die Auflösung der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase kann qualitativ durch visuelle Inaugenscheinnahme (wie in Beispiel 3 beschrieben) beurteilt werden. Die Auflösung korreliert mit der (oxidativen) Umsetzung der Metallcarbonyl-Verbindung unter Freisetzung von CO und der Bildung von wasserlöslichen Abbauprodukten mit höherer Oxidationsstufe. Im Hinblick darauf werden die Begriffe hierin synonym verwendet und können auch als „Auflösung- und Umsetzungsrate“ bezeichnet werden.
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Der Begriff „Alkylgruppe“ wie im Rahmen der vorliegenden Erfindungsbeschreibung verwendet, umfasst lineare, nichtlineare (verzweigte) und ringförmige Alkylgruppen (sofern jeweils konstitutionell möglich).
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Konzentrationsangaben in „Gewichtsprozent“ beziehen sich auf das Gewicht eines Bestandteils in Relation zum Gewicht aller Bestandteile (abgekürzt „w/w“). Konzentrationsangaben in „Volumenprozent“ beziehen sich auf das Volumen eines Bestandteils in Relation zum Volumen aller Bestandteile (abgekürzt „v/v“).
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Der Begriff „umfassen“, wie hierin verwendet, beinhaltet auch die Bedeutung „bestehen aus“.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Metallcarbonyl-Verbindungen handelt es sich um Molybdäncarbonyl-Verbindungen der allgemeinen Formel (I). Derartige Metallcarbonyl-Verbindungen sind beispielsweise in der
WO 2016 / 110 517 A1 beschrieben.
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Die Metallcarbonyl-Verbindungen können als Komplexe betrachtet werden, weil sie CO-Gruppen, welche an ein Metallzentrum koordiniert sind, umfassen. Das Metall kann auch an andere Gruppen gebunden sein, wobei die Bindungen nicht koordinativ sein müssen, sondern beispielsweise ionisch oder kovalent sein können. Dies bedeutet, dass andere Gruppen als CO, welche Teil der Metallcarbonyl-Verbindung sind, nicht „Liganden“ in dem Sinne sein müssen, dass sie beide Bindungselektronen für die Bindung an das zentrale Metall zur Verfügung stellen; nichtsdestotrotz werden diese Gruppen im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Liganden bezeichnet.
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Molybdäncarbonyl-Verbindungen (Mo-Carbonyl-Verbindungen), die sich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen, sind auch in der
WO 2012 / 145 520 A2 beschrieben.
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Die Verwendung von Molybdäncarbonyl-Verbindungen der allgemeinen Formel (I) im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft, weil diese durch das erfindungsgemäße Verfahren von der Oxidationsstufe 0 in definierte Verbindungen mit stabileren Oxidationsstufe (etwa 4, oder 6) überführt werden, welche geringe Toxizität aufweisen (https://www.cdc.gov/niosh/idlh/moly-mo.html, abgerufen am 24.03.2017). Dies ist wichtig im Hinblick auf die therapeutische Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. des erfindungsgemäßen Freisetzungssystems.
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Weiterhin neigen Molybdän-Verbindungen höherer Oxidationsstufen (etwa 4, oder 6) zu Polymerisation makromolekularer Strukturen wie etwa Isopolyoxometallaten (KRISHNAN, C. V. et. al.: Electrochemical Measurements of Isopolyoxomolybdates: 1. pH Dependent behavior of Sodium Molybdate. In: International Journal of Electrochemical Science, Vol. 2, 2007, S. 29 - 51 - ISSN 1873-2755). Dies ist insbesondere für die Anwendung in therapeutischen Gasfreisetzungssystemen vorteilhaft, welche das Gas über eine Membran freisetzen, wie in STEIGER, C. et. al.: Controlled therapeutic gas delivery systems for quality-improved transplants. In: European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol. 97, 2015, S. 96 - 106 - ISSN 1873-3441 beschrieben. Dabei vermögen es makromolekulare Verbindungen, im Gegensatz zu kleinmolekularen Gasen, nicht durch die Membran des Gasfreisetzungssystems zu permeieren, und so ggf. ungewünschte toxische Wirkungen im behandelten Gewebe auszulösen.
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Bei den im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Molybdäncarbonyl-Verbindungen handelt es sich um Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
wobei:
- jeder Rest R1 unabhängig voneinander Wasserstoff, eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe oder eine mit -CO2RA1 oder-C(=O)N(RA1)2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe ist, wobei RA1 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine C1-C10-Alkylgruppe ist;
- jeder Rest R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe oder eine mit -CO2RA2 oder-C(=O)N(RA2)2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe ist, wobei RA2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine C1-C10-Alkylgruppe ist; oder
- ein Rest R1 und ein Rest R2, welche an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden sind, unabhängig von den weiteren Resten R1 und R2 einen C3-C4 Kohlenstoffring bilden.
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In bestimmten Ausführungsformen ist jeder Rest R2 Wasserstoff. In bestimmten weiteren Ausführungsformen ist jeder Rest R2 Wasserstoff und jeder Rest R1 unabhängig voneinander eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe oder eine mit -CO2RA1 oder - C(=O)N(RA1)2 substituierte C1-C3-Alkyl.
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In bestimmten weiteren Ausführungsformen ist jeder Rest R1 unabhängig voneinander eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe. In bestimmten weiteren Ausführungsformen ist jeder Rest R1 eine mit -CO2RA1 substituierte C1-C3-Alkylgruppe.
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In bestimmten weiteren Ausführungen ist jeder Rest R2 unabhängig eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe oder eine mit -CO2RA2 oder -C(=O)N(RA2)2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe, und jede Gruppe R1 ist unabhängig voneinander eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe oder eine mit -CO2RA1 oder -C(=O)N(RA1)2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe.
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In bestimmten weiteren Ausführungsformen ist jede Gruppe R1 unabhängig voneinander eine unsubstituierte C1-C3-Alkylgruppe und jede Gruppe R2 ist unabhängig voneinander eine unsubstituierte C1-C3-Alkylgruppe.
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In bestimmten weiteren Ausführungsformen ist jede Gruppe R1 unabhängig voneinander eine mit -CO2RA1 substituierte C1-C3-Alkylgruppe und jede Gruppe R2 ist unabhängig voneinander eine mit -CO2RA2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe
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In bestimmten weiteren Ausführungsformen ist jede Gruppe R1 unabhängig voneinander eine nicht substituierte C1-C3-Alkylgruppe und jede Gruppe R2 ist unabhängig voneinander eine mit -CO2RA2 substituierte C1-C3-Alkylgruppe.
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In bestimmten weiteren Ausführungsformen bilden jeweils ein Rest R1 und ein Rest R2, die an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden sind, unabhängig von den weiteren Resten R1 und R2 einen C3- oder C4-Kohlenstoffring.
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Insbesondere bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine Molybdäncarbonyl-Verbindung, in der alle Reste R
1 und R
2 Wasserstoff sind und demzufolge folgende Formel (II) aufweist:
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Die Verbindung der Formel (II) wird auch als „Beck1“ bezeichnet und wurde beschrieben in: ACHATZ, D. et. al.: Carbonyl-Komplexe von Chrom, Molybdän und Wolfram in Isocyanacetat. Reaktionen am koordinierten Isocyanacetat. Stabilisierung von Isocyanessigsäure und Isocyanacetylchlorid am Metall. Isocyanopeptide [1]. In: Zeitschrift für anorganische und allgemeine Chemie, Vol. 631, 2005, S. 2339 - 2346 - ISSN 1521-3749.
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Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Metallcarbonyl-Verbindung mit einem Oxidationsmittel umgesetzt, wobei die Umsetzung in wässriger Phase abläuft, und die Sättigungskonzentration der Metallcarbonyl-Verbindung darin überschritten ist. Die (oxidative) Umsetzung der Metallcarbonyl-Verbindung erfordert das Inkontaktbringen der Metallcarbonyl-Verbindung mit dem Oxidationsmittel.
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In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die feste Metallcarbonyl-Verbindung neben dem festen Oxidationsmittel vor. Durch Zugabe von Wasser löst sich das Oxidationsmittel und oxidiert die (suspendierte) Metallcarbonyl-Verbindung unter Freisetzung von CO und der Bildung von wasserlöslichen Abbauprodukten.
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In einer alternativen Ausführungsform wird eine (vorformulierte) wässrige Lösung des Oxidationsmittels zu der festen Metallcarbonyl-Verbindung unter Bildung einer Suspension gegeben.
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In einer alternativen Ausführungsform wird die feste Metallcarbonyl-Verbindung in eine (vorformulierte) wässrige Lösung des Oxidationsmittels unter Bildung einer Suspension eingetragen.
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In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird die feste Metallcarbonyl-Verbindung in Wasser suspendiert und mit einer (vorformulierten) wässrigen Lösung des Oxidationsmittels versetzt. Die wässrige Suspension der Metallcarbonyl-Verbindung kann alternativ zu der (vorformulierten) wässrigen Lösung des Oxidationsmittels gegeben werden.
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In einer weiteren alternativen Ausführungsform ist die Metallcarbonyl-Verbindung in Wasser suspendiert und das Oxidationsmittel wird in fester Form in die wässrige Phase eingetragen, in der es sich dann löst.
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Bei der festen Metallcarbonyl-Verbindung kann es sich beispielsweise um ein Pulver handeln, wobei sich die mittlere Teilchengröße des Pulvers im Bereich von 0.1 µm - 1 mm liegt. Die mittlere Teilchengröße kann beispielsweise mittels Laserdiffraktometrie bestimmt werden.
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Bei dem Oxidationsmittel, das im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens Verwendung findet, handelt es sich beispielsweise um Peroxide, Perborate, Percarbonate und Nitrate, darunter beispielsweise Wasserstoffperoxid, Calciumperoxid, Dibenzoylperoxid, Carbamidperoxid, Natriumperborat, Natriumpercarbonat und Silbernitrat.
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Ferner eignen sich als Oxidationsmittel im Rahmen der vorliegenden Verbindungen oxidierende Metallsalze, beispielsweise Eisen(III)chlorid, Kaliumpermanganat, Cer(IV)sulfat, Kaliumdichromat, Gold(III)chlorid und Silbernitrat, wobei Eisen(III)chlorid, Kaliumpermanganat, und Cer(IV)sulfat, und insbesondere Eisen(III)chlorid und Cer(IV)sulfat bevorzugt sind.
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Die Konzentration des Oxidationsmittels in der wässrigen Phase liegt vorzugsweise im Bereich von 0.01 - 20 mol/L. Stärker bevorzugt ist eine Konzentration im Bereich von 0.02 - 15 mol/L. Insbesondere bevorzugt ist eine Konzentration im Bereich von 0.05 - 10 mol/L. Je größer die Konzentration des Oxidationsmittels in der wässrigen Phase ist, desto größer ist auch die oxidative Wirkung auf die darin suspendierte Metallcarbonyl-Verbindung, was Auflösungs- und Umsetzungsrate entsprechend erhöht. Die Konzentration des Oxidationsmittels in der wässrigen Lösung wird begrenzt durch die Löslichkeit des Oxidationsmittels in Wasser.
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Vorzugsweise wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine wässrige Lösung des Oxidationsmittels vorformuliert, was durch Lösen des Oxidationsmittels in Wasser geschieht. Dies hat den Vorteil, dass sich das Oxidationsmittel zunächst unabhängig von der eigentlichen Umsetzung lösen kann. Die Konzentration des Oxidationsmittels in dieser vorformulierten Lösung liegt vorzugsweise ebenfalls im Bereich von 0.01 - 20 mol/L, stärker bevorzugt im Bereich von 0.02 - 15 mol/L, insbesondere bevorzugt im Bereich von 0.05 - 10 mol/L. Diese vorformulierte wässrige Lösung des Oxidationsmittels wird dann vorzugsweise zu der festen Metallcarbonyl-Verbindung gegeben.
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Eisen(III)chlorid wird vorzugsweise in vorformulierter wässriger Lösung verwendet. Die Konzentration der Lösung beträgt vorzugsweise 1 - 5.7 mol/L, stärker bevorzugt 2 - 4 mol/L. Cer(IV)sulfat wird ebenfalls vorzugsweise in vorformulierter wässriger Lösung verwendet, wobei die Konzentration der Lösung vorzugsweise im Bereich von 0.01 - 0.2 mol/L, stärker bevorzugt im Bereich von 0.05 - 0.1 mmol/L liegt. Diese Lösungen werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens dann vorzugsweise zu der festen Metallcarbonyl-Verbindung gegeben.
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Neben Eisen(III)chlorid und Cer(IV)sulfat ist auch Wasserstoffperoxid (H2O2) ein bevorzugtes Oxidationsmittel. Wasserstoffperoxid kann kommerziell als 30 Gew.-%ige (w/w) wässrige Lösung (entspricht einer Konzentration von etwa 9.8 mol/L) erworben werden kann (beispielsweise von Sigma Aldrich) und auch in dieser Form im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als vorformulierte wässrige Lösung, die dann zu der festen Metallcarbonyl-Verbindung gegeben wird, verwendet werden. Alternativ kann die 30%ige wässrige Wasserstoffperoxid-Lösung auch weiter mit Wasser verdünnt werden, beispielsweise um die Hälfte, um das Fünffache oder um das Zehnfache, bevor sie zu der festen Metallcarbonyl-Verbindung gegeben wird.
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Insbesondere ist im Rahmen der hierin beschriebenen Erfindung die Verwendung von Eisen(III)chlorid, Cer(IV)sulfat und Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel in Verbindung mit der Metallcarbonyl-Verbindung „Beck1“ als CO-freisetzende Verbindung bevorzugt, da diese Freisetzungspaare hohe Auflösungs- und Umsetzungsraten, sowie Nutzlasten von ≥95%, welche innerhalb von 15 Minuten erbracht werden, hervorbringen. Weiterer Vorteil ist, dass das erzeugte CO eine große Reinheit aufweist, die über 95% liegt. Die Verwendung von Eisen(III)chlorid als Oxidationsmittel hat zudem den Vorteil, dass Beck1 in höher oxidierte Eisenmolybdat-Verbindungen überführt wird, deren Toxizität gering ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht vorzugsweise die Umsetzung von gering wasserlöslichen, und insbesondere die Umsetzung von schwer wasserlöslichen Metallcarbonyl-Verbindungen in Konzentrationsbereichen, in denen konventionelle Freisetzungssysteme wie oben beschrieben aufgrund der Schwerlöslichkeit der Metallcarbonyl-Verbindung nicht oder nur langsam CO freisetzen.
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Wie bereits oben bemerkt, sind Konzentration der Metallycarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase von bis zu 500 mg/mL geeignet zur Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vorzugsweise liegt die Konzentration der Metallcarbonyl-Verbindung im Bereich von 10 - 500 mg/mL, stärker bevorzugt im Bereich von 10 - 250 mg/mL, noch stärker bevorzugt im Bereich von 25 - 250 mg/mL und insbesondere bevorzugt im Bereich von 150 - 250 mg/mL.
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Ab Konzentration von >500 mg/mL reagiert das Freisetzungspaar nicht mehr vollständig zu wasserlöslichen Produkten ab, deshalb sind Konzentrationen der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase von >500 mg/mL nicht mehr geeignet zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.
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Die zuvor genannten Konzentrationsangaben der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase beziehen sich auf die eingesetzte Menge der Metallcarbonyl-Verbindung, die pro Volumeneinheit der wässrigen Phase zu Beginn der oxidativen Umsetzung (also im „Zeitpunkt 0“) vorliegt. Werden also beispielsweise 25 mg einer Metallcarbonyl-Verbindung in 1 mL einer (vorformulierten) wässrigen Lösung des Oxidationsmittels suspendiert, so entspricht dies einer Konzentration der Metallcarbonyl-Verbindung in der wässrigen Phase von 25 mg/mL.
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Das erfindungsgemäße Verfahren, in welchem die Metallcarbonyl-Verbindung in wässriger Phase über ihrer Sättigunkskonzentration, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von 10 - 500 mg/mL umgesetzt wird, ermöglicht somit die schnelle CO-Freisetzung aus diesen Verbindungen in einem begrenzten Volumen, was beispielsweise für gastrointestinale Freisetzungssysteme von Vorteil ist. Gastrointestinale Freisetzungssysteme sollen sowohl Volumen als auch Dimensionen einer normalen Kapsel (Volumen: Kapselgröße 0; 0.68 mL) nicht überschreiten. Nimmt man an, dass das System höchstens zu ¾ mit wässriger Lösung und das restliche Volumen mit lediglich 5 mg CORM befüllt werden kann, so entspricht dies einer Konzentration von etwa 10 mg/mL. Schwer lösliche Metallcarbonyl-Verbindungen sind in einer normalen wässrigen Lösung in diesem Konzentrationsbereich jedoch nicht löslich, weshalb konventionelle Methoden wie oben beschrieben zur CO-Freisetzung in diesen Konzentrationsbereichen (≥10 mg/mL) schlechter, nicht mit der ggf. geforderten rapiden Freisetzungskinetik, oder gar nicht funktionieren und dementsprechend weniger CO freigesetzt wird.
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Durch Reaktion des Oxidationsmittels mit der Metallcarbonyl-Verbindung wird diese oxidiert, wobei unter Bildung wasserlöslicher, höher oxidierter Abbauprodukte schnell große Mengen CO freigesetzt werden.
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Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren betrifft die vorliegende Erfindung ein Freisetzungssystem zur Erzeugung von CO wie in Anspruch 8 definiert.
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Das erfindungsgemäße Freisetzungssystem eignet sich zur therapeutischen Verwendung, insbesondere in der Behandlung von Entzündungserkrankungen, vorzugsweise Entzündungserkrankungen des Magen-Darm-Traktes. Das Freisetzungssystem der vorliegenden Erfindung kann demzufolge in der Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen, Morbus Crohn, Gastritis, diabetische Gastroparese oder postoperative Ileus verwendet werden. Das erfindungsgemäße Freisetzungssystem kann darüber hinaus zur Behandlung von Sepsis, Sichelzellen-Anämie, Hypertension, ideopathische pulmonäre Fibrose, chronische obstruktive Lungenerkrankung oder Atemnotsyndrom verwendet werden. Außerdem eignet es sich zur Verwendung im Rahmen von Organtransplantationen, wie beispielsweise einer Nierentransplantation.
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Wie bereits oben erwähnt, sind hierfür besonders Freisetzungssysteme geeignet, welche eine Molybdäncarbonyl-Verbindung der allgemeinen Formel (I) als CO-freisetzende Verbindung verwenden, da diese durch Oxidation von der Oxidationsstufe 0 in Verbindungen mit stabilerer Oxidationsstufen überführt werden (etwa 4, oder 6) überführt wird, welche eine geringe Toxizität aufweisen. Insbesondere bevorzugt in einem therapeutischen Freisetzungssystem ist die oxidative Freisetzung aus Beck1 mittels Eisen(III)chlorid als Oxidationsmittel, da dies zur Bildung von einheitlichem Eisenmolybdat als Abbauprodukt führt.
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In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Freisetzungssystems werden die metallhaltigen Abbauprodukte der Oxidationsreaktion am Austreten gehindert. Hierzu kann beispielsweise eine Silikonmembran wie in STEIGER, C. et. al.: Controlled therapeutic gas delivery systems for quality-improved transplants. In: European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol. 97, 2015, S. 96 - 106 - ISSN 1873-3441 beschrieben verwendet werden. Die Verwendung einer Silikonmembran ermöglicht es, Gas mit einer kontrollierbaren Kinetik freizusetzen und gleichzeitig das Austreten von nicht gasförmigen Abbauprodukten des Freisetzungspaares zu verhindern. Dies ist insbesondere in therapeutischen Freisetzungssystemen vorteilhaft, da die Abbauprodukte der Oxidationsreaktion damit nicht im Körper freigesetzt werden, sondern wieder ausgeschieden werden können.
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In einer darauf aufbauenden Ausführungsform sind die Freisetzungssysteme mit einem weiteren Sicherheitsmechanismus ausgestattet, welcher verhindert, dass das Freisetzungssystem ungewollt komplett entleert wird, sollte es zu einer Einschränkung der Membranintegrität kommen. Es ist entsprechend vorteilhaft, nicht gasförmige Produkte, welche aus der Reaktion des Freisetzungspaares hervorgehen, an einen absorbierenden Stoff, insbesondere einen Superabsorber, zu binden. Dies ist jedoch lediglich möglich, wenn i) die Freisetzungsreaktion des Paares schneller vonstattengeht als die Absorption von Lösungsmitteln an den Superabsorber, oder ii) minimale Mengen Lösungsmittel ausreichen, um die gasfreisetzende Verbindung umzusetzen. Anderenfalls würde der Superabsorber das für die Reaktion benötigte Medium aufnehmen und die Reaktion des Freisetzungspaares einschränken oder verhindern. Die hierin beschriebene oxidative CO-Freisetzung läuft rapide innerhalb weniger Sekunden ab. Entsprechend kann CO freigesetzt werden, und nicht gasförmige Produkte an den Superabsorber absorbiert werden. Ein Beispiel für Superabsorber, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist Favor® von Evonik. Ein Beispiel für einen weiteren absorbierenden Stoff, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist AEROPERL® von Evonik.
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Weiterhin kann das erfindungsgemäße Freisetzungssystem verwendet werden zur CO-Begasung von extrakorporalen Transplantaten (Organen), extrakorporalen Zellen, hirntoten Transplantat-Donoren oder Lebensmitteln (wie beispielsweise Fleisch).
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Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, die den beanspruchten Gegenstand jedoch nicht einschränken sollen.
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Figurenliste
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- : CO-Freisetzungsverlauf für das Freisetzungspaar Beck1/Eisen(III)chlorid bei BECK1 Konzentrationen von 5 mg/mL und 50 mg/mL (Beispiel 1).
- : Nephelometrische Analyse verschiedener Beck1 Suspensionen (Beispiel 2).
- : Schematische Darstellung einer Apparatur zur Messung des freigesetzten Gasvolumens. Über eine Spritze kann in ein gasdicht verschlossenes Glasgefäß oxidative Freisetzungslösung zur Probe der CO-freisetzenden Verbindung hinzu injiziert werden. CO im Gasraum wird anschließend mit einem amperometrischen Gassensor quantifiziert (Beispiel 3).
- : A) Oxidative Freisetzung von CO aus Beck1 in Anwesenheit von Superabsorber in unterschiedlichen Konzentrationen von 0.025 - 0.15 mg/µL. Repräsentative Aufnahmen von an B) unvollständig (0.025 mg/µL Superabsorber) und C) vollständig (0.1 mg/µL Superabsorber) an Superabsorber absorbierte Produkten nach vollständiger CO Freisetzung (Beispiel 7).
- : Permeation von Fluoresceinlösung (0.1 mg/mL) mit und ohne Superabsorber (Favor®, 0.1 mg/mL) in einem Modelsystem für membranbasierte Gasfreisetzungssysteme. Nach Perforation der Silikonmembran ist im Akzeptormedium des Aufbaus mit Superabsorber (Favor®, 0.1 mg/mL) eine im Vergleich zur Kontrolle (ohne Superabsorber) reduzierte Fluoreszenzintensität detektierbar (Beispiel 7).
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Beispiele
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Beispiel 1: Freisetzungsverlauf von Beck1 aus wässriger Eisen(III)chlorid-Lösung
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Im vorliegenden Beispiel wurde die CO-Freisetzung aus Beck1 mit Hilfe einer 3M wässrigen Eisen(III)chlorid-Lösung bei unterschiedlichen Beck1 Konzentrationen untersucht.
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Methode: Die Analyse des Freisetzungsverlaufs wurde analog STEIGER, C. et. al.: Prevention of colitis by controlled oral drug delivery of carbon monoxide. In: Journal of Controlled Release, Vol. 239, 2016, S. 128 - 136 - ISSN 1873-4995 durchgeführt. Das für diesen Versuch verwendete Analysengerät ist in gezeigt.
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1 mg bzw. 10 mg Beck1 wurde innerhalb des Analysengeräts mit 200 µL 3M Eisen(III)chlorid versetzt, sodass Beck1 Konzentrationen von 5 mg/mL bzw. 50 mg/mL erhalten wurden. Die intrinsische Löslichkeit von Beck 1 in Wasser beträgt 7.3 mg/mL (bestimmt mittels potentiometrischer Titration bei 25 °C mit einem Sirius T3 (Sirius Analytical, Forest Row, Großbritannien)) (BALK, A. et. al.: lonic Liquid versus prodrug strategy to address formulation challenges. In: Pharmaceutical Research, Vol. 32, S. 2154 - 2167 - ISSN 0724-8741). Damit war die 5mg/mL Probe untersättigt (Vergleichsbeispiel) und die 50 mg/mL Probe übersättigt (erfindungsgemäßes Beispiel).
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Das Analysengerät wurde geschlossen. Die Lösung wurde bei 150 rpm gerührt (Variomag Telesystem, Thermo Scientific, MA). Der Freisetzungsverlauf wurde im Gasraum über der Lösung mit einem Wasserstoff-kompensierten XXS CO/H2 comp Sensor von Draeger (Lübeck; Deutschland) verfolgt und mit einem X-am 5000 Gasdetektor (Draeger) aufgezeichnet.
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Ergebnisse: Der CO Freisetzungsverlauf der beiden Proben ist in gezeigt. Demnach ist der CO-Freisetzungsverlauf im Falle der erfindungsgemäßen Probe (50 mg/mL) in den ersten 5 Minuten wesentlich steiler als in der Vergleichsprobe (5 mg/mL). Dies bedeutet, dass der CO-Anteil, der in den ersten 5 Minuten freigesetzt wird, höher im Falle der erfindungsgemäßen Probe als in der Vergleichsprobe ist.
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Kontrollexperimente mit reinem Wasser zeigten in den angewendeten Messintervallen keine CO Freisetzung.
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Beispiel 2: Nephelometrische Analyse verschiedener Beck1 Suspensionen
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Methode: 2 mg Beck1 wurden in eine 96 Well Platte (Corning 96) gegeben. Dazu wurden jeweils 200 µL Wasser, 0.5 M Salzsäure (HCl), 0.05 M NaOH und 30% Wasserstoffperoxid-Lösung unter Bildung einer Suspension gegeben. Die intrinsische Löslichkeit von Beck 1 in Wasser beträgt 7.3 mg/mL (bestimmt mittels potentiometrischer Titration bei 25 °C mit einem Sirius T3 (Sirius Analytical, Forest Row, Großbritannien)) (BALK, A. et. al.: lonic Liquid versus prodrug strategy to address formulation challenges. In: Pharmaceutical Research, Vol. 32, S. 2154 - 2167 - ISSN 0724-8741). Die Zusammensetzung der vier Proben ist in der folgenden Tabelle 1 zusammen gefasst. Tabelle 1: Verschieden Suspensionen von Beck1 mit Konzentrationen von 10 mg/mL
Eintrag | CORM | Medium | Konzentration [mg/mL] |
1 | Beck1 | Wasser | 10 |
2 | Beck1 | 0.5 M HCl | 10 |
3 | Beck1 | 0.05 M NaOH | 10 |
4 | Beck1 | 30%ige H2O2 | 10 |
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Nach 15 min wurden die Proben mit einer Pipettenspitze aufgerührt, um Gasblasen (nur sichtbar in der Wasserstoffperoxid-Gruppe) aus der Lösung freizusetzen, und nephelometrisch vermessen (Nephelometer Gain: 50; Laser Intensität: 80 %; Beam focus: 2.5 mm).
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Die Ergebnisse der nephelometrischen Analyse sind in gezeigt.
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Ergebnisse: zeigt eine deutlich stärkere Trübung („Turbity“) der Proben ohne Wasserstoffperoxid, was auf eine mangelhaft Auflösungs- bzw. Umsetzungsrate von Beck1 schließen lässt. Dagegen löst sich Beck1 in der Wasserstoffperoxid-Lösung innerhalb 15 Minuten durch Umsetzung in wasserlösliche Produkte auf.
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Die Ergebnisse zeigen, dass durch oxidative Freisetzung von CO aus Beck1 die Auflösungs- und Umsetzungsrate der Verbindung erhöht wird. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich somit, um Beck1 im suspendierten, d.h. größtenteils ungelösten Zustand in seiner Funktion als CORM verwenden zu können.
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Beispiel 3: Auflösungs- und Umsetzungsrate bei höheren Konzentrationen
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Methode: Beck1 wurde mit 200 µL oxidativer Freisetzungslösung (30 %ige (w/w) Wasserstoffperoxid-Lösung, 3 M wässriger Eisen(III)chlorid-Lösung, oder 60 mM wässriger Cer(IV)sulfat-Lösung) versetzt, sodass Konzentrationen wie in der folgenden Tabelle 2 angegeben erhalten wurden. Als Vergleich wurde Wasser verwendet.
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Nach 10 Minuten wurde die Auflösung von Beck1 in den jeweiligen Suspensionen visuell evaluiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Auflösung- und Umsetzung von Beck1 in Konzentrationen > 10 mg / mL
Eintrag | Medium | Konzentration Beck 1 | Visuelle Evaluierung nach 10 Minuten |
1 | Wasser | 25 mg/mL | Keine visuelle Änderung der Suspension |
2 | Wasserstoffperoxid (30%ig) | 25 mg/mL | Vollständige Auflösung von Beck 1 gemäß visueller Analyse |
3 | Wasserstoffperoxid (30%ig) | 250 mg/mL | Vollständige Auflösung von Beck 1 gemäß visueller Analyse |
4 | Eisen(III)chlorid (3 M) | 25 mg/mL | Vollständige Auflösung von Beck 1 gemäß visueller Analyse |
5 | Eisen(III)chlorid (3 M) | 250 mg/mL | Vollständige Auflösung von Beck 1 gemäß visueller Analyse |
6 | Cer(IV)sulfat (60 mM) | 25 mg/mL | Vollständige Auflösung von Beck 1 gemäß visueller Analyse |
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Ergebnisse: Beck1 reagiert in oxidativen wässrigen Lösungen von Wasserstoffperoxid und Eisen(III)chlorid bei einer Konzentration von 250 mg/mL, und in oxidativer wässriger Lösung von Cer(IV)sulfat bei einer Konzentration von 25 mg/ml unter CO Freisetzung komplett zu wasserlöslichen Produkten ab (Tabelle 2).
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Beispiel 4: Quantität der Freisetzung / Nutzlast
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Methode: Der Freisetzungsverlauf wurde nach einer kürzlich beschriebenen amperometrischen Methode verfolgt (STEIGER, C. et. al.: Controlled therapeutic gas delivery systems for quality-improved transplants. In: European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol. 97, 2015, S. 96 - 106 - ISSN 1873-3441). Dazu wurden 4 mg Beck1 innerhalb eines Analysengerätes ( ) mit 100 µL oxidativer Freisetzungslösung (30 %ige (w/w) Wasserstoffperoxid-Lösung, 3 M Eisen(III)chlorid-Lösung oder 60 mM Cer(IV)sulfat-Lösung)versetzt. Die Lösungen wurden direkt über eine Perfusor® Leitung aus Polyethylen (B.Braun, Melsungen, Deutschland) in ein mit Beck1 beladenes Glasreservoir (d = 1 cm h = 0.5 cm) in das geschlossene Analysengefäß zugeführt. Die Luft im Analysengerät, als auch die Flüssigkeit im Glasreservoir wurde bei 200 rpm gerührt (Variomag Telesystem, Thermo Scientific, MA). Der Freisetzungsverlauf wurde im Gasraum über der Lösung mit einem Wasserstoff kompensierten XXS CO/H2 comp Sensor von Draeger (Lübeck, Deutschland) verfolgt und mit einem X-am 5000 Gasdetektor (Draeger) aufgezeichnet. Das Volumen des Analysengefäßes wurde mit Wasser bestimmt. Aus der Konzentration an CO im Plateau des Freisetzungsverlaufs wurde entsprechend die Nutzlast bestimmt (Methode 1, Tabelle 3). Dazu wurde die Konzentration an CO im Plateau des Freisetzungsverlaufs (V/V) ins Verhältnis gesetzt zur Konzentration, die bei der kompletten Freisetzung des theoretisch freisetzbaren Volumen an CO aus Beck1 im Analysengefäß entstehen würde (berechnet als Idealvolumen unter Normbedingungen (25 °C, 1 bar) V/V).
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In einem daran anschließenden Versuch wurde volumetrisch das aus Beck1 freigesetzte Gasgesamtvolumen bestimmt (Methode 2, Tabelle 3). Diese Ausschlussmethode wurde gewählt um andere potentiell entstehende Gase volumetrisch zu erfassen, da diese ggf. durch die oben gezeigte Methode nicht Nachweisbar sind. Dazu wurden 2 mg Beck1 in eine 1 mL Spritze (B. Braun, Melsungen, Deutschland) eingewogen und diese auf 0.2 mL aufgezogen. Anschließend wurden 50 µL Oxidationslösung in die Spritzenspitze pipettiert und die Spritze mit einem Combi-Stopper verschlossen. Durch Drehen der Spritze wurde die Oxidationslösung mit dem Beck1 vermischt und die Expansion des Gases an der Spritzenskala abgelesen. Der Spritzenkolben wurde mit Silikonöl (Typ 350, Momentive Performance Materials GmbH, Leverkusen, Deutschland) ausgekleidet um Volumenkompression durch Reibung zu minimieren.
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Das Gasgesamtvolumen wurde mit dem theoretisch freisetzbaren Volumen an CO aus Beck1 im Analysengefäß verglichen (berechnet als Idealvolumen unter Normbedingungen (25 °C, 1 bar) V/V). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Nutzlast (freigesetzter Menge an CO pro theoretisch freisetzbare Menge) der oxidativen Freisetzung von CO aus Beck1
Oxidative Freisetzungslösung | Wasserstoffperoxid | Eisen(III)chlorid | Cer(IV)sulfat |
Nutzlast (Methode 1) | ≥ 95 % | ≥ 97 % | ≥ 96 % |
Anteil CO an freigesetztem Gas (Methode 2) | 100 % | Nicht bestimmt | Nicht bestimmt |
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Ergebnisse: Die oxidative Freisetzung von CO aus Beck1 ermöglicht eine ≥ 95 % Nutzlast des Freisetzungspaares erbracht in einem Zeitraum von ≤ 10 Minuten (Tabelle 3). Dabei ist die Reinheit des freigesetzten CO ≥ 95 % (Tabelle 3).
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Beispiel 5: Abbauprodukte
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Methode: Zum Nachweis von Molybdaten/Peroxomolybdaten als Reaktionsprodukte mit hohen Oxidationszahlen des Freisetzungspaares Beck1 und Wasserstoffperoxid wurde die durch die Reaktion von 12 mg Beck1 mit 3 mL Wasserstoffperoxid (30 % v/v) entstandene gelbe Lösung mit 200 µL einer 0.1 M Natriumthiosulfatlösung zu einer blauen kolloidalen Lösung reduziert.
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Ergebnisse: Die Reduktion von angesäuerter Molybdatlösung liefert eine blaue kolloidale Lösung (Molybdänblau) (REMY, H.: Lehrbuch der Anorganischen Chemie. Band II. 11. Auflage. Leipzig: Akademische Verlagsgesellschaft Geest & Portig, 1961, S. 205 - 206). Miterfasst werden potentiell entstehende Peroxomolybdaten, welche bei der Reaktion von Molybdaten mit Wasserstoffperoxid entstehen (CHAI, X.-S. et. al.: Rapid determination of hydrogen peroxide in the wood pulp bleaching streams by a dual-wavelength spectroscopic method. In: Analytica Chimica Acta, Vol. 507, 2004, S. 281 - 284 - ISSN: 1873-4324).
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Beispiel 6: Membranpermeabilität der Abbauprodukte
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Ein kürzlich beschriebenes Gasfreisetzungssystem ist von einer Silikonmembran umgeben (STEIGER, C. et. al.: Controlled therapeutic gas delivery systems for quality-improved transplants. In: European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol. 97, 2015, S. 96 - 106 - ISSN 1873-3441). Diese ermöglicht es, therapeutisches Gas mit einer kontrollierbaren Kinetik freizusetzen und gleichzeitig das Austreten von nicht gasförmigen Abbauprodukten des Freisetzungspaares zu verhindern. Die zuverlässige Retention wurde entsprechend für jene Produkte evaluiert, die bei der oxidativen Freisetzung von Beck1 entstehen. Als Modelfreisetzungspaar diente Beck1 und Wasserstoffperoxid.
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Methode: Für die Permeationsversuche wurde eine Franzzelle von Duran (Wertheim, Deutschland) verwendet. Eine 15 µm dicke Silikonmembran (Dow Corning, Midland, MI) wurde mit 2 mL 1 Vol-%ige Wasserstoffperoxid-Lösung beschickt, in der 60 mg Beck1 aufgelöst wurden. Der Permeationsversuch wurde über 24 Stunden mit einer konstanten Temperatur von 37 °C durchgeführt (B3 Haake, Vreden, Germany). Das (basale) Akzeptormedium (Wasser, 15 mL) wurde bei 150 rpm gerührt (Variomag Telesystem, Thermo Scientific, MA). Der Molybdängehalt des Akzeptormediums wurde mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS, Varian, Darmstadt, Germany) bestimmt. Als Kontrolle wurde die Silikonmembran unter sonst gleichen Versuchsbedingungen mit 2 mL Wasser beschickt. Verwendet wurde in allen Fällen Millipore Wasser (Merck, Darmstadt Deutschland).
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Ergebnisse: Nach 24 Stunden konnte sowohl in der Kontroll- als auch in der Referenzgruppe kein Molybdän detektiert werden (< 0.1 ppb). Silikon ist nicht permeabel für die entsprechenden Abbauprodukte.
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Beispiel 7: Absorption der Abbauprodukte
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Methode: In dem unter Beispiel 4 (Quantität der Freisetzung / Nutzlast) beschriebenen analytischen Setup wurden 4,5 mg Beck1 und Superabsorber (Favor®, Evonik, Darmstadt, Deutschland, Mengen: 0, 5, 10, 20, sowie 30 mg), welche in einem 2 mL Mikroreaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) vermengt wurden, eingebracht. Die Freisetzungsreaktion wurde mit 200 µL einer 10 Vol-%igen Wasserstoffperoxid-Lösung gestartet. In einem darauf aufbauenden Versuch wurde der unter Beispiel 4 (Membranpermeabilität der Abbauprodukte) beschriebene Franzzellaufbau verwendet, um den Sicherheitsmechanismus anhand eines Modelsystems für membranbasierte Gasfreisetzungssysteme zu demonstrieren. Die Silikonmembran wurde in diesem Fall mit 5 mL einer 0.1 mg/mL Fluoresceinlösung, welche auf 500 mg Superabsorber (Favor®) gegeben wurden, beschickt. Anschließend wurde die Membran mit einer 18G Kanüle (B.Braun, Melsungen, Deutschland) einfach perforiert und der Aufbau für 60 Minuten bei 37°C und 300 rpm (siehe Oben) betrieben. Das Akzeptormedium wurde nach Abschluss des Versuches (20.5 mL Wasser) mit einem LS50D (Perkin Elmer, Waltham, MA) fluorimetrisch untersucht. Als Kontrolle dienten 5 mL Fluoresceinlösung ohne Superabsorber, sowie die Lösung aus einem identischen Versuch mit intakter Membran.
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Ergebnisse: Die Kinetik der oxidativen Freisetzung von CO aus Beck1 ist unabhängig von der verwendeten Konzentration an Superabsorber (Favor®, 0.025 - 0.15 mg / µL, siehe ). Dieser Konzentrationsbereich (0.1 mg / mL) ist ausreichend um Fluorescein in einem Defektmodell für Silikonmembran-basierte Gasfreisetzungssysteme innerhalb des Systems zurückzuhalten ( ) und so zu einem verbesserten Sicherheitsprofil dieser Technologie beizutragen.