ES2536739T3

ES2536739T3 - Control de referencia para análisis célula a célula

Info

Publication number: ES2536739T3
Application number: ES09807048.5T
Authority: ES
Inventors: Andreas Van Agthoven; Fabrice Malergue
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2008-08-13
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2015-05-28
Anticipated expiration: 2029-07-24
Also published as: WO2010019372A1; EP2324350A4; CN102177437B; EP2324350A1; CN102177437A; US7968279B2; USRE45617E1; US20100041011A1; EP2324350B1

Abstract

Un control de referencia congelado para el análisis célula a célula en un analizador de tipo citómetro de flujo que comprende: análogos celulares formados de células sanguíneas permeadas que contienen en su interior proteínas intracelulares agregadas y uno o más sitios antigénicos de los mismos conservados, que tienen una membrana celular permeable a un anticuerpo; y una solución de almacenamiento que comprende una sal en una concentración de 0,05 M a 2 M y un sacárido en una concentración de 0,1 M a 2 M, en donde dicha solución de almacenamiento no contiene agentes protectores que interfieren con el análisis que deba llevarse a cabo; en donde dichos análogos celulares se suspenden en dicha solución de almacenamiento y dichos análogos celulares mantienen dichos uno o más sitios antigénicos conservados de dichas proteínas después de descongelar dicho control de referencia congelado.

Description

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preparan análogos de glóbulos rojos para la medición de hemoglobina celular utilizando el proceso anteriormente descrito, no es necesario separar los glóbulos blancos y las plaquetas de los glóbulos rojos, porque en un análisis célula a célula utilizando mediciones por dispersión de luz y/o fluorescencia, las plaquetas y los glóbulos blancos pueden diferenciarse de los análogos de glóbulos rojos utilizando señales de dispersión de luz y/o fluorescencia.

El Ejemplo 2 ilustra un proceso ilustrativo de preparación de análogos de glóbulos rojos marcados utilizando sangre entera con el método de la presente invención anteriormente descrito. La preparación del control de referencia se describe específicamente en un proceso de preparación de un análogo de glóbulos rojos marcado que se describirá más adelante de forma más detallada. Sin embargo, el proceso, a diferencia de las etapas relacionadas con el marcado, puede utilizarse para preparar análogos celulares no marcados. Se observa además que cuando se preparan los análogos celulares sin un marcaje de fluorescencia, no es necesario lavar las células sanguíneas, y la sangre entera puede utilizarse directamente para preparar el control de referencia. Además, el proceso puede utilizarse también para preparar otros análogos celulares tales como glóbulos blancos, o subpoblaciones específicas de glóbulos blancos.

Con el fin de medir la hemoglobina celular, los glóbulos rojos marcados preferiblemente se exponen también a un reactivo de esferación para proporcionar a los glóbulos rojos forma de esfera, antes de tratarlos con el reactivo de permeación. La etapa de esferación es opcional Además, cuando se prepara un análogo de glóbulos blancos, dicha etapa no es necesaria.

Un reactivo de permeación utilizado en la presente invención se denomina también reactivo de permeabilización y estabilización celular, y su función en la permeación de la membrana celular y en la conservación de los componentes celulares para las mediciones por citometría de flujo se ha descrito en US-20060178294 A1.

Por ejemplo, el reactivo de permeación es una solución acuosa que comprende N-acilsarcosina o una sal de la misma representada por la siguiente estructura molecular:

R1-CO-N(CH3)CH2COOX1

en la que R1 es un grupo alquilo o alquileno que tiene de 8 a 18 átomos de carbono, y X1 es H, Na+, o K+, y uno o más agentes de ajuste del pH para ajustar el pH del reactivo a menos de 7. El reactivo de permeación es preferiblemente ligeramente ácido, con un pH en un intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6. Más preferiblemente, el pH del reactivo es de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 5,6.

Preferiblemente, el agente de regulación del pH es una base o un ácido fuerte, por lo que puede usarse una pequeña cantidad para ajustar el pH en el intervalo deseado. Por ejemplo, para ajustar el pH entre 4 y 6 se usa ácido libre de Nacilsarcosina y pirrolidina, una base orgánica fuerte, o NaOH, una base inorgánica fuerte. Si se usa sal de Nacilsarcosina, puede usarse un ácido fuerte para ajustar el pH, por ejemplo HCl. Además, puede usarse un tampón orgánico para mantener el pH. En un ejemplo se usa ácido succínico, que tiene un pKa1 de 4,19 y un pKa2 de 5,57.

El reactivo de permeación tiene una baja fuerza iónica definida por una conductividad inferior a 9,0 mS/cm. Se ha descubierto que tras exponer las células al reactivo de permeación, la agregación de la proteína intracelular es más eficaz para valores de fuerza iónica bajos. La fuerza iónica deseada de la composición de reactivo acuoso se cuantifica a partir de la conductividad del reactivo. Se cree que la agregación de la proteína intracelular es necesaria para conservar la integridad celular después de la permeación. Cuando la fuerza iónica del reactivo de permeación es demasiado alta, por ejemplo cuando la conductividad del reactivo es 9 mS/cm o superior, el reactivo ya no puede agregar proteínas intracelulares y las células pierden su integridad. Preferiblemente, el reactivo de permeación tiene una conductividad inferior a 3,0 mS/cm, más preferiblemente inferior a 1,2 mS/cm. Puesto que los compuestos iónicos, tales como las sales, son los principales contribuyentes en términos de fuerza iónica de una solución acuosa, es preferible que la concentración salina en el reactivo de permeación sea baja.

La N-acilsarcosina, en forma de ácido libre, y la sal de la misma, se encuentran disponibles comercialmente. Es preferible utilizar la forma de ácido libre, que no introduce iones de metal en el reactivo de permeación. La N-acilsarcosina en forma de ácido libre no es soluble en agua. Se puede disolver previamente en una solución de etanol y a continuación añadirla a la solución acuosa. Cuando el pH del reactivo de permeación se ajusta entre 4 y 6 con una base, como un agente de regulación del pH, el ácido libre de la N-acilsarcosina puede disolverse y está presente en la solución en forma de anión.

Ejemplos adecuados de N-acilsarcosina incluyen N-oleilsarcosina, N-estearoilsarcosina, N-lauroilsarcosina, Nmiristoilsarcosina, N-cocoilsarcosina, y sales de las mismas. Preferiblemente, el grupo alquilo o alquileno de R1 tiene 12 átomos de carbono. En una realización preferida, se utiliza N-lauroilsarcosina.

El reactivo de permeación N-acilsarcosina o la sal del mismo se encuentra en una cantidad suficiente para permear la membrana celular lo suficiente para permitir la penetración de marcadores intracelulares a través de la membrana permeada, conservando al mismo tiempo de forma sustancial la estructura de la membrana celular y los constituyentes celulares para las uniones específicas con sus marcadores celulares para el análisis célula a célula mediante citrometría de flujo. Se ha descubierto que la concentración de N-acilsarcosina puede estar en un intervalo

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de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 100 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm y, más preferiblemente, de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 5 mm.

De forma opcional, el reactivo de permeación puede comprender además un tensioactivo aniónico representado por la siguiente estructura molecular:

R2-O-SO3X2

en la que R2 es un grupo alquilo o alquileno que tiene de 8 a 18 átomos de carbono; y X2 es Na+, K+, NH4+, o NH2C(CH2OH)3 (es decir, tris(hidroximetil)-aminometano). Preferiblemente, el grupo alquilo o alquileno de R2 del tensioactivo aniónico tiene 12 átomos de carbono. Ejemplos adecuados incluyen laurilsulfatos de sodio, potasio, amonio y tris(hidroximetil)aminometano. En una realización preferida, se utiliza laurilsulfato de tris(hidroximetil)aminometano, denominado en adelante Tris laurilsulfato. El sulfato de alquilo o de alquileno puede estar en un intervalo de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 5 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,05 mm a aproximadamente 2 mm.

Preferiblemente, el reactivo de permeación comprende además uno o más agentes de regulación de la osmolalidad orgánicos. Ejemplos adecuados del agente de regulación de la osmolalidad incluyen, aunque de forma no limitativa, agentes sacáridos, etilenglicol, dimetilsulfóxido, o glicerol. Preferiblemente se utiliza sacárido o glicerol. El sacárido puede ser un polisacárido, por ejemplo un disacárido, o un monosacárido. En una realización ilustrativa como se muestra en el Ejemplo 1 se utiliza sacarosa. En presencia de agentes de regulación de la osmolalidad orgánicos, aunque el reactivo de permeación tiene una fuerza iónica muy baja, es solamente ligéramente hipotónico, y tiene una osmolalidad de aproximadamente 240 a aproximadamente 280 mOsm/kg H2O.

De forma opcional, el reactivo de permeación comprende además una seroalbúmina como, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA). La albúmina de suero aumenta la solubilidad del tensioactivo en la solución acuosa, y es ventajosa para un uso y almacenamiento duraderos del reactivo de permeación.

Además, el reactivo de permeación puede comprender además uno o más conservantes. Ejemplos adecuados incluyen agentes antimicrobianos y antioxidantes, para aumentar el período de validez del reactivo de permeación. El conservante puede estar presente en una cantidad que no interfiera con la función del reactivo de permeación. En un ejemplo, se utilizan 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona como agentes antimicrobianos. Rohm and Hass, de Philadelphia (Pensylvania) fabrican combinaciones de 5-cloro-2metil-4-isotiazolin-3-ona y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona, que son comercializadas con el nombre comercial Proclin® 150 y Proclin® 300. El Ejemplo 1 muestra una composición ilustrativa del reactivo de permeación.

Preferiblemente, la sangre se mezcla con el reactivo de permeación con una relación reactivo:sangre de aproximadamente 100:1 o superior. La mezcla de permeación formada se incuba durante un período de tiempo suficiente para permitir la reacción del reactivo de permeación con las células. Preferiblemente, el período de reacción es de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos, más preferiblemente de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 5 minutos.

Se ha descubierto que cuando se mezcla con células sanguíneas, el reactivo de permeación permea de forma eficaz la membrana celular en una cantidad que permite la penetración de marcadores intracelulares macromoleculares, tales como anticuerpos, en la célula para unirse a un componente intracelular para una medición posterior. El reactivo de permeación da lugar a la agregación de la proteína intracelular dentro de las células, conservando al mismo tiempo los componentes celulares, tales como los sitios antigénicos intracelulares y de superficie celular, las moléculas de ADN y de ARN, y los elementos del citoesqueleto, para un posterior análisis célula a célula. Además, durante el tratamiento de permeación el reactivo de permeación confiere también a los glóbulos rojos forma de esfera, lo que permite la medición de los glóbulos rojos por medición de dispersión de la luz, sin efectos indeseables de forma y orientación celular heterogéneas.

Para el fin de la presente invención, el “componente celular” o “constituyente celular” incluye componentes celulares dentro de las células, y sobre la superficie de la membrana celular como, por ejemplo, sitios antigénicos de superficie celular. El término “componente intracelular” o “constituyente intracelular” hace referencia a un componente celular en el interior de las células, lo que incluye, aunque de forma no limitativa, proteínas intracelulares, tales como hemoglobina y variantes de hemoglobina dentro de los glóbulos rojos, elementos de citoesqueleto, ADN y ARN. Los elementos de citoesqueleto incluyen, aunque de forma no limitativa, tubulina y espectrina. El término “marcador celular” utilizado en la presente memoria incluye, aunque de forma no limitativa, un anticuerpo específico para un sitio antigénico de una proteína intracelular, un sitio antigénico de superficie celular, o un elemento de citoesqueleto; un tinte, por ejemplo un tinte de ácido nucleico o un tinte específico para una proteína celular, y una muestra de ácido nucleico específica para una molécula de ADN o de ARN, por ejemplo una muestra de oligonucleótido. Preferiblemente, el marcador celular es fluorescente o está marcado con un tinte fluorescente. Además, el marcador celular específico para un componente intracelular se conoce como marcador intracelular.

Como se describe en US-2006/0178294 A1, el reactivo de permeación ocasiona la precipitación de la fracción sérica, la fracción celular soluble (citosol) y la fracción de membrana obtenida a partir de sangre entera. Puede tener lugar una fuerte

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Debería entenderse que la composición de la solución de almacenamiento, que es el medio de suspensión de los análogos del control de referencia, puede determinarse a partir de la prueba analítica que vaya a realizarse a continuación. En otras palabras, la composición del medio de suspensión es compatible con la prueba analítica que vaya a realizarse. El Ejemplo 1 ilustra una composición de solución de almacenamiento ilustrativa adecuada para la medición de hemoglobina celular y variante de hemoglobina descrita en la presente memoria. En este ejemplo, la solución de almacenamiento es una solución acuosa que contiene una sal y una concentración elevada de sacarosa y que tiene un pH neutro.

Se ha descubierto que la hemoglobina celular de los análogos de glóbulos rojos puede determinarse utilizando señales de dispersión lateral de los análogos medidas en analizadores citométricos, como queda ilustrado adicionalmente en los ejemplos. Esta propiedad de los análogos de glóbulos rojos de la presente invención es sustancialmente diferente de la propiedad de los glóbulos rojos no tratados en sangre entera, glóbulos rojos esferados o glóbulos rojos estabilizados, puesto que la hemoglobina celular de dichas células no puede determinarse mediante medición de dispersión lateral. Aunque el mecanismo exacto no es totalmente comprendido, se cree que la correlación directa entre la hemoglobina celular de los análogos de glóbulos rojos y sus señales de dispersión lateral es atribuible a la propiedad de hemoglobina agregada en las células permeadas tras el tratamiento con el reactivo de permeación. La diferencia puede observarse además por el hecho de que los análogos de glóbulos rojos obtenidos utilizando el método de la presente invención no pueden ser lisados por un reactivo lítico para liberar hemoglobina. En cambio, los glóbulos rojos estabilizados, incluso después de ser tratados con determinadas condiciones de fijación, pueden ser lisados por reactivos líticos para liberar la hemoglobina para la medición en analizadores de química clínica estándar mediante cromatografía o inmunoturbidimetría.

Además, la membrana celular de los análogos de glóbulos rojos de la presente invención es altamente permeada, lo que hace posible que marcadores macromoleculares tales como anticuerpos, penetren y se unan a proteínas intracelulares. Se ha descubierto que cuando los análogos de glóbulos rojos de la presente invención se miden por medición de impedancia, por ejemplo mediante medición de impedancia de corriente continua (CC) en analizadores de hematología, las señales de impedancia de dichos análogos son sustancialmente menores que las generadas por glóbulos rojos no tratados o por glóbulos rojos fijados. La medición de impedancia de CC se ha utilizado habitualmente en analizadores de hematología para medir el tamaño de las células sanguíneas. La medición se basa en el aumento de resistencia eléctrica ocasionada por una célula sanguínea, que repele un volumen de una solución eléctricamente conductora que se está midiendo. Como puede apreciarse, puesto que la membrana celular de los análogos de glóbulos rojos instantáneos está altamente permeada, cuando los análogos se suspenden en una solución conductora, la solución conductora migra libremente hacia fuera y hacia dentro de los análogos. Por lo tanto, las señales de impedancia generadas por dichos análogos son significativamente reducidas. Sin embargo, cuando se miden por medición de dispersión de luz directa, que se utiliza habitualmente también para medir el tamaño celular, dichos glóbulos rojos permeados presentan esencialmente el mismo tamaño celular que los glóbulos rojos esferados. En este contexto, los análogos de glóbulos rojos son sustancialmente diferentes de los glóbulos rojos fijados. Estos últimos no son permeables a los anticuerpos y tienen señales de impedancia sustancialmente equivalentes como glóbulos rojos no tratados.

Como se describe más adelante, el reactivo de permeación y el reactivo de neutralización utilizado para preparar los análogos celulares para el control de referencia de la presente invención son los mismos reactivos utilizados para procesar las muestras de sangre que deben medirse en los analizadores de tipo citómetro de flujo. Los análogos celulares formados se lavan y se resuspenden en la solución de almacenamiento sin ser fijados por los fijadores usados habitualmente en la formación de análogos celulares. Sin embargo, como se demuestra posteriormente con los ejemplos, en ausencia de tratamiento con fijadores, dichos análogos celulares son estables cuando se exponen a condiciones de congelación y descongelación y mantienen la especificidad de los sitios antigénicos para inmunoensayos.

Para una estabilidad duradera, el control de referencia se mantiene congelado después de haberlo preparado. De forma típica, después de la preparación, el control de referencia se transfiere a viales de control. A continuación se congelan los viales de control y se mantienen a una temperatura de forma típica no superior a -10 °C, preferiblemente de -10 °C a 80 °C. Preferiblemente, el control de referencia se congela en menos de veinticuatro horas, más preferiblemente en menos de dos horas, con máxima preferencia en el transcurso de una hora después de la preparación. Durante el transporte a los clientes, el control de referencia se mantiene congelado en hielo seco u en otros materiales adecuados. Antes del uso, se descongela a temperatura ambiente un vial de control de referencia congelado. Tras descongelar, el control de referencia se mezcla suavemente para formar una suspensión de análogo homogéneo antes de su uso.

Como puede apreciarse, para el fin de la presente invención, la solución o medio de almacenamiento es adecuada para el almacenamiento en condiciones de congelación y de descongelación. La solución de almacenamiento es una solución acuosa que comprende una sal y un sacárido. La concentración de sal puede ser de 0,05 M a 2 M, preferiblemente de 0,1 M a aproximadamente 0,5 M. El sacárido puede ser un polisacárido, por ejemplo un disacárido, o un monosacárido. En una realización ilustrativa mostrada en el Ejemplo 1 se utiliza sacarosa. La concentración de sacárido puede ser de 0,1 M a 2 M, preferiblemente de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M. Se ha descubierto que una concentración relativamente elevada de sacárido, por ejemplo sacarosa, evita que los análogos celulares desciendan en el vial de control después de la descongelación de la suspensión de análogo congelada y durante el uso durante el análisis. Además, como se ha descrito anteriormente, el medio de suspensión debería ser compatible también con el ensayo que deba realizarse. Por ejemplo, puesto que el fosfato tiende a interferir con los ensayos que deben realizarse en los analizadores de tipo

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Se sabe que la unión de un marcador de fluorescencia a proteínas podría afectar a los sitios antigénicos de la proteína o interferir con la unión a anticuerpos. Por lo tanto, es importante que los análogos marcados del control de referencia retengan sustancialmente su especificidad de unión y afinidad a los anticuerpos utilizados para la prueba analítica.

Se ha descubierto que después de marcar con el marcador fluorescente, se mantienen las propiedades de los análogos celulares anteriormente descritos. Concretamente, la hemoglobina celular de los análogos celulares marcados puede medirse utilizando señales de dispersión lateral del modo anteriormente descrito y demostrado en los ejemplos a continuación. La especificidad de los sitios antigénicos de las proteínas y la permeabilidad de la membrana se mantienen, así como la resistencia de los análogos marcados al tratamiento de congelación y descongelación. El control de referencia de la presente invención, que contiene análogos celulares marcados o análogos no marcados, puede almacenarse mediante el congelamiento anteriormente descrito durante al menos más de un año manteniendo las propiedades de los componentes celulares de los análogos celulares.

El Ejemplo 2 ilustra la preparación de un control de referencia marcado a partir de sangre entera humana normal. El Ejemplo 4 ilustra además un control de referencia marcado obtenido a partir de sangre entera de un paciente diabético, y la estabilidad del control de referencia marcado después de descongelar en las mediciones de hemoglobina celular mediante medición de dispersión lateral y de HbA1c mediante medición de fluorescencia, lo cual se describe en mayor detalle a continuación.

La hemoglobina celular, el contenido de variante de hemoglobina específica tal como HbA1c, y el porcentaje de variante de hemoglobina específica del control de referencia pueden determinarse utilizando mediciones de dispersión lateral y fluorescencia en un analizador de tipo citómetro de flujo descrito detalladamente a continuación. El término “analizador de tipo citómetro de flujo” hace referencia a citómetros de flujo conocidos en la técnica y a analizadores de hematología equipados con dispositivos de dispersión de luz y/o de detección de fluorescencia. Los valores de referencia de dichos parámetros del control de referencia pueden ser asignados midiendo muestras de sangre que tengan valores conocidos de dichos parámetros obtenidos a partir de métodos de referencia existentes y el control de referencia en el mismo analizador de tipo citómetro de flujo con las mismas condiciones de operación. En la técnica se conocen diversos métodos de referencia, por ejemplo, puede obtenerse el contenido de hemoglobina celular medio (MCH) de una muestra de sangre mediante analizadores de hematología, y el porcentaje de HbAc1 puede obtenerse utilizando cromatografía de afinidad, inmunoturbidimetría, o cromatografía de intercambio iónico. El Ejemplo 7 ilustra un proceso detallado de asignación de valores de referencia para el control de referencia.

En un aspecto adicional, se describe un método de uso del control de referencia anteriormente descrito para el análisis célula a célula de componentes celulares de células en analizadores de tipo citómetro de flujo. El control de referencia puede utilizarse como un control independiente o como un control interno. El término de control independiente se refiere a un control de referencia que debe analizarse solo en un analizador de tipo citómetro de flujo, sin mezclar con una muestra. El control independiente se analiza de forma típica con un lote de muestras a modo de referencia para pruebas analíticas internas o externas. El término de control interno se refiere a un control de referencia que se añade a una muestra con la cual se analiza en un analizador de tipo citómetro de flujo.

El método de uso del control de referencia interno para el análisis célula a célula se ilustra a continuación en el ejemplo de medición de hemoglobina celular y porcentaje celular de variantes de hemoglobina. Debe entenderse, sin embargo, que el control de referencia obtenido mediante el método de la presente invención puede utilizarse también para mediciones de otros constituyentes celulares.

En la presente memoria, el término “hemoglobina celular” hace referencia al contenido de hemoglobina total en un glóbulo rojo individual, lo que incluye todas las variantes de hemoglobina presentes en esa célula. El término de hemoglobina celular de reticulocitos hace referencia al contenido de hemoglobina total en un reticulocito individual, lo que incluye todas las variantes de hemoglobina presentes en ese reticulocito. La hemoglobina celular se denomina también hemoglobina célula a célula. El término “variante de hemoglobina” hace referencia a todas las variantes de hemoglobina, por ejemplo, hemoglobina fetal, hemoglobina glicada, como por ejemplo HbA1c, y formas aberrantes de hemoglobina, como por ejemplo las presentes en la enfermedad drepanocítica y en la talasemia. El término “variante de hemoglobina celular” es la cantidad de una variante de hemoglobina en un glóbulo rojo individual. El término “porcentaje celular de una variante de hemoglobina” hace referencia al porcentaje de una variante de hemoglobina frente al contenido de hemoglobina total en un glóbulo rojo individual. Por ejemplo, en la medición de HbA1c descrita en la presente memoria se expresa como porcentaje celular de HbA1c, o porcentaje de HbA1c celular. Por lo tanto, el porcentaje de variante de hemoglobina de una muestra obtenida utilizando el método descrito es el porcentaje celular promedio de esta variante de hemoglobina de todos los glóbulos rojos de una muestra de sangre.

Para usar el control de referencia instantáneo para las mediciones de hemoglobina celular y de variante de hemoglobina celular de una muestra de sangre en un analizador de tipo citómetro de flujo, se proporciona un control de referencia que contiene análogos de glóbulos rojos formados de glóbulos rojos permeados. Los análogos de glóbulos rojos comprenden proteínas intracelulares agregadas y sitios antigénicos conservados de la variante de hemoglobina de interés, y tienen una membrana celular permeable a los anticuerpos. Cuando se usa como control interno o como control independiente, el control de referencia se expone a los mismos reactivos y al mismo procedimiento analítico que una muestra de sangre (ver

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En la presente memoria, el término de señal de dispersión lateral, como se conoce en citometría de flujo, se refiere a la señal de dispersión de luz a aproximadamente 90°, o al ángulo recto de la luz incidente, generado por una partícula o célula sanguínea que pasa a través de una abertura de una célula del flujo. La señal de dispersión directa corresponde a la señal de dispersión de luz medida a menos de 10° de la luz incidente. El término de medición de dispersión lateral se refiere a la medición de las señales de dispersión lateral por parte de un detector óptico. La mayor parte de los citómetros de flujo comercialmente disponibles están equipados con un sistema de detección que permite la medición de las señales de dispersión directa y de dispersión lateral.

En la Fig. 1A, la región A contenía los glóbulos rojos de la muestra de sangre y los análogos del control de referencia marcado, que se seleccionan en este diagrama de dispersión para un posterior análisis diferencial utilizando fluorescencia como se muestra en las Figs. 1B y 1C. Las poblaciones fuera de la región A eran glóbulos blancos y plaquetas.

En la Fig. 1B, la región B contenía los glóbulos rojos maduros de la muestra de sangre; la región C contenía reticulocitos de la muestra de sangre marcados con naranja de acridina; y la región D contenía los análogos del control de referencia marcado, marcados con CFSE. Como se muestra, los glóbulos rojos maduros y los reticulocitos de la muestra de sangre y los análogos del control de referencia marcado se diferencian entre sí en el eje FL1.

En la Fig. 1C, la región F contenía los glóbulos rojos maduros de la muestra de sangre, la región G contenía los reticulocitos de la muestra de sangre, y la región E contenía los análogos del control de referencia marcado.

Como puede apreciarse, la medición de fluorescencia a 525 nm (FL1) mide señales de fluorescencia generadas a partir de ARN teñido con naranja de acridina y de proteínas intracelulares marcadas con CFSE. Como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, el naranja de acridina se utiliza para diferenciar reticulocitos de glóbulos rojos maduros, y el CFSE se utiliza para marcar los análogos celulares del control de referencia. Aunque ambas señales pueden detectarse a la misma longitud de onda, los análogos celulares marcados con CFSE tienen señales sustancialmente más fuertes que los reticulocitos. Por lo tanto, los análogos del control de referencia no se solapan con los reticulocitos en el eje FL1 de los diagramas de dispersión y pueden diferenciarse de los reticulocitos.

La hemoglobina celular media de la muestra de sangre se obtuvo a partir del promedio de los valores de dispersión lateral de los glóbulos rojos individuales de la muestra de sangre. El contenido de HbA1 de la muestra de sangre se obtuvo a partir del promedio de señales de fluorescencia a 675 nm (FL1), tras substraer un valor de fondo de fluorescencia. El porcentaje de HbA1c de la muestra de sangre se calculó dividiendo el contenido de HbA1c de la muestra de sangre por la hemoglobina celular media de la muestra de sangre. Puesto que los glóbulos rojos y los reticulocitos son diferenciables, la hemoglobina celular media y el porcentaje de HbA1c pueden obtenerse para cada una de estas dos subpoblaciones de glóbulos rojos de la muestra de sangre.

De forma similar, puesto que los análogos de glóbulos rojos del control de referencia marcado se diferencian de los glóbulos rojos maduros y de los reticulocitos de la muestra de sangre, la hemoglobina celular media y el porcentaje de H1A1c pueden obtenerse para el control de referencia utilizando señales de dispersión lateral y señales de fluorescencia procedentes de los análogos celulares utilizando los cálculos anteriormente descritos.

Como puede apreciarse, cuando las muestras de sangre que tienen valores conocidos de hemoglobina corpuscular media (MCH, que es la hemoglobina total) y de porcentaje de HbA1c obtenido a partir de los métodos de referencia existentes se miden junto con el control de referencia utilizando el método de la presente invención, dichos valores conocidos y el promedio de las señales de dispersión lateral y el promedio de las señales de fluorescencia de las muestras de sangre pueden usarse para asignar valores de referencia de dichos parámetros al control de referencia de la presente invención, como se ilustra en el Ejemplo 7.

Cuando se usa el control de referencia que tiene valores de referencia asignados como control interno en las muestras de sangre a analizar, la hemoglobina celular media y el porcentaje de HbA1c de las muestras de sangre pueden obtenerse utilizando el control de referencia. Los Ejemplos 7 y 8 ilustran un proceso ilustrativo de este tipo. El mismo mecanismo tiene lugar cuando el control de referencia se utiliza como un control independiente. Además, en los Ejemplos 7 y 8, los procesos de obtención de hemoglobina celular media y el porcentaje de HbA1c de las muestras de sangre utilizando el control de referencia de la presente invención se han descrito en detalle para compararlos con los resultados generales obtenidos utilizando los métodos estándar del laboratorio de referencia, que son un valor para cada parámetro, es decir, la hemoglobina total y el porcentaje de HbA1c, obtenidos a partir del producto de hemolización de cada muestra analizada. Sin embargo, a parte de los promedios de hemoglobina celular y el porcentaje celular de HbA1c, lo que es más importante, el método descrito proporciona hemoglobina celular y porcentaje celular de HbA1c de glóbulos rojos individuales.

Se ha descubierto que la estabilidad del presente control de referencia tras la descongelación es equivalente a la sangre fresca en términos de contenido proteico intracelular y antígenos intracelulares. El Ejemplo 4 ilustra un ejemplo de esto. Como se muestra, se preparó un control de referencia marcado utilizando sangre entera de un paciente diabético con el proceso de preparación anteriormente descrito. En las pruebas de estabilidad, se añadió el control de referencia marcado a una muestra de sangre normal como control interno y a continuación se midió la muestra de sangre utilizando el procedimiento de ensayo descrito en el Ejemplo 3.

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Ejemplo 1 Reactivos utilizados para preparar los análogos celulares para la medición de Hgb celular en citómetro de flujo Composición de reactivo de esferación Se preparó un reactivo de esferación acuoso según la siguiente composición:

Componente Concentración Cloruro de sodio 137 mm HEPES 5 mm D(+) Trehalosa 0,5 mm Formaldehído 83 mm n-Dodecil beta-D-maltósido 40 mm Proclin® -300 0,5 ml/l Hidróxido sódico cantidad para ajuste del pH a 7,5 Agua desionizada cantidad suficiente hasta 1 litro

Los mencionados reactivos se filtraron a través de un filtro de nailon estéril de un tamaño de poro de 0,22 µm, salvo que se indique de otro modo.

Composición de reactivo de permeación

Se preparó el siguiente reactivo de permeación según la siguiente composición:

Componente Concentración N-lauroilsarcosina 2,03 mm Ácido succínico 10 mm Sacarosa 0,22 m Albúmina de suero bovino 0,015 mm Proclin® 300 0,5 ml/l Pirrolidina cantidad para ajuste del pH a 5,4 Agua desionizada cantidad suficiente hasta 1 litro

El reactivo tenía una conductividad de 0,99 mS/cm y una osmolalidad de 268 mOsm/Kg H2O. El Proclin 300 se obtuvo de los laboratorios Zymed de San Francisco (California).

Composición de reactivo de neutralización

Se preparó un reactivo de neutralización acuoso según la siguiente composición:

Componente Concentración HEPES 40 mm Cloruro de sodio 0,5 m Albúmina de suero bovino 0,91 mm Azida sódica 0,03 m Hidróxido sódico cantidad para ajuste del pH a 7,25 Agua desionizada cantidad suficiente hasta 1 litro

Composición de solución de lavado

Se preparó una solución de lavado según la siguiente composición:

Componente Concentración Cloruro de sodio 0,3 m Sacarosa 0,58 m Agua desionizada cantidad suficiente hasta 1 litro pH entre 5 y 8

Composición de solución de almacenamiento

Se preparó una solución de almacenamiento según la siguiente composición:

ComponenteCloruro de sodio SacarosaAgua desionizada: Concentración 0,3 m 0,87 m cantidad suficiente hasta 1 litro

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referencia marcado a la primera mezcla de muestra y se mezcló. Al cabo de 1 minuto de incubación, se añadieron 100 µl del reactivo de neutralización del Ejemplo 1 y se mezcló, formando una segunda mezcla de muestra. El reactivo de neutralización contenía 5 mg/l de anticuerpo anti-HbA1c fluorescente del Ejemplo 1. Al cabo de 10 minutos más de incubación, se añadieron 80 µl del reactivo de fijación del Ejemplo 1, formando una mezcla de muestra final.

La mezcla de muestra final se analizó en un citómetro FC500 MCL mediante mediciones de dispersión directa y dispersión lateral y mediciones de fluorescencia a 525 nm (FL1) y a 675 nm (FL4). Las Figs. 1A a 1C muestran los diagramas de dispersión obtenidos de dispersión directa (FS) frente a dispersión lateral (SS), FS frente a FL1 y FL1 frente a FL4, respectivamente.

En la Fig. 1A, la región A contenía los glóbulos rojos de la muestra de sangre y los análogos de glóbulos rojos del control de referencia marcado, que se seleccionan en este diagrama de dispersión para un posterior análisis diferencial utilizando fluorescencia como se muestra en las Figs. 1B y 1C. Las poblaciones fuera de la región A eran glóbulos blancos y plaquetas. En la Fig. 1B, la región B contenía los glóbulos rojos maduros de la muestra de sangre; la región C contenía reticulocitos de la muestra de sangre marcados con naranja de acridina; y la región D contenía los análogos de glóbulos rojos del control de referencia marcado marcados con CFSE. En la Fig. 1C, la región F contenía los glóbulos rojos maduros de la muestra de sangre, la región G contenía los reticulocitos de la muestra de sangre, y la región E contenía los análogos de glóbulos rojos del control de referencia marcado.

La hemoglobina celular media de la muestra (que tiene correlación con la MCH) se obtuvo a partir del promedio de los valores de dispersión lateral (SS) de glóbulos rojos individuales medidos con el citómetro FC500 MCL. El contenido de HbA1 de la muestra de sangre se obtuvo a partir del promedio de señales de fluorescencia de los glóbulos rojos individuales a 675 nm (FL4), tras la substracción de un valor de fondo de fluorescencia. El valor de fondo de fluorescencia se obtuvo analizando muestras de sangre utilizando el procedimiento analítico anteriormente descrito, en ausencia del anticuerpo HbA1c y en presencia de un anticuerpo monoclonal de control isotípico no específico (IgG1) que estaba covalentemente conjugado a Alexa Fluor 647. El porcentaje de HbA1c de la muestra de sangre se obtuvo a partir de los valores medios de FL4/SS de todos los glóbulos rojos medidos de una muestra de sangre, que es un valor medio o promedio de porcentaje de HbA1c celular de los glóbulos rojos.

Ejemplo 4 Estabilidad del control de referencia después de descongelar

Se preparó un control de referencia marcado utilizando sangre entera de un paciente diabético y con el proceso de preparación descrito en el Ejemplo 2. Este control de referencia marcado se añadió a una muestra de sangre entera normal, como control interno, y la muestra de sangre se analizó utilizando el procedimiento de ensayo descrito en el Ejemplo 3.

Los ensayos se realizaron inmediatamente después de la descongelación de un vial de suspensión análoga congelada 1,5 horas, 2,5 horas y 20 horas después de descongelar, respectivamente. En los intervalos de tiempo entre las pruebas analíticas, la muestra de sangre y el control de referencia marcado se mantuvieron a temperatura ambiente antes de añadir el control de referencia marcado a la muestra de sangre. Los ajustes del citómetro se mantuvieron constantes durante este experimento.

Los análisis de las señales de dispersión lateral y las señales de FL4 de los glóbulos rojos de la muestra de sangre y de los análogos del control de referencia se llevaron a cabo por separado. Más concretamente, los glóbulos rojos maduros y los reticulocitos de la muestra de sangre y de los análogos de glóbulos rojos del control de referencia se diferenciaron primero por los diagramas de dispersión FS frente a FL1 como se ilustra en la Fig. 1B. Tras la diferenciación, se obtuvieron los diagramas de dispersión celular para cada una de dichas poblaciones. Las señales de FL4 de los glóbulos rojos maduros, reticulocitos y análogos se obtuvieron a partir de los diagramas de dispersión de FL1 frente a FL4 como se ilustra en la Fig. 1C.

Las Figs. 2A y 2B muestran, respectivamente, las señales de dispersión lateral promedio y las señales FL4 promedio frente al tiempo después de descongelar el control de referencia marcado. Las curvas designadas por la letra A se obtuvieron a partir de los glóbulos rojos de la muestra de sangre y las curvas designadas por la letra B se obtuvieron a partir de los análogos de glóbulos rojos del control de referencia marcado. En las Figs. 2A y 2B el tiempo cero es el momento de finalización de la descongelación.

Como puede observarse, las señales de dispersión lateral promedio de los glóbulos rojos de la muestra y de los análogos de glóbulos rojos del control de referencia marcado permanecieron estables al cabo de 20 horas, lo que indica que el contenido de hemoglobina de los análogos se mantuvo estable tras la descongelación. Por otra parte, se observó una pequeña disminución de las señales de FL4 en las dos primeras horas posteriores a la descongelación, lo que indicaba una pequeña disminución de la cantidad de antígeno de HbA1c tanto en los glóbulos rojos de la muestra de sangre como de los análogos del control de referencia. Sin embargo, tras la disminución inicial, las señales FL4 de los análogos de glóbulos rojos permanecieron estables en el transcurso de 20 horas. Como puede observarse, las señales FL4 de los análogos eran ligeramente más estables que las de los glóbulos rojos de la muestra de sangre.

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1. Se sustrajo una fracción de 13,3% de las señales FL1 generados por naranja de acridina y/o CFSE de las señales FL4 de anticuerpo anti-HbA1c-Alexa Fluor 647 para compensar el efecto de propagación de FL1 a FL4. Esta es una compensación FL1-FL4, utilizada habitualmente en mediciones de fluorescencia multicolor en citómetros de flujo.

5 2. Se substrajo un valor de fondo de fluorescencia, obtenido como se describe en el Ejemplo 3 de los valores de FL4 resultantes.

3. El valor de FL4 corregido de un glóbulo rojo obtenido tras las etapas 1 y 2 que representaban el contenido de HbA1c celular del glóbulo rojo se dividió por el valor de dispersión lateral (SS), que reflejaba la hemoglobina celular del

10 glóbulo rojo, para obtener FL4/SS para cada glóbulo rojo. El promedio de los valores de FL4/SS de todos los glóbulos rojos medidos de una muestra de sangre era el promedio de los porcentajes de HbA1c celular de la muestra, que tenían una correlación con el porcentaje de HbA1c de la misma muestra de sangre obtenida del laboratorio de referencia.

4. Para normalizar los valores de FL4/SS y llevarlos al intervalo de porcentaje de HbA1c podría utilizarse el

15 promedio de los valores de porcentaje de HbA1c de los tres métodos de referencia (ver Tabla 1A). Esto se llevó a cabo cuando debía asignarse un valor de referencia del control de referencia marcado. Para una muestra de sangre para analizar, los valores de FL4/SS podrían normalizarse utilizando el valor de referencia del control de referencia marcado (ver la Tabla 1B). La Fig. 5A muestra la correlación de los valores de FL4/SS normalizados con los valores de porcentaje de HbA1c de las mismas muestras de sangre obtenidas del laboratorio de

20 referencia. Cabe observar que en las Tablas 1A y 1B el valor FL4/SS de la muestra de sangre del control de referencia es el promedio de los valores FL4/SS de todas las células medidas o los análogos de glóbulos rojos.

5. Como se muestra en la Fig. 5, había una ligera correlación no lineal de los valores FL4/SS con los resultados del laboratorio de referencia en el extremo superior, lo cual se cree que fue debido al impedimento

25 estérico entre las moléculas de anticuerpos conjugados dentro de las células y que dependía de la densidad de antígenos en las células. Para corregir esta débil correlación no lineal en el extremo superior, los valores FL4/SS normalizados se sometieron a la siguiente transformación:

Valor FL4/SS transformado = e0,157 x valor FL4/SS normalizado + 1

30 Esta fórmula fue válida en el intervalo de valores FL4/SS de aproximadamente 3 a 15.

Para la transformación inversa se utilizó la siguiente fórmula:

35 Valor FL4/SS normalizado = (LN(valor FL4/SS transformado)-1)/0,157

Debe entenderse que las fórmulas anteriormente descritas se adaptaron a los datos de porcentaje de HbA1c estandarizados según NGSP. La transformación anterior se desarrolló empíricamente y proporcionó una mejor correlación lineal con los valores de HbA1c del laboratorio de referencia (ver Figs. 5A y 5B). Las diversas

40 transformaciones matemáticas de los datos correspondientes al citómetro de flujo pueden usarse para proporcionar una correlación lineal con los datos del laboratorio de referencia. Preferiblemente, se utilizó una fórmula exponencial simple anteriormente mostrada puesto que resultaba sencillo realizar la transformación directa o inversa de los datos como se describe en la presente memoria.

45 Los símbolos utilizados en los cálculos anteriormente descritos se resumen en las Tablas 1A y 1B.

Tabla 1A. Asignación de un valor de referencia de porcentaje de HbA1c al control de referencia marcado utilizando muestras de sangre con valores de porcentaje de HbA1c conocidos.

Parámetros: Símbolos

Valor de FL4/SS corregido de la muestra de sangre: a

Valor de FL4/SS corregido del control de referencia marcado: b

Porcentaje de HbA1c de las muestras de sangre del laboratorio de referencia: c

Valor de FL4/SS normalizado del control de referencia marcado: d = b*c transformación inversa

Valor de referencia asignado de porcentaje de HbA1c del control de referencia marcado: e = d transformado

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Además, tomando la primera serie como referencia y calculando los datos de la segunda y tercera serie con o sin utilizar el control de referencia marcado como control interno, se obtuvieron las relaciones del promedio de los valores de porcentaje de HbA1c obtenidos a los valores del laboratorio de referencia, las cuales se muestran en la Tabla 4.

Tabla 3. Promedio de porcentajes de HbA1c de las tres series de muestras de sangre

Series: Promedio sin el control interno Promedio con el control interno Valores del laboratorio de referencia

1: 7,09 7,14 7,13

2: 7,05 7,91 8,05

3: 8,10 7,89 7,85

Tabla 4.

Series: Relación sin el control interno Relación con el control interno

1: 1,0 1,0

2: 0,88 0,98

3: 1,03 1,01

10 Además, la desviación estándar de los resultados de las tres series sin el control interno fue de 0,079, mientras que la desviación estándar de los resultados de las tres series con el control interno fue de 0,015.

Ejemplo 8 Corrección de la variación intraanalítica en la medición del porcentaje de HbA1c utilizando el control de 15 referencia

Para analizar la variación intraanalítica, se analizaron los datos obtenidos de las tres series de muestras de sangre del Ejemplo 7.

20 Los porcentajes de HbA1c obtenidos utilizando el presente método, utilizando y sin utilizar el control de referencia marcado como control interno se representaron frente a los porcentajes de HbA1c proporcionados por el laboratorio de referencia, como se muestra en las Figs. 6A y 6F. Las Figs. 6A y 6b muestran las curvas de correlación de la primera serie de muestras de sangre. Las Figs. 6C y 6D, y las Figs. 6E y 6F muestran, respectivamente, las curvas de correlación de las segundas y terceras series. Entre ellas, las Figs. 6A, 6C y 6E muestran las curvas de correlación de los porcentajes de

25 HbA1c obtenidos utilizando el presente método sin utilizar el control interno. Las Figs. 6B, 6D y 6F muestran las curvas de correlación de los porcentajes de HbA1c obtenidos utilizando el presente método utilizando el control interno.

Para cada experimento se representó desde el origen la línea recta mejor ajustada. El coeficiente de correlación (r2) y la pendiente (y) de las curvas de correlación se muestran en la Tabla 5. El punto de corte (x) es cero. 30 Tabla 5.

Series: r2 r2 y y

Sin el control interno: Con el control interno Sin el control interno Con el control interno

1: 0,9469 0,9609 0,9872 0,9972

2: 0,8075 0,9661 0,8589 0,9796

3: 0,8662 0,9275 1,0270 1,0026

Los resultados muestran que los porcentajes de HbA1c de las muestras de sangre obtenidas utilizando el método de

35 la presente invención con el control de referencia marcado como control interno tienen una correlación con los resultados obtenidos de métodos de referencia existentes sustancialmente mayor que los obtenidos sin utilizar el control interno. Por lo tanto, el uso del control interno de la presente invención mejora la consistencia intraanalítica.

Claims

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