KR20150116854A - 바이러스―유사 입자의 방출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비외피성 바이러스의 바큘로바이러스-발현된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 곤충 세포로부터 방출시키는 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스―유사 입자의 방출 방법 {METHODS FOR THE RELEASE OF VIRUS-LIKE PARTICLES}
본 발명은 비외피성 바이러스의 바큘로바이러스-발현된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 곤충 세포로부터 방출시키는 방법에 관한 것이다.
오늘날 의학은 감염성 질환을 퇴치하는 것에 관해서라면 백신에 크게 의존한다. 상기 백신은 약독화된 생백신 또는 불활성화된 백신일 수 있으며, 이 둘은 모두 그들 자신의 장점 및 단점을 가지고 있다. 약독화된 생백신은 천연 감염에 가깝게 그를 모방하여, 결과적으로 병독성 형태의 바이러스 또는 미생물에 의해 유발되는 면역 반응과 유사한 면역 반응을 일으킨다. 그러나, 일부 원치않는 부작용을 유발할 수 있으며, 약독화 수준이 매우 중요하다. 한편, 불활성화된 백신이 안전하지만, 여러 경우에서 그의 생 대응물만큼 효능이 있지는 않다.
바이러스성 백신의 경우에, 소위 바이러스-유사 입자 (VLP) 기반 백신이라 하는 제3 유형의 백신이 더욱더 많은 관심을 받고 있다. 바이러스-유사 입자는 야생형 바이러스와 형태가 매우 유사한 입자이다. 이는 야생형 바이러스 상에서 발견되는 모든 면역원성 성분들을 포함하고, 그의 천연 조직 및 입체구조에 이들 성분들을 포함한다. 그러나, 이는 바이러스성 게놈이 없기 때문에 감염성 자손 바이러스를 생산할 수 없다는 점에서 야생형 바이러스와 다르다.
그 결과, 상기 백신은 약독화된 생백신 및 불활성화된 바이러스 백신 둘 모두에 대한 매력적인 대안이다.
VLP는 주로 시험관내 세포 시스템에서 생산된다. 또한, 많은 경우에서, 이는 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에서 생산된다. 이들 시스템은 상대적으로 다량의 VLP를 생산할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
바큘로바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)에서 발현된 단백질은 분비형 또는 비분비형 단백질일 수 있다. 이는 비분비형 VLP가 추가로 정제될 수 있기 전에 우선 곤충 세포로부터 방출되어야 한다는 점을 암시한다. 표준 VLP 방출 방법은 냉동-해동, 초음파처리, 고전단 기계식 방법, 비드 방법, "세포 폭탄(cell bomb)", 저장성 배지를 사용한 삼투압 쇼크, 계면활성제의 사용 및 효소적 방법을 포함한다.
그러나, 이들 모든 방법에 의해서는 또한 불가피하게 세포가 파괴되거나 용해되고, 세포의 전체 성분인 RNA, DNA, 단백질, 세포 소기관, 세포 파편, 및 바큘로바이러스-기반 시스템의 경우에는 또한 생 바큘로바이러스가 주변 배지로 방출된다. 그렇지 않다면, 이들 성분들은 모두 VLP가 백신으로 사용될 준비가 되기 이전에 제거되어야 한다는 것은 명백하다. 요구되는 정제 수준은 다수의 품질 검사를 포함하는 고된 다단계 공정을 암시한다.
그러므로, 세포의 전체 핵산 및 단백질 내용물이 동시에 방출되지 못하게 방지하면서, 비분비형 VLP를 세포 배양 유체 내로 방출시키는 방법이 명백하게 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 상기 언급한 문제점들을 감소시키거나 심지어는 방지하면서, VLP를 방출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 방법은 특히 곤충 세포를 사용하여 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에서 발현되는 비외피성 바이러스의 비분비형 VLP 방출에 적합하다.
본 발명에 이르러 놀랍게도, 비외피성 VLP를 포함하는 곤충 세포가 일단 염과 혼합되고 나면, 이로써 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염은, 양이온이 알칼리 금속 및 알칼리 토금속으로 이루어진 군으로부터 선택되고 음이온이 Cl-, Br- 또는 I-로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 300 mOsmol/L의 염을 포함하고, 세포는 그의 전체 세포 내용물을 방출하지 않으면서 VLP를 방출한다는 것을 발견하게 되었다. 본 방법은 현탁액 중에서 담체 없이 성장시키는 경우의 곤충 세포에 특히 적합하다.
이는 실제로 매우 놀라운 현상이다: 본 발명에 따른 방법은, 예컨대 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 명백하게 세포 대부분을 무손상인 상태 그대로 남겨둔다. 이러한 VLP 방출 배후의 기전은 명확하지 않다.
따라서, 본 발명의 제1 실시양태는, 용해 또는 세포 파괴 단계가 없고, 곤충 세포를 염과 혼합하는 단계를 포함하며, 여기서 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염은, 양이온이 알칼리 금속 및 알칼리 토금속으로 이루어진 군으로부터 선택되고 음이온이 Cl-, Br- 및 I-로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 300 mOsmol/L의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비외피성 바이러스의 바큘로바이러스-발현된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 곤충 세포로부터 방출시키는 방법에 관한 것이다.
본 방법의 목적을 위해, 곤충 세포를 염과 혼합하고, 이로써 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염은, 양이온이 알칼리 금속 및 알칼리 토금속으로 이루어진 군으로부터 선택되고 음이온이 Cl-, Br- 및 I-로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 300 mOsmol/l의 염을 포함한다는 것은, 혼합 후 생성된 염 용액이 적어도 300 mOsmol/l의 염을 포함하는 정도로, 세포 배양 유체 (주위 유체 중의 곤충 세포)를, 양이온이 알칼리 금속 및 알칼리 토금속으로 이루어진 군으로부터 선택되고 음이온이 Cl-, Br- 및 I-로 이루어진 군으로부터 선택되는 염과 혼합하는 단계를 포함하는 것으로 이해된다.
혼합이 다양한 방식으로, 예컨대 고체 형태의 염을 세포 배양 유체에 첨가함으로써 또는 수용액 중 염을 세포 배양 유체와 혼합함으로써 수행될 수 있다는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명에 기재된 바와 같이, 혼합의 결과물인 수용액 중 염은, 예컨대 적어도 150 mM NaCl/L를 포함할 수 있다 (이는 수용액 중 염에 적어도 300 mOsmol의 NaCl/L의 오스몰농도를 제공한다). 본 발명에 기재된 바와 같은 염 용액이 MgCl2에 기초하여 제조된 것이라면, 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염은 적어도 100 mM MgCl2/L를 포함할 것이다 (이는 수용액 중 염에 적어도 300 mOsmol의 MgCl2/L의 오스몰농도를 제공한다).
하기 예는 단순히 일례로서의 역할만을 한다; 곤충 세포 및 배양 배지를 포함하는 100 ml의 곤충 세포 배양물을 100 ml의 300 mM NaCl/L 용액과 혼합할 경우, 상기 조치로부터 생성된 최종 200 ml의 유체는 150 mM NaCl/L를 포함한다. 물론 상기 염 용액의 최종 부피는 본 발명에 따른 방법의 유익한 효과와는 관련이 없다. 곤충 세포 및 배양 배지를 포함하는 75 ml의 곤충 세포 배양물을 25 ml의 1,200 mM NaCl/L 용액과 혼합할 경우, 상기 조치로부터 생성된 최종 100 ml의 유체는 300 mM NaCl/L를 포함한다.
본 발명의 예상 밖의 현상에 대해 겔 상에 시각화한 것이 도 1에 제시되어 있다. 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 방출된 VLP를 포함하는, 본 발명에 따른 방법으로 처리된 이후의 세포의 상청액을 보여주는 레인은 현저하게 투명하다 (상세한 설명을 위해 실시예 섹션 참조).
비록 상기에서와 같이, 염 용액의 최종 부피가 본 방법과는 관련이 없기는 하지만, 실제로는 본 발명에 따라 세포 배양 유체에 대해 혼합 단계를 수행하기 이전에 농축 단계를 도입하는 것이 유용하다. 농축 단계에 대한 주된 이유는 상업적 목적으로 VLP를 생산하는 데에는 상대적으로 대량의 세포 배양 부피가 요구되기 때문이다. 이러한 대량의 부피로부터 직접 VLP를 수거하는 것은 효율적이지 않으며; 소량의 부피로부터 VLP를 수거하는 데에 훨씬 더 적은 처리가 요구된다.
상기 단계에서 농축 수준은 중요하지 않다. 세포 배양 유체를 원래 세포 배양 유체 부피의 절반량으로 (즉, 원래 부피의 50%로) 농축시키는 것은 이미 수거의 용이성에 있어 상당한 이점을 제공할 것이다. 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%로 또는 심지어는 5%까지로 추가로 농축시키는 것이 상기 선호 순서대로 바람직하다.
농축은 모두가 관련 기술분야에 공지되어 있는 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 빈번하게 사용되는 한 방법은, 예컨대 접선 유동 투석 형태의 한외여과이다.
흔히 사용되는 또 다른 방법은 저속 원심분리이다. 저속 원심분리 후에 세포 배양 유체의 일부 또는 모두를 제거하게 되면, 세포는 농축되고, 최종적으로는 펠릿화되지만, 세포는 여전히 무손상인 상태 그대로 유지될 것이며, 여전히 주위에 소량의 배양 유체가 존재할 것이다. 이어서, 상기 세포 펠릿은 수용액 중 염과 쉽게 혼합될 수 있고, 이로써 본 발명에 기재된 바와 같은 수용액 중 염을 수득할 수 있다.
실제 이유로, 매우 적합한 방법은 간단하게, 세포를 포함하는 세포 배양 유체를 저장하고, 세포가 중력에 의해 용기 바닥으로 침강하도록 하는 것이다. 약 1-18시간 경과 후, 수거 부피와 용기 크기에 따라, 단연코 대부분의 세포는 세포 배양 유체의 바닥 10%에 존재하게 될 것이며, 이로써 세포 배양 유체 중 세포를 함유하지 않는 상위 90%를 폐기할 수 있다. 본 방법을 통해 대량의 세포 배양 유체를 원심분리 및/또는 한외여과해야 하는 작업을 피할 수 있다. 이어서, 상기와 같이 수득된 세포 배양 유체의 바닥 10%에 존재하는 VLP 함유 세포를 본 발명에 기재된 바와 같은 곤충 세포를 염과 혼합하는 단계에서 바로 사용할 수 있다.
따라서, 본 실시양태의 바람직한 형태는 곤충 세포를 염과 혼합하는 단계 이전에 곤충 세포를 농축시키는 농축 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
원칙적으로, 알칼리 금속 및 알칼리 토금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온은 본 발명에 따른 방법을 위해 사용될 수 있다. 그러나, Na+, Mg2 +, Ca2 + 및 K+로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온이 바람직한데, 그 이유는 상기의 것이 저렴할 뿐만 아니라, 의료 용도로 허용되기 때문이다.
그러므로, 본 발명의 상기 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는 양이온이 Na+, Mg2+, Ca2 + 및 K+로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
바람직한 음이온은 Cl-인데, 그 이유는 Cl- 음이온을 가지는 염이 저렴하고, 의료 용도로 고도로 허용되기 때문이다.
따라서, 본 실시양태의 더욱 바람직한 형태는 염이 NaCl, KCl, CaCl2 및 MgCl2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
VLP를 보유하는 곤충 세포를 포함하는 세포 배양 유체는 세포를 배양하는 데 필요한 다수의 성분들을 추가로 포함한다. 이는 또한 세포의 폐기물도 포함한다. 이들 폐기물은 VLP를 포함하는 최종 백신에 유해할 수 있는 원치않는 부산물이다.
따라서, 상기 성분은 본 발명에 따른 방법을 VLP를 포함하는 곤충 세포에 적용하기 이전에 상기 세포로부터 분리시키는 것이 바람직하다. 이는 세포를 펠릿화하고, 상청액을 폐기하고, 본 발명에 기재된 바와 같은 염 용액 중에 세포를 재현탁시킴으로써 쉽게 수행될 수 있다. 이것이 주의깊게 수행된다면, 단연코 대부분의 상청액은 제거될 수 있다. 상기 경우에, 세포 및 염의 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염은 본질적으로 본 발명에 기재된 바와 같은 염 및 물로 이루어진다. 본원에서 본질적으로라는 것은 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염이 10% 미만의 세포 배양 유체를 포함한다는 것을 의미한다. 바람직하게, 혼합으로부터 생성된 수용액은 8% 미만, 6% 미만, 4% 미만, 또는 심지어 2% 미만의 세포 배양 유체를 포함한다.
따라서, 본 실시양태의 바람직한 형태는 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염이 본질적으로 본 발명에 기재된 바와 같은 염 및 물로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 일반적으로 BEVS에서 발현되는 비분비형 비외피성 VLP에 적합하다.
따라서, 본 방법은 파르보비리다에(Parvoviridae) 과 및 시르코비리다에(Circoviridae) 과; 현 VLP가 상업적 기반으로 제조되는 수개의 구성원을 가지고 있는 바이러스 과의 구성원의 BEVS 유래 VLP에 적합하다.
그러므로, 본 발명의 상기 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는 비외피성 바이러스가 파르보비리다에 과 또는 시르코비리다에 과의 구성원인 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
바큘로바이러스-기반 곤충 세포 세스템에서 제조된 VPL 형태로 성공적으로 투여될 수 있는, 비외피성 바이러스에 기초하여 수의학에서 사용하기 위한 중요한 파르보비리다에 및 시르코비리다에 백신의 예로는, 돼지 파르보바이러스 (PPV) 및 돼지 시르코바이러스 2형 (PCV2)이 있다.
그러므로, 본 발명의 상기 실시양태의 더욱 바람직한 형태는 비외피성 바이러스가 돼지 파르보바이러스 (PPV) 또는 돼지 시르코바이러스 2형 (PCV2)인 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
원칙적으로 BEVS에서 VLP를 생산하게 되면, 바큘로바이러스 또한 생산된다. 상기 바큘로바이러스는 VLP의 원치않는 부산물이므로, 제거되거나 또는 적어도 불활성화되어야 한다.
본 발명에 이르러 더욱더 놀랍게도, 수용액 중 염이 30-55℃, 바람직하게는 35-50℃, 더욱 바람직하게는 40-45℃의 온도에서 보관될 경우, 생 바큘로바이러스의 양은 현저하게 감소된다는 것을 발견하게 되었다. 그뿐만 아니라, 온도가 증가될 때, 방출되는 항원의 양 또한 현저하게 증가된다.
상기와 같은 감소는 매우 이로운데, 그 이유는 본 발명에 따른 방법을 적용한 후, 불활성화시키고자 하는 바이러스의 양이 상대적으로 적으므로, 더 적은 양의 불활성화 화학물질이 사용되어야 하기 때문이다.
단지 일례로서; 수용액 중 염이 30-40℃의 온도에서 보관되었을 때, 바이러스 역가는 1,000 내지 10,000배로 쉽게 감소될 수 있다.
특정 온도가 적용되어야 하는 시간은 선택되는 온도에 의존한다: 온도가 약 40℃일 때, 바이러스 역가가 10배 감소되는 데에는 1시간 소요되는 반면, 온도가 약 35℃일 때에는, 5-6시간이 경과한 후에 상기와 같이 감소된다. 일반적으로는 그래도 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염을 특정 온도에서 18-24시간 동안 보관하는 것이 적합하다.
VLP-발현에 매우 일반적으로 사용되는 2개의 곤충 세포 시편은 SF9 또는 SF21 세포이다. 본 발명에 기재된 방법은 상기 세포 둘 모두에 매우 성공적으로 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는 곤충 세포가 SF9 또는 SF21 세포인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
기재된 본 방법은 통상적으로 a) VLP-단백질을 코딩하는 재조합 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계, b) 곤충 세포를 배양하는 단계, c) 곤충 세포로부터 VLP를 방출시키는 단계; 및 d) VLP를 단리하는 단계인 다수의 단계를 포함하는, 비외피성 바이러스의 바큘로바이러스-발현된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 정제하는 데 일반적으로 적용되는 방법의 일부이다.
단계 c)에서, VLP를 방출시키는 단계는 본 발명에 따른 방법으로부터 크게 이익을 얻게 될 것이다.
따라서, 또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 비외피성 바이러스의 바큘로바이러스-발현된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 정제하는 방법으로서,
a) VLP-단백질을 코딩하는 재조합 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계
b) 곤충 세포를 배양하는 단계
c) 곤충 세포로부터 VLP를 방출시키는 단계
d) VLP를 단리하는 단계를 포함하며,
용해 또는 세포 파괴 단계가 없고, 단계 c는 VLP의 방출을 위해 본 발명에 따른 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 방법에 관한 것이다.
실시예 .
실시예 1: PCV2 VLP 생산
본 실시예에서는 BEVS-유래된 PCV2 VLP를 사용하였다. 상기 재조합 바큘로바이러스의 구축에 관해서는 이전에 미국 특허 US 2001/0064765에서 상세하게 기재되었다. 바이러스는 추가로 BacPCV-2-ORF-2 바이러스로 지칭한다.
발현 생성물을 최대량으로 수득하기 위해, 예비 실험을 수행하여 재조합 PCV-2 ORF-2 VLP를 수득하기 위한 조건을 최적화시켰다. 모든 실험은 28℃에서 현탁 배양물 중 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 21 (Sf21) 세포를 사용하여 수행하였다. 감염을 위해 마스터 시드(Master seed)로부터의 4 계대 수준의 BacPCV-2-ORF-2 바이러스를 사용하였다. 최적화된 생산을 위해, 감염시 세포 밀도는 1.4 x 106개의 세포/ml였고, 감염 다중도 (MOI)는 0.01이었고, 감염 후에도 6일 동안 계속 배양하였다. 생성된 혼합물을 발현 생성물 수거물로 명명하였다.
저속 원심분리를 수행하기 이전 및 이후에 세포 배양 유체의 샘플에 대해 램리(Laemmli) (Laemmli, U. K. (1970). Nature 227, 680-685)의 방법에 따라 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔-전기영동을 수행하였다. 사용된 4-12% 구배 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다. 본 실시예에서의 모든 겔 또한 램리에 따른 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔이다.
실시예 2: 곤충 세포로부터 VLP의 방출
실시예 1에 따라 세포를 수거하였다. 도 1에서, 표제에 "수거물"이라고 기재된 레인은 세포 배양 수거물의 단백질 내용물을 보여주는 것이다. 상기 레인은 세포 단백질, 바큘로바이러스 단백질 및 VLP-관련 단백질을 비롯한, 배양 유체 및 세포에 존재하는 모든 단백질을 나타낸다.
200 g에서 수거물을 원심분리한 후, 90%의 세포-무함유 상청액을 동량의 수용액 중 염으로 교체하여 혼합 후의 최종 농도가 0.15, 0.20, 0.25 및 0.30 mM NaCl이 되도록 하였다. 상기 혼합물을 40℃에서 18시간 동안 보관하고, 이어서 남은 세포는 3,000 g에서 원심분리를 통해 스핀 다운시켰다. 상청액에 대해 겔 전기영동을 수행하였다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 표제에 "상청액"이라고 기재된 레인에서 상청액은 사실상 순수한 PCV2 VLP 단백질 (및 미량의 비-VLP 단백질)을 포함한다.
실시예 3: 알칼리 염 및 포스페이트 완충제 비교
본 실험에서, 세포 배양 유체를 수거하고, 세포를 200 g에서 펠릿화하고, 90%의 상청액을 제거하고, 세포를 동량의 PB (250 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4), PB + 0.5 M NaCl, H2O (= WFI = 주사용수) 및 본 발명에 기재된 바와 같은 수용액 중 0.5 M NaCl에 재현탁시켰다.
40℃에서 밤새 인큐베이션을 수행하였다. 이어서, 3,000 g에서 원심분리하여 세포를 제거하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, WFI를 단독으로 사용한 경우에는 VLP가 방출되지 않은 반면, PB + NaCl, 수용액 및 PB 중 NaCl의 경우에는 VLP가 방출되었다. 하기와 같이, 레인 WFI + NaCl (= 주사용수 + NaCl, = 수용액 중 NaCl)로부터 가장 많은 양의 순수한 VLP 및 가장 적은 배경의 비-VLP-관련된 단백질을 수득하였다.
모든 샘플의 항원 매스 (1 ml당 항원 단위(Antigenic Unit)로 표시 - AU/ml)는 공지된 항원 매스의 참조 표준과의 비교로 ELISA에 의해 측정하였다. 이어서, 모든 시험 샘플의 회수율(%)을 수거물 샘플의 것과 비교하여 계산하였다. 대안적 방법으로서, 겔 상에서의 PCV2 특이 단백질 밴드의 강도를 수거물 샘플의 PCV2 특이 단백질 밴드의 강도와 비교하여 계산하였다.
실시예 4: 승온에서의 알칼리 염 및 포스페이트 완충제 비교
본 실시예에서, 세포 배양 유체를 수거하고, 세포를 200 g에서 펠릿화하고, 90%의 상청액을 제거하고, 세포를 동량의 PB (250 mM 포스페이트, pH 7.4), PB + 0.5 M NaCl, 0.01 M PBS (8 g NaCl/L, 0.2 g KCl/L, 1.44 g Na2HPO4/L, 0.2 g KH2PO4/L, pH 7.1) 및 본 발명에 기재된 바와 같은 수용액 중 0.5 M NaCl에 재현탁시켰다.
세포 배양 유체의 희석 수준의 효과를 비교하기 위해 수회에 걸쳐 희석시켰다. 한 실험에서, 30 ml의 수거된 세포 배양 유체 중 세포를 10배로 농축시킨 후, 수용액 중 염과 혼합하여 최종 부피가 50 ml가 되도록 만들었다. 제2 실험에서는 30 ml의 수거된 세포 배양 유체 중 세포를 10배로 농축시킨 후, 수용액 중 염과 혼합하여 최종 부피가 25 ml가 되도록 만들었다. 제3 실험에서는 30 ml의 수거된 세포 배양 유체 중 세포를 10배로 농축시킨 후, 수용액 중 염과 혼합하여 최종 부피가 10 ml가 되도록 만들었다.
40℃에서 밤새 인큐베이션을 수행하였다. 이어서, 3,000 g에서 원심분리하여 세포를 제거하였다. 도 3의 겔로부터 알 수 있는 바와 같이, PB, PB + NaCl, PBS 및 수용액 중 NaCl (WFI + NaCl) 모두 VLP를 방출하였다. 하기와 같이, 레인 WFI + NaCl (= 주사용수 + NaCl, = 수용액 중 NaCl)로부터 가장 많은 양의 순수한 VLP 및 가장 적은 배경의 비-VLP-관련된 단백질을 수득하였다. 3개의 농도 모두에 대해서도 같은 효과가 관찰되었다.
추가로, 45℃에서 WFI + NaCl을 이용하는 실험을 또한 수행하였다. 레인 "WFI + NaCl, 45℃"에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 온도에서 인큐베이션시켰을 때, 40℃에서 WFI + NaCl로 처리한 것과 유사한 영상: 유사한 소량의 단백질 불순물을 포함하는 VLP-단백질을 얻었다.
실시예 5: 수 환경 중 염에서의 세포의 거동
본 실험에서, 세포 배양 유체 중 곤충 세포 및 본 발명에 따른 방법으로 처리된 세포에 대한 현미경 영상을 제작하였다. 세포를 비처리된 세포 배양 유체로서 보관하거나, 또는 본 발명에 따른 방법으로 처리하였고, 이 경우 수용액 중 염과 혼합하여 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염은 0.3 M NaCl/L를 포함하였다.
도 4는 결과를 보여주는 것이다: 좌측 영상은 비처리된 곤충 세포를 보여주는 것인 반면, 우측 영상은 혼합 후 0.3 M NaCl/L를 포함하는 수용액 중 염 중 곤충 세포를 보여주는 것이다. 바로 알 수 있는 바와 같이, 우측 영상의 세포는 실제로 여전히 무손상이었고, 0.3 mM NaCl/L를 포함하는 수용액 중 염의 고 삼투압성 환경에 그가 존재하는 것에 기인하여, 좌측 영상의 세포와 비교하였을 때 그 크기는 약간 더 작았다.
실시예 6: 인큐베이션 온도가 바큘로바이러스 역가에 미치는 영향
본 실시예에서, 30 ml의 세포를 저속 원심분리에 의해 수거하고, 90%의 세포-무함유 배양 유체를 제거한 후, 이어서 남은 세포 펠릿을 25 ml의 수용액 중 염에 재현탁시켜 최종 농도가 0.5 M NaCl/L가 되도록 만들었다.
상기와 같이 수득된 현탁액을 1, 2, 4, 6 또는 18시간 (밤새) 동안 35℃, 37℃ 및 40℃의 온도에 적용하였다. 이어서, 3,000 g에서 원심분리하여 세포를 제거하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 35℃에서 밤새인 경우에는 바큘로바이러스 역가가 약 100배 감소할 수 있었다. 40℃에서는 1-2시간 경과한 후에도 이미 100배 감소한 반면, 6-18시간 경과한 후에는 1,000배 감소하였다.
실시예 7: 다양한 농도의 수개의 알칼리 금속 비교
본 실험에서는 상이한 염에 의한 VLP-방출을 비교하였다. 상기 기재된 바와 같이 세포를 수거하고, 세포-무함유 세포 배양 유체 부피의 90%를 제거하였다. 이후, 세포의 최종 농도가 5배가 되도록 하기 위해 수용액 중 다양한 염을 첨가하여 수용액 중 염의 부피가 항상 농축된 수거물 부피의 것과 동일하도록 하였다. 다양한 농도의 NaCl, KCl, CaCl2 및 MgCl2를 사용하여 시험을 수행하였다. 이어서, 3,000 g에서 원심분리하여 세포를 제거하였다. 혼합 이후의 농도는 하기 표 1에 제시되어 있다.
<표 1>
Figure pct00001
* 이 샘플은 같은 수거물로부터 유래된 것이지만, 이는 나머지 샘플과는 다른 날에 0.3 M NaCl로 처리되었다.
본 결과는 도 6에 제시되어 있다. 레인 2는 수거물에 존재하는 것과 같은 단백질을 나타낸다 (이후 샘플을 5배 희석, 예외: 레인 12: 비희석된 수거물 샘플). 겔 상에서의 수거물 샘플의 회수율 (표 1)은 표에 100으로 명시되어 있으며, 겔 상에서 측정된 상대적인 회수율은 표 1 우측에서 두번째 칸에 제시되어 있다. 항원 매스 회수율은 표 1의 우측 칸에 제시되어 있다. 모든 처리가 레인 2의 제제 (수거물)보다 더 높은 회수율을 가졌고, 모든 처리가 깨끗한 VLP 제제를 제공한다는 것을 도 6의 겔 및 표 둘 모두로부터 알 수 있었다. (레인 9에서 시험된 것과 같은 제제의 항원 매스 측정은 예상과 같이 높은 회수율을 보였는 바, 레인 9의 상대적으로 낮은 회수율 값은 아티팩트인 것으로 간주되었다). 도 7은 겔 상에서 측정된 VLP의 회수율과, 표준 ELISA 시험에 기초하여 항원 매스 측정에 의해 측정된 VLP의 회수율 사이에는 우수한 상관 관계가 존재한다는 것을 보여준다.
실시예 8: 돼지 파르보바이러스를 생산하는 SF9 및 SF21 세포에의 본 방법 적용
본 실험은 본 방법이 다른 비외피성 비분비형 VLP에도 동등하게 적합하다는 것을 보여주는 것을 목표로 하였다. 본 실험에서, 파르보비리다에의 BEVS-유래된 VLP를 선택하였다: (돼지 파르보바이러스 PPV). 또한, 본 실험에서는 일반적으로 사용되는 2개의 다른 곤충 세포 종을 사용하였다: SF9 세포 및 SF21 세포.
돼지 파르보바이러스 VLP를 발현하는 재조합 바큘로바이러스로 SF9 및 SF21 세포를 감염시켰다 ("수거물", 도 8, 레인 2 및 7). 이후, 세포를 200 g에서 펠릿화하고, 90%의 상청액을 제거하고 (도 8, 레인 4 및 9), 세포를 동량의 PBS (도 8, 레인 3 및 8) 또는 수용액 중 0.3 M NaCl 중에 재현탁시켰다. NaCl 처리된 샘플을 40℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 샘플을 3,000 g에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고 (도 8, 레인 6 및 11), 펠릿을 동량의 PBS (도 8, 레인 5 및 10)에 재현탁시켰다.
도 8은 본 방법을 SF9 및 SF21 세포에서 제조된 PPV-VLP에 적용시켰을 때의 본 방법의 결과를 보여주는 것이다. 레인 2: 수거물; 레인 3: 수거물, PBS에 재현탁된 펠릿, 레인 4: 수거물 상청액; 레인 5: 수거물, 0.3 M NaCl, 40℃에서 밤새, 펠릿; 레인 6: 수거물, 0.3 M NaCl, 40℃에서 밤새, 상청액; 레인 7: 수거물; 레인 8: 수거물, PBS에 재현탁된 펠릿; 레인 9: 수거물 상청액; 레인 10: 수거물, 0.3 M NaCl, 40℃에서 밤새, 펠릿; 레인 11: 수거물, 0.3 M NaCl, 40℃에서 밤새, 상청액.
하기와 같이, 레인 3과 비교하여 레인 5로부터 알 수 있는 바, 본 발명의 방법에 따라 처리하였을 때, 실제로 곤충 세포로부터 모든 VLP가 방출되었고; 레인 5에 제시되어 있는 바와 같이, 처리 후 펠릿화된 세포는 VLP를 거의 포함하지 않거나 또는 전혀 포함하지 않았다. 레인 3과 비교하여 레인 4로부터 알 수 있는 바, PCV2 VLP의 경우에 관찰된 것과 달리, CPV VLP를 생산하는 곤충 세포는 이미 상청액 중에 VLP의 일부를 방출하였다. 이 이유는 알려져 있지 않다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 방법은 상기 CPV VLP에도 역시 매우 적합하게 적용될 수 있는데, 그 이유는 본 발명의 방법을 적용하지 않았을 때에는 매우 상당한 양의 CPV VLP가 수거 이후에도 여전히 세포 중에서 포획되었기 때문이다.
도면 설명
도 1: 본 도면은 VLP를 포함하는 곤충 세포에, 40℃에서 수용액 중 다양한 농도의 NaCl를 사용한 본 발명에 따른 방법을 적용시켰을 때의 효과를 보여주는 것이다.
도 2: 본 도면은 VLP를 포함하는 곤충 세포에, 수용액 중 염으로 각종 염을 사용한 본 발명에 따른 방법을 적용시켰을 때의 효과를 보여주는 것이다.
도 3: 본 도면은 VLP를 포함하는 곤충 세포에, 승온에서의 수용액 중 염으로 각종 염을 사용한 본 발명에 따른 방법을 적용시켰을 때의 효과를 보여주는 것이다.
도 4: 본 영상은 곤충 세포의 배양 배지 중 곤충 세포 (좌측 영상) 및 본 발명에 따른 방법으로 처리된 이후의 곤충 세포 (우측 영상) 사이의 비교를 보여주는 것이다.
도 5: 본 영상은 승온에서의 장기간의 인큐베이션이 바큘로바이러스 역가에 미치는 영향을 보여주는 것이다.
도 6: 본 도면은 VLP를 포함하는 곤충 세포에 수용액 중 염으로 알칼리 염으로서 NaCl, MgCl2, CaCl2 및 KCl을 사용한 본 발명에 따른 방법을 적용시켰을 때의 효과를 보여주는 것이다.
도 7: 본 도면은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수득된 VLP의 양에 있어서 겔 상에서 측정된 것과 항원 매스 ELISA에 의해 측정된 것 사이의 관계를 보여주는 것이다.
도 8: 본 도면은 바큘로바이러스-유래된 돼지 파르보바이러스 VLP를 발현하는 2개의 상이한 곤충 세포주에 본 발명에 따른 방법을 적용시켰을 때의 효과를 보여주는 것이다.
레인 2, 7: 수거물. 레인 3, 8: 수거물, PBS에 재현탁된 펠릿. 레인 4, 9: 수거물 상청액. 레인 5, 10: 수거물, 0.3 M NaCl O/N 40℃, 펠릿. 레인 6, 11: 수거물, 0.3 M NaCl O/N 40℃, 상청액.

Claims (10)

  1. 용해 또는 세포 파괴 단계가 없고, 곤충 세포를 염과 혼합하는 단계를 포함하며, 여기서 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염은, 양이온이 알칼리 금속 및 알칼리 토금속으로 이루어진 군으로부터 선택되고 음이온이 Cl-, Br- 및 I-로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 300 mOsmol/l의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비외피성 바이러스의 바큘로바이러스-발현된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 곤충 세포로부터 방출시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 곤충 세포를 염과 혼합하는 단계 이전에 곤충 세포를 농축시키는 농축 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 양이온이 Na+, Mg2 +, Ca2 + 및 K+로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 염이 NaCl, KCl, CaCl2 및 MgCl2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 혼합으로부터 생성된 수용액 중 염이 본질적으로 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 염 및 물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비외피성 바이러스가 파르보비리다에(Parvoviridae) 과 또는 시르코비리다에(Circoviridae) 과의 구성원인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액 중 염이 35-50℃의 온도에서 보관되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 수용액 중 염이 40-45℃의 온도에서 보관되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 SF9 또는 SF21 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 비외피성 바이러스의 바큘로바이러스-발현된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 정제하는 방법으로서,
    a) VLP-단백질을 코딩하는 재조합 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계
    b) 곤충 세포를 배양하는 단계
    c) 곤충 세포로부터 VLP를 방출시키는 단계
    d) VLP를 단리하는 단계를 포함하며,
    용해 또는 세포 파괴 단계가 없고, 단계 c는 VLP의 방출을 위해 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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