CN106568976A - 一种神经元特异性烯醇化酶稳定剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及神经元特异性烯醇化酶稳定剂,通过如下原料制备而成:Tris·HCl缓冲液、NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇、甘油、Tween‑20、Triton X‑100、终浓度抑肽酶、Proclin 300,Millipore超纯水作为溶剂,溶液混匀后用0.22μm滤膜过滤,0~10℃保存。本发明能大大提高神经元特异性烯醇化酶的保存稳定性,延长试剂盒的货架寿命;简化神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒的生产工艺及医生检测操作过程;提高了神经元特异性烯醇化酶配制、运输和储存过程中抗质变的能力;降低了由冻干工艺造成的批间差。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域,具体涉及一种神经元特异性烯醇化酶稳定剂及其制备方法。本发明提供的稳定剂用于NSE的保存,能够显著提高NSE化学性质的稳定,维持其空间构象,提高其耐热性。
背景技术
神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific Enolase,NSE)是烯醇化酶的一种同工酶,NSE基因核苷酸序列全长2423bp,开放读码框架从第226到1531个碱基,长度为1305bp,编码全部434个氨基酸。NSE生物半衰期可能大约20小时,NSE分子量为78kDa,等电点为pH4.7,是一种酸性蛋白酶,主要参与糖酵解,催化2-磷酸甘油变成烯醇式磷酸丙酮酸。
NSE广泛分布于人类及各种动物的成熟神经元、周围神经的神经内分泌细胞和一些感觉细胞中,正常人脑组织中含量最高,起源于神经内分泌细胞的肿瘤组织也有异常表达。常见于神经母细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤等。正常情况下脑脊液和血清中只含有微量(约15ng/mL)NSE,但在脑血管意外、脑创伤、脑肿瘤等疾病时,NSE可增加到几千ng/mL。NSE含量的升高是由于NSE分泌到神经细胞外或是由于神经元受损而释放出细胞外,目前还不清楚。
在起源于神经外胚层或神经内分泌组织的肿瘤病人血清、脑脊液中NSE水平升高,其中患小细胞肺癌和神经母细胞瘤的患者尤为明显。目前NSE被认为是脑损伤(神经母细胞瘤、急性脑血管疾病、缺氧性损伤等)和小细胞肺癌(SCLC)的一项高特异性和高敏感性的生化指标,对小细胞肺癌病人和颅脑损伤病人的早期诊断、病情监测、疗效评价等有重要价值。
小细胞肺癌、神经母细胞瘤、神经内分泌细胞肿瘤(如嗜铬细胞瘤、胰岛细胞瘤、黑色素瘤)等疾病中NSE水平增高,检测NSE可用于辅助诊断、病情监测、疗效评价和复发预报。监测小细胞肺癌的复发,比临床确定复发要早4~12周。NSE还可用于神经母细胞瘤和肾母细胞瘤的辅助诊断,前者NSE异常增高而后者增高不明显。
正是由于NSE的检测在临床上具有重要的应用价值,人们已经逐渐开发出用于NSE检测的体外诊断试剂盒,但是通常情况下,NSE的生物半衰期大约为20h,难于长期稳定保存。为了解决此问题,人们一般采用冷冻干燥的技术,将NSE溶液制备成冻干粉,以解决NSE稳定性差,难以保存的问题。但是目前NSE的配置保存存在以下不足:
(1)冷冻干燥技术需要用到冷冻干燥机,增加了设备投入和维护管理成本;
(2)由于NSE极其不稳定,溶液配制过程中NSE活性容易衰减,加上冷冻干燥工艺本身稳定性较差,这样会导不同批次间误差较大。
(3) 对医生使用来说,冻干粉在使用前需要复溶和混匀,增加了操作步骤和时间成本;复溶后的溶液保存周期短,如果复溶后短期内没有使用完,则不可再用,会造成浪费。
(4)NSE的不稳定,给企业生产增加了难度和提高了生产成本;给医生使用带来了不便;给患者增加了检测成本。
发明内容
神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific Enolase,NSE)生物半衰期短,保存稳定性差,导致NSE保存稳定性差的原因的文献研究报道不多。本申请发明人在大量实验研究的基础上,逐步弄清楚NSE保存稳定性差的原因,通过筛选上百种保存液配方,最终配置出了能够使得NSE长期稳定保存的稳定剂。
本发明解决上述问题所采用的技术方案为:
一种神经元特异性烯醇化酶稳定剂,通过如下配比的原料制备而成:10~100mMTris·HCl缓冲液,pH7.4、 3~6g/L NaCl、5~20g/L蔗糖、5~100g/L海藻糖、1~10g/L酪蛋白、5~50g/L牛血清白蛋白、1~30g/L PEG6000、0.1~1.5g/L赖氨酸、0.4~20g/L乙二胺四乙酸二钠、0.5~10 g/L二硫苏糖醇、1%~10%(v/v)甘油、0.01%~0.5%(v/v)Tween-20、0.01%~0.5%(v/v)Triton X-100、终浓度100~300KIU/mL抑肽酶、0.02%~0.1%(v/v)Proclin 300,Millipore超纯水作为溶剂。
配制步骤如下:
1)称取Tris,加入Millipore超纯水溶解,配成50mM的Tris溶液,用盐酸调节pH至7.4的缓冲溶液;
2)依次称取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇,溶解于Tris·HCl缓冲液;
3)取甘油、Tween-20、Triton X-100、抑肽酶和Proclin 300加入步骤2配制好的溶液中,充分搅拌溶解,溶液混匀后用0.22μm滤膜过滤,0~10℃保存
本发明的稳定剂能够使得极其不稳定的神经元特异性烯醇化酶液态下37℃恒温放置7天活性下降小于10%,室温(25℃)放置15天活性下降小于10%,4℃放置1年活性下降小于10%,从而显著改善NSE体外诊断试剂盒货架寿命,提高其商业价值。原理说明如下:
(1)维持NSE本身化学结构不变:通过加入还原剂和抗氧化剂,防止NSE本身发生氧化还原反应,从而防止NSE本身化学结构发生改变。
(2)维持NSE活性中心分子构象不变:通过加入单一的或复配的糖类、多羟基类、蛋白质类、氨基酸类、非离子型表面活性剂类等保护剂,通过氢键、静电、疏水等作用力,以及通过增加空间位阻、提高体系粘度、提高NSE的玻璃化转变温度等方式来维持NSE活性中心的分子构象不变。
(3)防止微生物及酶对NSE分子结构的破坏:通过加入防腐剂、酶抑制物来防止微生物及酶对NSE分子结构的破坏。
所用抗氧剂乙二胺四乙酸二钠的浓度优选为8g/L;防腐剂Proclin300的浓度优选为0.05%(v/v)。
所用盐种类为NaCl,优选浓度优选为5g/L。
所用缓冲溶液Tris·HCl的浓度优选为50 mM。
所用糖类保护剂采用非还原性二糖蔗糖和海藻糖复配物,蔗糖浓度优选为10g/L,海藻糖浓度优选为50g/L。
所用多羟基类保护剂为小分子的甘油和大分子的聚乙二醇(PEG6000)的复配物,甘油浓度优选为10%(v/v),PEG6000浓度优选为5g/L。
所用蛋白类保护剂为酪蛋白和牛血清白蛋白的复配物,酪蛋白浓度优选为3g/L,牛血清白蛋白浓度优选为20g/L。
所用氨基酸类保护剂为赖氨酸,赖氨酸浓度为1g/L。
所用还原剂为二硫苏糖醇,浓度优选为3g/L。
非离子型表面活性剂采用Tween-20和Triton X-100的复配物,其中Tween-20 浓度优选为0.1%(v/v)、Triton X-100浓度优选为0.2%(v/v)。
所用抑肽酶的含量优选为150 KIU/mL。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明的稳定剂能够使得极其不稳定的神经元特异性烯醇化酶NSE液态下37℃恒温放置7天活性下降小于10%,室温(25℃)放置15天活性下降小于10%,4℃放置1年活性下降小于10%,从而显著改善NSE体外诊断试剂盒货架寿命,提高其商业价值。
从生产企业角度看,无需配置冷冻干燥设备,NSE无需制成冻干粉,可以直接液态保存,节省了设备成本,简化了产品配置工艺,同时提高了产品生产稳定性。从检测医师角度看,无需复溶,产品即开即用,且未一次性用完时,仍可以于4℃放置30天以上,保存期间可继续使用,带来方便的同时减少了浪费;从患者角度看,企业生产成本和检测成本的降低,看病时的检测成本也就降低了。
附图说明
图1为本发明实施例与对比例在4℃保存条件下不同保存时间NSE的稳定性;
图2为本发明实施例与对比例在25℃(室温)保存条件下不同保存时间NSE的稳定性;
图3为本发明实施例与对比例在37℃保存条件下不同保存时间NSE的稳定性。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行说明,所举的实施例仅是对本发明产品或方法作概括性例示,有助于更好地理解本发明,但并不会限制本发明范围。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本实施例1提供的NSE稳定剂包含的组分及含量如下:
组分 | 含量 |
Tris·HCl缓冲液,pH=7.4 | 50mM |
NaCl | 5g/L |
蔗糖 | 10g/L |
海藻糖 | 50g/L |
酪蛋白 | 3g/L |
牛血清白蛋白 | 20g/L |
PEG6000 | 5g/L |
赖氨酸 | 1g/L |
乙二胺四乙酸二钠 | 8g/L |
二硫苏糖醇 | 3g/L |
甘油 | 10%(v/v) |
Tween-20 | 0.1%(v/v) |
Triton X-100 | 0.2%(v/v) |
抑肽酶 | 150 KIU/mL |
Proclin 300 | 0.05%(v/v) |
制备步骤为:
1.称取Tris适量,加入Millipore超纯水溶解,配成50mM的Tris溶液,用盐酸调节pH=7.4;
2.依次称取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇,溶解于Tris·HCl缓冲液;
3.取甘油、Tween-20、Triton X-100、抑肽酶和Proclin 300加入上述配制好的溶液中,充分搅拌溶解,最后用0.22μm滤膜过滤,4℃保存备用。
NSE稳定剂对NSE保存稳定性考察:
评价原理。采用化学发光免疫分析法,通过发光值的变化来评价NSE活性的变化,其过程为:链霉亲和素包被板先与Biotin-Anti-NSE结合,然后与NSE结合,最后再加入HRP-Anti-NSE,经过洗涤后,加入发光底物液,发光底物液可在HRP催化下进行化学发光,且在一定范围内发光强度与NSE的含量成正比。
评价方法:以国际知名品牌HyTest商品化NSE为原料,以江苏福隆生物技术有限公司开发的神经元特异性烯醇化酶测定试剂盒为检测平台,用本实施例配制的稳定剂将NSE配制成60ng/mL的溶液,将配好的NSE溶液分成3组,第1组放4℃保存、第2组放室温(25℃)保存、第3组放37℃恒温箱中保存。同时购买商品化的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,取其中制备成冻干粉的NSE,按其说明书操作加入双蒸水溶解同样配制成60ng/mL的溶液,作为对比组,与实验组一起分别放于4℃、室温(25℃)和37℃保存,保存一定时间后,于全自动化学发光仪上检测其化学发光值的变化,进而计算出其活性变化百分比,检测结果如图1至3所示:
由图1可知,用实施例1所得的NSE稳定剂稀释NSE在4℃下保存365天后,NSE的活性维持在94%左右,而商品化对照组活性几乎全部丧失。由图2可知,用实施例1所得的NSE稳定剂稀释NSE在室温(25℃)下保存15天后,NSE的活性维持在94%左右,而商品化对照组活性只有15%。由图3可知,用实施例1所得的NSE稳定剂稀释NSE在室温37℃下保存7天后,NSE的活性维持在92%左右,而商品化对照组活性只有2%。
通过上述实验对比可知,本发明所涉及的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,能大大提高神经元特异性烯醇化酶的保存稳定性,延长试剂盒的货架寿命;简化神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒的生产工艺及医生检测操作过程;提高了神经元特异性烯醇化酶配制、运输和储存过程中抗质变的能力;降低了由冻干工艺造成的批间差,是一种高效的神经元特异性烯醇化酶稳定性。
除上述实施例外,本发明还包括有其他实施方式,凡采用等同变换或者等效替换方式形成的技术方案,均应落入本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,通过如下配比的原料制备而成:10~100mM Tris·HCl缓冲液,pH7.4、 3~6g/L NaCl、5~20g/L蔗糖、5~100g/L海藻糖、1~10g/L酪蛋白、5~50g/L牛血清白蛋白、1~30g/L PEG6000、0.1~1.5g/L赖氨酸、0.4~20g/L乙二胺四乙酸二钠、0.5~10 g/L二硫苏糖醇、1%~10%(v/v)甘油、0.01%~0.5%(v/v)Tween-20、0.01%~0.5%(v/v)Triton X-100、终浓度100~300KIU/mL抑肽酶、0.02%~0.1%(v/v)Proclin 300,Millipore超纯水作为溶剂;
配制步骤如下:
1)称取Tris,加入Millipore超纯水溶解,配成50mM的Tris溶液,用盐酸调节pH至7.4的缓冲溶液;
2)依次称取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇,溶解于Tris·HCl缓冲液;
3)取甘油、Tween-20、Triton X-100、抑肽酶和Proclin 300加入步骤2配制好的溶液中,充分搅拌溶解,溶液混匀后用0.22μm滤膜过滤,0~10℃保存。
2.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,抗氧剂乙二胺四乙酸二钠的浓度为8g/L;防腐剂Proclin300的浓度为0.05%(v/v)。
3.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,Tris·HCl缓冲液的浓度为50 mM。
4.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,蔗糖浓度为10g/L、海藻糖浓度为50g/L。
5.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,甘油浓度为10%(v/v),PEG6000浓度为5g/L。
6.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,酪蛋白浓度为3g/L、牛血清白蛋白浓度为20g/L。
7.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,赖氨酸浓度为1g/L。
8.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,二硫苏糖醇浓度为3g/L。
9.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于, Tween-20 浓度为0.1%(v/v)、Triton X-100浓度为0.2%(v/v)。
10.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶稳定剂,其特征在于,抑肽酶的含量为150 KIU/mL。
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