CN108912205A - 蛋白保存液及其制备方法、采用该保存液保存蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白保存液及其制备方法、采用该保存液保存蛋白的方法，属于蛋白保存技术领域，以100mL保存液计，该蛋白保存液包括如下组分：氯化钠2.535‑3.501g；Tris‑HCl缓冲液6‑7mL；酪蛋白溶液20‑28mL；防腐剂28‑31μL；余量为纯水；所述Tris‑HCl的pH值为7.4‑7.5。本发明中的保存液解决了传统保存液需要配合极低的温度进行保存的缺点，具有稳定保存蛋白并使蛋白的检测结果较为准确的效果。

Description

蛋白保存液及其制备方法、采用该保存液保存蛋白的方法

技术领域

本发明涉及蛋白保存技术领域，更具体地说，它涉及一种蛋白保存液及其制备方法、采用该保存液保存蛋白的方法。

背景技术

蛋白的种类繁多，且容易变性或被降解，因此，蛋白较难保存。

考虑到蛋白在保存液中容易变性或者降解而导致蛋白的立体结构遭到破坏，传统的蛋白保存方法通常是将蛋白保存在保存液中，且将放置有蛋白的保存液置于超低温度下进行冷冻保存。

然而，在检测被保存后的蛋白时，需要对现有的保存液进行融化，再取出部分被保存的蛋白进行检测。在该过程中，易造成被保存的蛋白的活性受到影响，导致检测结果不准确。而被融化后的带有被保存的蛋白的保存液需要重新置于超低温度中进行再次冷冻保存，而在该过程中，易使被保护的蛋白在活性上受到进一步的影响。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的一在于提供一种蛋白保存液，解决了传统保存液需要配合极低的温度进行保存的缺点，具有稳定保存蛋白并使蛋白的检测结果较为准确的效果。

为实现上述目的一，本发明提供了如下技术方案：

一种蛋白保存液，以100mL保存液计，包括如下组分：

氯化钠2.535-3.501g；

Tris-HCl缓冲液6-7mL；

酪蛋白溶液20-28mL；

防腐剂28-31μL；

余量为纯水；

所述Tris-HCl的pH值为7.4-7.5。

通过上述技术方案，采用氯化钠，一方面，有助于增加蛋白质分子表面的电荷，增加蛋白质分子与水分子之间的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。另一方面，氯化钠中的盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，有助于使蛋白保持原始的状态。

Tris-HCl缓冲液的pH值较为稳定，保持在7.4-7.5的范围内，有助于保持本申请中的保存液的整个体系的稳定性，从而在最大程度上保持酪蛋白溶液中所含有的酪蛋白的稳定性。而酪蛋白溶液中所含有的酪蛋白具有一定的粘稠性质，被保存的蛋白在置入本申请中的保存液中后，酪蛋白可在被保存的蛋白的周边起到保护作用，进一步保护被保存的蛋白的稳定性，不仅减少被保存的蛋白降解的可能性，还减少蛋白与存储器具的结合。

因此，Tris-HCl缓冲液、酪蛋白溶液的相互配合，有助于使被保存的蛋白保持原有的结构以及活性，降低被保存的蛋白的降解概率，即使在非冷冻状态下，依然可长时间使被保存的蛋白保持原始的组织结构。

与传统的冷冻保存蛋白的方法相比，首先，本申请中的保存液无需置于超低温度下进行冷冻，降低了保存的成本，保存液对酪蛋白而言具有较好的稳定性，且酪蛋白易对被保存的蛋白起到较好的保护和稳定的作用；其次，蛋白保存于本申请中的保存液中，当需要进行试验操作时，无需对保存液进行解冻处理，因此，一方面，不易由于解冻而造成蛋白被破坏，另一方面，也节省了解冻所需要的时间，使试验操作更加方便快捷。

此外，在本申请中，防腐剂可进一步降低微生物滋生的概率，当蛋白保存在本申请中的保存液中时，可有效减少微生物对蛋白的降解，进而有助于提高对蛋白的保存效果。

进一步优选为：以100mL保存液计，所述保存液包括如下组分：

氯化钠2.535-3.112g；

Tris-HCl缓冲液6.58-7mL；

酪蛋白溶液24-28mL；

防腐剂29-31μL；

余量为纯水。

通过上述技术方案，经试验发现，采用上述用量的组分形成的保存液，对蛋白具有更好的保存效果。

进一步优选为：所述酪蛋白溶液的制备方法包括如下步骤：

步骤A，在18-28℃，根据重量份数，称取6份酪蛋白，加入45份纯水，充分混合，形成第一混合物；

步骤B，向步骤A中获得的第一混合物中加入20份浓度为2mol/L的NaOH，充分混合，形成第二混合物；

步骤C，向步骤B中获得的第二混合物中加入10份浓度为2mo1/L的Tris-HCl缓冲液，充分混合，形成第三混合物；

步骤D，向步骤C中获得的第三混合物中，滴加浓度为2mol/L的HCl，调节pH值至7.4，最后加纯水定容至100mL，获得酪蛋白溶液。

通过上述技术方案，酪蛋白较难充分溶解于水中，选择将酪蛋白直接加入到纯水中，而不添加其他组分，有助于增大酪蛋白与纯水的直接作用，使获得的第一混合物具有混合均匀的效果，从而有助于使添加NaOH、Tris-HCl缓冲液时，可使获得的酪蛋白溶液具有较好的分散效果。

进一步优选为：所述Tris-HCl缓冲液的制备方法包括如下步骤：

在18-28℃，将42mL的Tris加入30mL的纯水中，充分混合，采用浓度为2mol/L的HCl调节pH值至7.4-7.5，在添加纯水定容至100mL，获得Tris-HCl缓冲液。

通过上述技术方案，有助于使获得的Tris-HCl缓冲液的pH值较易被控制在7.4-7.5的范围内。

进一步优选为：所述防腐剂为Proclin-300。

通过上述技术方案，Proclin-300具有优异的抑制微生物生长的作用，从而使本申请中的保存液的整体环境维持状况较好，进而有助于使蛋白保持原始的结构。

进一步优选为：所述保存液的pH值为7.0-7.4。

通过上述技术方案，将保存液的pH值保持在上述范围内，有助于使酪蛋白以及被保存的蛋白均具有较为稳定的保存效果，在后续试验中，能获得较准确的试验结果。

进一步优选为：所述蛋白保存液适用的蛋白包括抗体、酶、酶标抗体中的任意一种。

通过上述技术方案，抗体中的多克隆抗体和单克隆抗体，酶中包括的辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、脲酶等，酶标抗体中包括的抗体和酶的偶联物，均可以采用本申请中的保存液进行保存，且有效的保存时间在12个月及以上。

本发明的目的二在于提供一种蛋白保存液的制备方法，有助于提高形成的保存液的均匀效果。

为实现上述目的二，本发明提供了如下技术方案：

一种蛋白保存液的制备方法，以100mL保存液计，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一，配制Tris-HCl缓存液；

步骤二，配制酪蛋白溶液；

步骤三，将氯化钠与步骤一中获得的Tris-HCl缓存液充分混合，再加入步骤二中获得的酪蛋白溶液，充分混合，最后，加入防腐剂，充分混合，定容，获得蛋白保存液。

通过上述技术方案，将酪蛋白溶液加入到氯化钠与Tris-HCl缓存液形成的混合溶液中，可保护酪蛋白溶液中的酪蛋白维持稳定的状态，从而也增加了整个保存液体系的稳定性。

本发明的目的三在于提供一种采用保存液保存蛋白的方法，其解决了传统的保存液需在超低温下保存的问题。

为实现上述目的三，本发明提供了如下技术方案：

一种采用保存液保存蛋白的方法，包括如下步骤：

将蛋白加入上述的保存液中，置于2-8℃的环境中保存。

通过上述技术方案，将蛋白保存于2-8℃的环境中，即可获得较好的保存效果。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.在2-8℃的环境下保存蛋白，降低了保存所需的成本；也节省了冷冻保存后进行试验时解冻所需要的时间，使后续的检测或者试验操作更加方便快捷；

2.采用本申请中的保存液可达到较好的保存效果，且该保存效果可持续至少12个月，12个月后，被保存的蛋白仍可较为可靠、稳定地进行检测，且检测效果准确性高；

3.本申请中内的保存液的成本较低。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行详细描述。

实施例1：蛋白保存液，以配制100mL的保存液计，所包括的组分及其相应的用量如表1所示，且通过如下步骤制备获得：

步骤一，配制Tris-HCl缓存液：

在18-28℃，将42mL的Tris加入30mL的纯水中，充分混合，采用浓度为2mol/L的HCl调节pH值至7.4，在添加纯水定容至100mL，获得Tris-HCl缓冲液；

步骤二，配制酪蛋白溶液：

步骤A，在18-28℃，根据重量份数，称取6份酪蛋白，加入45份水，充分混合，形成第一混合物；

步骤B，向步骤A中获得的第一混合物中加入20份浓度为2mol/L的NaOH，充分混合，形成第二混合物；

步骤C，向步骤B中获得的第二混合物中加入10份浓度为2mol/L的Tris-HCl缓冲液，充分混合，形成第三混合物；

步骤D，向步骤C中获得的第三混合物中，滴加浓度为2mol/L的HCl，调节pH值至7.4，最后加纯水定容至100mL，获得酪蛋白溶液；

步骤三，将氯化钠与步骤一中获得的Tris-HCl缓存液充分混合，再加入步骤二中获得的酪蛋白溶液，充分混合，最后，加入防腐剂Proclin-300，充分混合，定容，获得蛋白保存液。

其中，氯化钠、Tris-HCl购自上海国药集团化学试剂有限公司；酪蛋白、Proclin-300购自sigma。

表1实施例1-4中包括的组分及其相应的用量

实施例2-5：蛋白保存液，与实施例1的区别在于，以配制100mL的保存液计，所包括的组分及其相应的用量如表1所示。

对比例1：保存液，与实施例1的区别在于，配制含有0.3w/v％的牛血清白蛋白、NaOH和作为缓冲液的0.05mol/L的磷酸缓冲液，且余量为纯水的pH值7.0的溶液。向该溶液中添加1，2-EDS作为添加物，使浓度达到表1所示的各浓度(0.01～0.2mol/L)，配制各浓度的溶液。向该配制的各溶液10mL中添加溶血的血红蛋白，达到600ng/mL，获得保存液。

对比例2-3：保存液，与实施例1的区别在于，所包括的组分及其用量如表2所示。

表2对比例2-3中的组分及其用量

对比例4：保存液，与实施例1的区别在于，使保存液的pH值为7.5。

对比例5：保存液，与实施例1的区别在于，将实施例1中所有的组分同时进行混合并搅拌2h。

试验

试验样品：选取实施例1-5中获得的蛋白保存液作为试验样1-5，选取对比例1-4中获得的保存液作为对照样1-4。

试验方法：

1、采用兔单克隆抗体Ki-67(克隆号：SP6)作为蛋白进行试验，分别采用试验样1-5、对照样1-4进行保存，分组编号为1-9；将试验样1-5、对照样1-4分别稀释至1μg/mL，在8℃的条件下保存12个月后，记录免疫组化检测的效果；

2、用碱性磷酸酶标记的鼠单克隆抗体分别采用试验样1-5、对照样1-4进行保存，分组编号为1-9；试验样1-5、对照样1-4分别稀释至40ng/mL，在2℃的条件下保存12个月后，记录化学发光检测的效果。

试验结果：兔单克隆抗体Ki-67在保存前后的免疫组化检测结果如表3所示；鼠单克隆抗体在保存前后的化学光检测结果如表4所示。

表3兔单克隆抗体Ki-67在保存前后的免疫组化检测结果

表4鼠单克隆抗体在保存前后的化学光检测结果

由表3和表4可知，无论是采用兔单克隆抗体Ki-67作为试验用的蛋白，还是采用用碱性磷酸酶标记的鼠单克隆抗体作为试验用的蛋白，试验样1-5保存后的蛋白的检测效果与刚稀释时的检测结果一致，说明试验样1-5在2-8℃的环境下对蛋白具有较好的保存效果。

而对照样1-4(即组6-9)中，经过12个月的保存后，与刚稀释时的检测结果相差较大，与组1-5相比较，说明组分及其用量、制备方法对保存液的保存效果具有较大的影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种蛋白保存液，其特征在于，以100mL保存液计，包括如下组分：

氯化钠2.535-3.501g；

Tris-HCl缓冲液6-7mL；

酪蛋白溶液20-28mL；

防腐剂28-31μL；

余量为纯水；

所述Tris-HCl的pH值为7.4-7.5。

2.根据权利要求1所述的蛋白保存液，其特征在于，以100mL保存液计，所述保存液包括如下组分：

氯化钠2.535-3.112g；

Tris-HCl缓冲液6.58-7mL；

酪蛋白溶液24-28mL；

防腐剂29-31μL；

余量为纯水。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白保存液，其特征在于，所述酪蛋白溶液的制备方法包括如下步骤：

步骤A，在18-28℃，根据重量份数，称取6份酪蛋白，加入45份纯水，充分混合，形成第一混合物；

步骤B，向步骤A中获得的第一混合物中加入20份浓度为2mol/L的NaOH，充分混合，形成第二混合物；

步骤C，向步骤B中获得的第二混合物中加入10份浓度为2mol/L的Tris-HCl缓冲液，充分混合，形成第三混合物；

步骤D，向步骤C中获得的第三混合物中，滴加浓度为2mol/L的HCl，调节pH值至7.4，最后加纯水定容至100mL，获得酪蛋白溶液。

4.根据权利要求1或2所述的蛋白保存液，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的制备方法包括如下步骤：

在18-28℃，将42mL的Tris加入30mL的纯水中，充分混合，采用浓度为2mol/L的HCl调节pH值至7.4-7.5，在添加纯水定容至100mL，获得Tris-HCl缓冲液。

5.根据权利要求1或2所述的蛋白保存液，其特征在于，所述防腐剂为Proclin-300。

6.根据权利要求1或2所述的蛋白保存液，其特征在于，所述保存液的pH值为7.0-7.4。

7.根据权利要求1或2所述的蛋白保存液，其特征在于，所述蛋白保存液适用的蛋白包括抗体、酶、酶标抗体中的任意一种。

8.权利要求1-2中任意一项所述的一种蛋白保存液的制备方法，其特征在于，以100mL保存液计，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一，配制Tris-HCl缓存液；

步骤二，配制酪蛋白溶液；

步骤三，将氯化钠与步骤一中获得的Tris-HCl缓存液充分混合，再加入步骤二中获得的酪蛋白溶液，充分混合，最后，加入防腐剂，充分混合，定容，获得蛋白保存液。

9.一种采用保存液保存蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：将蛋白加入至如权1-2中任意一种保存液中，置于2-8℃的环境中保存。