CN112245577A - 一种猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明所述猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，基于盐离子缓冲液体系，并添加糖类、非离子表面活性剂、金属离子螯合剂、醇类、蛋白质类稳定剂、氨基酸类以及防腐剂，可有效延长猪圆环病毒2型Cap蛋白的保存期，在2‑8℃可以保存12个月，蛋白浓度和活性保持不变，于‑20℃以下保存36个月保持蛋白浓度和活性不变，可用于检测猪圆环病毒抗原浓度试剂盒的标准蛋白的保存液，或者猪圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗的稀释溶液。

Description

一种猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液及应用
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液配方，并进一步公开其应用。
背景技术
猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2，PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。其中，猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征等相关疾病的首要致病因子，给养猪业造成巨大的经济损失。据报道，猪圆环病毒2型（PCV2）在世界范围内广泛分布，血清学和病原学调查己证实全世界范围内许多国家和地区的猪群均存在PCV2感染，几乎100%的商品化养猪场感染过PCV2，严重影响世界养猪业的发展。
我国在2000年首次报道了猪圆环病毒病，至今PCV2已在我国猪群中流行二十年。PCV2通常与其他多种病原混合感染，引发猪群发生严重的死亡率，较严重的地区暴病时死淘率高达40%。大量的流行病学研究表明，我国猪群中PCV2感染十分普遍，PCV2抗体阳性率高达80%以上，被调查的猪场阳性率高达100%。在2001-2012年期间，中国分离了258株PCV2株，其中有242株序列均为PCV2b基因亚型，约占比93.8%，证明我国近几年流行的毒株为PCV2b 亚型。近年来研究发现，猪圆环病毒2型ORF2基因Cap蛋白可以在细胞内自主组装成病毒样颗粒（VLPs），这种病毒样颗粒不含病毒核酸但与天然病毒样粒子结构相似，且能有效继发细胞免疫和体液免疫。猪圆环病毒2型Cap蛋白作为一种蛋白质，具有蛋白质惯有的不稳定性、易降解失活等特性，并需要低温保存，因此，寻找开发一种能够稳定保存猪圆环病毒2型Cap蛋白的保存液，对于保证猪圆病毒Cap蛋白的天然活性和浓度稳定具有重要意义，也为特异稳定的检测猪圆环病毒抗原的试剂盒开发以及猪圆环病毒Cap蛋白制备的亚单位疫苗的稳定保存提供保障。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液配方，以解决现有技术中Cap 蛋白的的保存液稳定性差，而导致的保存困难的问题；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种用于检测猪圆环病毒2型Cap蛋白的校准品和质控品的保存液；
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种猪圆环亚单位疫苗的效力性。
为了解决上述技术问题，本发明所述一种猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，包括盐离子缓冲液，以及如下浓度的组分：
糖类1-5wt%；
非离子表面活性剂0.1-0.5wt%；
金属离子螯合剂1-5mM；
醇类1-10wt%；
蛋白质稳定剂0.1-1.5wt%；
氨基酸0.5-1.5wt%；
防腐剂0.001-0.05wt%。
具体的，所述盐离子缓冲液的浓度为20-150mM。
具体的，所述盐离子缓冲液包括磷酸盐缓冲液或Tris-HCI缓冲溶液中的至少一种。
具体的，所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液：
所述糖类包括蔗糖或海藻糖中的至少一种；
所述非离子表面活性剂包括Tween-20或Tween-80中的至少一种；
所述金属离子螯合剂包括EDTA；
所述醇类包括甘油、甘露醇或山梨醇中的至少一种；
所述蛋白质稳定剂包括BSA、明胶或酪蛋白中的至少一种；
所述氨基酸包括赖氨酸或精氨酸中的至少一种；
所述防腐剂包括山梨酸及其盐类或双乙酸钠中的至少一种。
本发明的一个优选的技术方案中，所述的盐离子缓冲液为20mM/ml的Tris-HCI缓冲溶液。
本发明的一个优选的技术方案中，所述的糖类包括：蔗糖1wt%或海藻糖1wt%。
本发明的一个优选的技术方案中，所述的非离子表面活性剂包括：Tween-20为0.1wt%或Tween-80为0.1wt%。
本发明的一个优选的技术方案中，所述的金属离子螯合剂为EDTA浓度为1mM/ml。
本发明的一个优选的技术方案中，所述的醇类包括：甘油5wt%或甘露醇5wt%。
本发明的一个优选的技术方案中，蛋白质稳定剂包括：明胶0.1wt%。
本发明的一个优选的技术方案中，所述的氨基酸类包括：赖氨酸0.5wt%或精氨酸0.5wt%中的一种。
本发明的一个优选的技术方案中，所述防腐剂包括：山梨酸0.001wt%或双乙酸钠0.005wt%。
本发明还公开了所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液的使用方法，包括将所述猪圆环病毒2型Cap蛋白置于所述保存液中进行保存的步骤。
具体的，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的浓度为20ug/ml-3mg/ml。
具体的，所述保存液的使用量占所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的体积含量为5-15v/v%
本发明还公开了一种标准物质，包括所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，以及，分散在所述保存液中的猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原。
本发明还公开了所述的标准物质用于制备检测猪圆环病毒抗原的校准品和/或质控品的用途。
本发明还公开了一种亚单位疫苗，包括所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，以及，分散在所述保存液中的Cap蛋白抗原以及其与佐剂乳化制备的亚单位疫苗。
本发明所述猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，基于盐离子缓冲液体系，并添加糖类、非离子表面活性剂、金属离子螯合剂、醇类、蛋白质类稳定剂、氨基酸类以及防腐剂；其中，氨基酸是很好的抗氧化剂；各种糖能起到保护抗原抗体活性的作用；离子螯合剂有多重功效，如抗氧化、防腐，亦可防止一些离子沉积；甘油、山梨醇等醇类物质可以保持抗原抗体表面的滋润，使其不至于因失水而失活；另外一些水溶性杂蛋白或化学惰性的高分子物质的聚合物（如PEG等）则因其分子量大，能够在抗原抗体表面形成一种保护膜，使蛋白结构免遭破坏；再者，随着保存时间的延长，抗原抗体及稳定剂中的氨基酸、糖类等有机物易受到空气、水中微生物的腐蚀，防腐剂的加入可有效避免上述情形。
本发明所述猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液可有效延长猪圆环病毒2型Cap 蛋白的保存期，所述保存液的优选使用比例为5%-15%，主要可用于纯化后的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子的保存，优选控制Cap蛋白病毒样粒子的浓度在20ug/ml-3mg/ml时，在2-8℃可以保存12个月，蛋白浓度和活性保持不变，于-20℃以下保存36个月保持蛋白浓度和活性不变，可用于检测猪圆环病毒抗原浓度试剂盒的标准蛋白的保存液，或者猪圆环病毒2型Cap 蛋白亚单位疫苗的稀释溶液。
附图说明
图1为本发明加速试验检测蛋白浓度SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1为62.5ug/mlBSA；泳道2为125ug/mlBSA；泳道3为250ug/ml BSA；泳道4为Protein Marker，由下到上依次25kDa、30 kDa 、40 kDa 、50 kDa 、70 kDa、100 kDa、120 kDa；泳道5为保存18个月的蛋白样品电泳条带；泳道6为保存12个月的蛋白样品电泳条带；泳道7为保存6个月的蛋白样品电泳条带；泳道8为保存1个月的蛋白样品电泳条带。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例所述猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液的配置，包括如下步骤：
（1）配制20mM/ml的Tris-HCI缓冲溶液，备用；基于所述Tris-HCI缓冲溶液，配制如下浓度的组分：蔗糖1wt%、海藻糖1wt%、Tween-20 0.1wt%、EDTA 浓度2mM、甘油5wt%、明胶0.1wt%、赖氨酸0.5wt%、精氨酸0.5wt%、山梨酸0.001wt%，备用；
（2）向上述缓冲液中顺次加入所述糖类、非离子表面活性剂、金属离子螯合剂、醇类、蛋白质稳定剂、氨基酸和防腐剂，500rpm/ml混匀10min后，加入浓度为200ug/ml的猪圆环病毒2型Cap蛋白，控制所述保存液的使用量占所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的体积比例为15v/v%，1000rpm/ml混匀10min，并放入2-8℃或者-20℃保存。
实施例2
本实施例所述猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液的配置，包括如下步骤：
（1）配制20mM/ml的Tris-HCI缓冲溶液，备用；基于所述Tris-HCI缓冲溶液，配制如下浓度的组分：蔗糖1wt%、海藻糖1wt%、Tween-20 0.1wt%、EDTA 浓度1mM、甘露醇5wt%、明胶0.1wt%、赖氨酸0.5wt%、精氨酸0.5wt%、双乙酸钠0.005wt%，备用；
（2）向上述缓冲液中顺次加入所述糖类、非离子表面活性剂、金属离子螯合剂、醇类、蛋白质稳定剂、氨基酸和防腐剂，500rpm/ml混匀10min后，加入浓度为20ug/ml的猪圆环病毒2型Cap蛋白，控制所述保存液的使用量占所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的体积比例为5v/v%，1000rpm/ml混匀10min，并放入2-8℃或者-20℃保存。
实施例3
本实施例所述猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液的配置，包括如下步骤：
（1）配制100mM/ml的Tris-HCI缓冲溶液，备用；基于所述Tris-HCI缓冲溶液，配制如下浓度的组分：蔗糖2wt%、海藻糖3wt%、Tween-80 0.5wt%、EDTA 浓度5mM、山梨醇10wt%、明胶1.5wt%、赖氨酸0.5wt%、双乙酸钠0.005wt%，备用；
（2）向上述缓冲液中顺次加入所述糖类、非离子表面活性剂、金属离子螯合剂、醇类、蛋白质稳定剂、氨基酸和防腐剂，500rpm/ml混匀10min后，加入浓度为3mg/ml的猪圆环病毒2型Cap蛋白，控制所述保存液的使用量占所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的体积比例为15v/v%，1000rpm/ml混匀10min，并放入2-8℃或者-20℃保存。
实施例4
本实施例所述猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液的配置，包括如下步骤：
（1）配制80mM/ml的Tris-HCI缓冲溶液，备用；基于所述Tris-HCI缓冲溶液，配制如下浓度的组分：蔗糖0.5wt%、海藻糖0.5wt%、Tween-20 0.2wt%、Tween-80 0.2wt%、EDTA 浓度3mM、甘露醇1wt%、酪蛋白1wt%、赖氨酸0.5wt%、双乙酸钠0.003wt%，备用；
（2）向上述缓冲液中顺次加入所述糖类、非离子表面活性剂、金属离子螯合剂、醇类、蛋白质稳定剂、氨基酸和防腐剂，500rpm/ml混匀10min后，加入浓度为2mg/ml的猪圆环病毒2型Cap蛋白，控制所述保存液的使用量占所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的体积比例为10v/v%，1000rpm/ml混匀10min，并放入2-8℃或者-20℃保存。
实验例
1、猪圆环病毒2型Cap 蛋白的加保存液后的稳定性试验。
将猪圆环病毒2型Cap 蛋白病毒样粒子，按照浓度100ug/ml加入实施例1中制备的蛋白保存液中，于温度40℃±2℃、相对湿度75％±5％的条件下放置18个月。
所用设备应能控制温度±2℃，相对湿度±5％，并能对真实温度与湿度进行监测。在试验期间第1个月、6个月、12个月、18个月末取样一次，采用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白泳带浓度见附图1，采用Nanodrop核酸蛋白检测仪、BCA蛋白浓度定量试剂盒和特异性双抗夹心ELISA检测样品进行蛋白定量。测试结果如下表1。
表1 蛋白浓度和活性检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通过SDS-PAGE电泳结果图1可以看出泳道1、2、3为牛血清白蛋白，通过其对应的浓度，我们很直观判断出我们目的蛋白的浓度，通过蛋白Marker我们可以判断我们目的蛋白的大小，加入蛋白保存液的Cap蛋白，在40℃±2℃保存下12个月未见蛋白浓度发生变化，18个月后蛋白降解严重；而Nanodorp蛋白测定仪和BCA定量检测12个月蛋白浓度未见差异性变化，双抗体夹心ELISA检测结果显示，12个月的蛋白浓度未见减低，活性也未见降低。由于保存液里添加了蛋白质类稳定剂，故Nanodrop和BCA测定的结果值偏高一点。
应用例
1、保存液在猪圆环病毒2型亚单位疫苗中的应用
疫苗制备：在纯化猪圆环病毒2型Cap 蛋白（浓度100ug/ml），加入10%的实施例1中制备保存液，分两部分保存：一部分放入2-8℃，于保存后1个月和12个月取出按照同样配比配置亚单位疫苗；另一部分放入-20℃冰箱部分，于1个月、6个月、12个月、24个月、36个月取出按照同样的配比配置猪圆环病毒2型亚单位疫苗，蛋白与水佐剂比为4：1，3000rpm/ml搅拌10min，2-8℃保存，备用。
体外相对效力检测试验结果：采用相对效力检测ELISA方法，取出同一批参考疫苗对新配置的疫苗进行相对效力检测，测试结果见下表2，结果检测值均在误差允许的合格范围内。
表2相对效力检测结果
Figure 418148DEST_PATH_IMAGE002
猪免疫攻毒效力试验：选取3-4龄仔猪40头，取4℃和取-20℃保存样品制备的疫苗分别免疫动物，免疫量1ml/头，分别设立相应的空白对照组和攻毒对照组，每个时间的样品5头猪，免疫后28天，攻猪圆环病毒2型DBN-SX07株病毒毒价1×107 TCID50/ml 8ml，滴鼻4ml、肌肉注射4ml，攻毒前和攻毒后28天称量每头猪体重，计算平均相对日增重，采集攻毒侯28天的血，检测猪圆环病毒血症；攻毒后28天采集腹股沟淋巴结，检测免疫组化。免疫后结果分别如表3和表4所示。
表3 4℃蛋白保存1个月和12个月后的免疫原性检测
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4-20℃蛋白保存1个月和36个月后的免疫原性检测
Figure 397606DEST_PATH_IMAGE004
上述结果表明，采用本发明所述保存液，蛋白质4℃保存12个月蛋白质制备疫苗和-20℃保存后36个月制备疫苗，与保存后1一个月，免疫原性无影响。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，其特征在于，包括盐离子缓冲液，以及如下浓度的组分：
糖类1-5wt%；
非离子表面活性剂0.1-0.5wt%；
金属离子螯合剂1-5mM；
醇类1-10wt%；
蛋白质稳定剂0.1-1.5wt%；
氨基酸0.5-1.5wt%；
防腐剂0.001-0.05wt%。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，其特征在于，所述盐离子缓冲液的浓度为20-150mM。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，其特征在于，所述盐离子缓冲液包括磷酸盐缓冲液或Tris-HCI缓冲溶液中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，其特征在于：
所述糖类包括蔗糖或海藻糖中的至少一种；
所述非离子表面活性剂包括Tween-20或Tween-80中的至少一种；
所述金属离子螯合剂包括EDTA；
所述醇类包括甘油、甘露醇或山梨醇中的至少一种；
所述蛋白质稳定剂包括BSA、明胶或酪蛋白中的至少一种；
所述氨基酸包括赖氨酸或精氨酸中的至少一种；
所述防腐剂包括山梨酸及其盐类或双乙酸钠中的至少一种。
5.一种组合物用于制备猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液的用途，其特征在于，所述组合物包括盐离子缓冲液，以及如下浓度的组分：
糖类1-5wt%；
非离子表面活性剂0.1-0.5wt%；
金属离子螯合剂1-5mM；
醇类1-10wt%；
蛋白质稳定剂0.1-1.5wt%；
氨基酸0.5-1.5wt%；
防腐剂0.001-0.05wt%。
6.权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液的使用方法，其特征在于，包括将所述猪圆环病毒2型Cap蛋白置于所述保存液中进行保存的步骤。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的浓度为20ug/ml-3mg/ml，所述保存液的使用量占所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的体积含量为5-15v/v%。
8.一种标准物质，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，以及，分散在所述保存液中的猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原。
9.权利要求8所述的标准物质用于制备检测猪圆环病毒抗原的校准品和/或质控品的用途。
10.一种亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白病毒样粒子保存液，以及，分散在所述保存液中的Cap蛋白抗原以及其与佐剂乳化制备的亚单位疫苗。
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