CN113966737B - 一种体外分析检测用细胞保存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物保存液技术领域，具体涉及一种体外分析检测用细胞保存液及其制备方法。所述细胞保存液包括如下浓度范围的组分：细胞固定剂60‑75v/v%、渗透压调节剂0.6‑0.9g/100mL、抗凝剂0.2‑0.5g/100mL、壳聚糖季铵盐0.3‑0.6g/100mL、海藻糖0.05‑0.2g/100mL；溶剂为超纯水，pH为7.0‑7.6。其将少量的海藻糖与壳聚糖季铵盐合用，可有效增强保护作用，有效减少细胞发生自溶腐败，提高细胞保存的完整性。该细胞保存液在制备时，使用超纯水先将细胞固化剂以外的组分溶解，能有效提高组分的溶解效果，获得均一稳定的细胞保存液，便于细胞保存液的批量生产。

Description

一种体外分析检测用细胞保存液及其制备方法

技术领域

本申请涉及生物保存液技术领域，具体涉及一种体外分析检测用细胞保存液及其制备方法。

背景技术

对于如口腔、鼻咽、肛门等非血液途径获取的细胞，如何维持细胞活性是一项极大的挑战，在短时间内保存细胞并在临床上应用时，往往使用生理盐水来维持细胞活性，然而细胞在生理盐水中活性降低的速度较快，10小时之内细胞的活性丧失率可达30%甚至更高，然而许多对细胞的观察测试从取样到应用可能需要超过10小时、24小时，甚至多达数天，生理盐水无法满足需求。

为了解决这一问题，各类细胞保存液应运而生。细胞保存液是一种能够帮助细胞保持原有形态、结构的一种化学药品，其功能是减小细胞死亡后的变化，阻止其自溶腐败，尽量保持生长状态结构，同时使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其生前的形态。

目前市场上有许多不同种类的细胞保存液，不同的厂商拥有自己的保存液配方。然而，市面上的细胞保存液在保存细胞过程中，细胞仍会发生一定的自溶腐败，使得细胞保存的完整性较差。

发明内容

为了减少细胞在保存过程中发生自溶腐败，本申请提供一种体外分析检测用细胞保存液及其制备方法。

第一方面，本申请提供一种体外分析检测用细胞保存液，采用如下的技术方案：

一种体外分析检测用细胞保存液，包括如下浓度范围的组分：细胞固定剂60-75v/v%、渗透压调节剂0.6-0.9g/100mL、抗凝剂0.2-0.5g/100mL、壳聚糖季铵盐0.3-0.6g/100mL、海藻糖0.05-0.2g/100mL；溶剂为超纯水，pH为7.0-7.6。

通过采用上述技术方案，本申请中细胞固定剂能固定细胞、病毒等结构，保存细胞、病毒等结构的形态并避免细胞内蛋白酶的裂解作用及核酸消化酶对核酸的消化作用，保存蛋白及核酸完整性以便后续分析；渗透压调节剂可用于调节细胞保存液的渗透压，能最大限度地保持细胞的形态完整，使之充分悬浮剂分散；抗凝剂用于螯合溶液中引入的重金属离子，防止细胞凝聚；壳聚糖季铵盐能固定细胞，具有良好的抗菌性；海藻糖是一种非还原性双糖，具有非常稳定的理化作用，对细胞无任何毒副作用，能够有效稳定细胞膜和蛋白质结构。

其中，本申请将少量的海藻糖与壳聚糖季铵盐合用，可有效增强保护作用，即便不额外添加防腐剂、灭菌剂等助剂，亦具有良好的杀菌效果，能快速灭活病毒或其他病原体以阻止其影响细胞活性；此外因海藻糖能在高渗透压等恶劣环境下在细胞表面形成独特的保护膜，有效保护细胞结构不被破坏，进而能有效减少细胞发生自溶腐败，有助于提高细胞保存的完整性。

优选的，所述壳聚糖季铵盐与所述海藻糖的重量浓度比为3:1。

通过采用上述技术方案，当壳聚糖季铵盐与海藻糖的重量浓度比为3:1时，其配制的细胞保存液对细胞的保存效果明显优于其他配比，因此将其作为进一步优选。

优选的，所述细胞固定剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或多种的混合物。

优选的，所述细胞固定剂为乙醇。

通过采用上述技术方案，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇对细胞的渗透性强，其均能对细胞进行快速固定；虽然从细胞脱水作用及蛋白质凝固作用来看，甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇的效果依次减弱，但在本申请的细胞保存液体系中，采用甲醇反而会使细胞膜的通透性增加导致细胞自溶腐败，因此本申请优选乙醇为细胞固定剂。

优选的，所述渗透压调节剂为氯化钠与氯化钾的混合物。

优选的，所述氯化钠和氯化钾的重量浓度比为9:1。

通过采用上述技术方案，氯化钠和氯化钾中的钠离子和钾离子能较好的穿过细胞膜，进而实现细胞内外渗透压的调节；当氯化钠和氯化钾的重量浓度比为9:1时，其获得的细胞保存液具有更为优异的保存效果，因此将其作为进一步的优选。

优选的，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钾、肝素钠中至少一种。

优选的，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠。

通过采用上述技术方案，乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钾以及肝素钠均能较好地螯合溶液中引入的重金属离子，防止细胞凝聚；其中乙二胺四乙酸二钠在本申请体系中不但具有良好的金属螯合作用，还能有效防止细胞发生腐败，因此将其作为进一步的优选。

第二方面，本申请提供一种体外分析检测用细胞保存液的制备方法，采用如下的技术方案：

一种体外分析检测用细胞保存液的制备方法，用于制备如权利要求1-9任一项所述的细胞保存液，每制备100mL所述细胞保存液包括以下步骤：

①、取适量超纯水，加入设定量的渗透压调节剂、抗凝剂、壳聚糖季铵盐和海藻糖，搅拌至完全溶解，得到初混液；

②、往步骤①得到的初混液中加入设定量的细胞固定剂，混匀后用超纯水定容至100mL，得到终混液；

③、将步骤②得到的终混液经灭菌工序后分装，制得所述细胞保存液。

通过采用上述技术方案，因渗透压调节剂、抗凝剂、壳聚糖季铵盐和海藻糖在醇及一般有机溶剂，本申请使用超纯水先将细胞固化剂以外的组分溶解，能有效提高各组分的溶解效果，获得均一稳定的细胞保存液；本申请的制备方法简单，便于细胞保存液的批量生产。

优选的，步骤②中，所述终混液在定容前用0.2M磷酸缓冲液调节pH至7.0-7.6。

通过采用上述技术方案，本申请中使用磷酸缓冲液来调节初混液的pH，其引入的离子不会影响细胞保存液中原有的离子的浓度，进而保证细胞保存液优良的保存效果。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请的细胞保存液将少量的海藻糖与壳聚糖季铵盐合用，可有效增强保护作用，具有良好的杀菌效果，同时能有效减少细胞发生自溶腐败，有助于提高细胞保存的完整性。

2、本申请在制备细胞保存液时，使用超纯水先将细胞固化剂以外的组分溶解，能有效提高组分的溶解效果，获得均一稳定的细胞保存液，便于细胞保存液的批量生产。

具体实施方式

以下结合实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。本申请的使用的试剂均为市售产品，采用分析纯。

实施例

实施例1

一种体外分析检测用细胞保存液，包括如下浓度范围的组分：甲醇60v/v%、氯化钠0.54g/100mL、氯化钾0.06g/100mL、乙二胺四乙酸二钠（下文简称为EDTA-2Na）0.2g/100mL、壳聚糖季铵盐（取代度90%）0.3g/100mL、海藻糖0.1g/100mL；溶剂为超纯水，pH为7.0。

制备上述细胞保存液100mL，包括以下步骤：

①、取20mL超纯水，依次加入氯化钠0.54g、氯化钾0.06g、乙二胺四乙酸二钠0.1g、壳聚糖季铵盐（取代度90%）0.3g和海藻糖0.1g，搅拌至完全溶解，得到初混液；

②、往步骤①得到的初混液中加入95%乙醇63.2mL（乙醇约含量为60mL），混匀后用0.2M磷酸缓冲液（为0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄以体积比1:17.87混合配制而成）调节溶液的pH为7.0-7.6，在上述pH范围内制得的细胞保存液的性能差异较小，本申请具体调节pH至7.0，再用超纯水定容至100mL，得到终混液；

③、将步骤②得到的终混液经灭菌工序后分装，制得所述细胞保存液。

实施例2-6

实施例2-6在实施例1的方法基础上，对组分浓度进行调整，具体调整情况参见下表一。其中，实施例5中将海藻糖的组分浓度调整为0.05g/mL，使得壳聚糖季铵与盐海藻糖的重量浓度比为6:1。

实施例7-8

实施例7-8在实施例1的方法基础上，对细胞固定剂的种类进行调整，具体调整情况参见下表一。

实施例9-11

实施例9-11在实施例1的方法基础上，对渗透压调节剂的种类及浓度进行调整，具体调整情况参见下表一。

实施例12-13

实施例12-13在实施例1的方法基础上，对抗凝剂的种类进行调整，具体调整情况参见下表一。

表一实施例1-13的组分参数表（100mL细胞保存液）

实施例14

实施例14在实施例1的方法基础上，用0.05M磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（为0.2mol/L的NaH₂PO₄和mol/L的NaOH以体积比5:4.68混合配制而成）调节终混液的pH为7.0。

对比例

对比例1

本对比例在实施例1的方法基础上，未添加壳聚糖季铵盐。

对比例2

本对比例在实施例1的方法基础上，未添加海藻糖。

对比例3

市售的细胞保存液，具体购自凯璟生物，沪松械备20200007号。

对比例4

市售的细胞保存液，具体购自孝感奥华医疗，鄂孝械备20150025号。

性能检测试验

将实施例1-14和对比例1-4的细胞保存液应用于口腔细胞的保存中。利用同样的取样拭子取5名志愿者的口腔细胞作为五组平衡试验，然后将取样拭子在细胞保存液搅均后取出，保证细胞保存液中的细胞浓度在3×10⁶-3×10⁷个/mL的范围内，将细胞保存液置于4℃环境中静置密封保存，进行如下性能测试，检测结果参见下表二。

（1）、细胞完整性：在细胞保存7天和15天后分别取出细胞，用台盼蓝染色，用显微镜观察细胞形态。

（2）、细胞自溶腐败情况：用细胞存活率进行表示。在细胞保存48h、96h、144h后分别取出细胞，用台盼蓝染色，在显微镜下计数观察存活细胞的数量。

（3）、细胞保存时间：用台盼蓝染色，在显微镜下计数观察存活细胞的数量，记录当细胞存活率≤60%时最短用时。

表二实施例1-13以及对比例1-4的检测结果

结合表2，将实施例1-14与对比例1-4的检测结果进行对比，可以得到，本申请细胞保存液保存的细胞完整性更好、在保存一段时间后仍具有较高的存活率，细胞保存时间较长。

将实施例1、5-6以及对比例1-2的检测结果进行对比，可以得到，本申请将少量的海藻糖与壳聚糖季铵盐合用，可有效增强保护作用，有效保护细胞结构不被破坏，进而能有效减少细胞发生自溶腐败，有助于提高细胞保存的完整性，且具有更长的保存时间。其中，当壳聚糖季铵盐与海藻糖的重量浓度比为3:1时，其配制的细胞保存液对细胞的保存效果明显优于其他配比，因此将其作为进一步优选。

将实施例1与实施例7-8的检测结果进行对比，可以得到，本申请选用乙醇作为细胞固定剂能更好的保持细胞完整性，同时在一定程度能提高细胞的存活率和保存时间。

将实施例1与实施例9-11的检测结果进行对比，可以得到，本申请的渗透压调节剂中，氯化钠和氯化钾中的钠离子和钾离子能较好的穿过细胞膜，进而实现细胞内外渗透压的调节；当氯化钠和氯化钾的重量浓度比为9:1时，其获得的细胞保存液具有更为优异的细胞存活率，细胞保存周期也更长，因此将其作为进一步的优选。

将实施例1与实施例12-13的检测结果进行对比，可以得到，本申请的抗凝剂中，相对于乙二胺四乙酸、肝素钠等其他抗凝剂，乙二胺四乙酸二钠在本申请体系中不但具有良好的金属螯合作用，还能有效提高细胞存活率，防止细胞发生腐败，因此将其作为进一步的优选。

将实施例1与实施例14的检测结果进行对比，可以得到，本申请中使用磷酸缓冲液来调节初混液的pH，其引入的离子不会影响细胞保存液中原有的离子的浓度，进而获得的细胞保存液具有更为高的细胞存活率，减少细胞在保过程中发生自溶腐败。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (2)

1.一种体外分析检测用细胞保存液，其特征在于，包括如下浓度范围的组分：乙醇60-75v/v%、渗透压调节剂0.6-0.9g/100mL、抗凝剂0.2-0.5g/100mL、壳聚糖季铵盐0.3-0.6g/100mL、海藻糖0.05-0.2g/100mL；溶剂为超纯水；所述壳聚糖季铵盐与所述海藻糖的重量浓度比为3:1；所述渗透压调节剂为氯化钠与氯化钾的混合物，所述氯化钠和氯化钾的重量浓度比为9:1；所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠；用0.2M磷酸缓冲液调节pH至7.0-7.6。

2.一种体外分析检测用细胞保存液的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1所述的细胞保存液，每制备100mL所述细胞保存液包括以下步骤：

①、取适量超纯水，加入设定量的渗透压调节剂、抗凝剂、壳聚糖季铵盐和海藻糖，搅拌至完全溶解，得到初混液；

②、往步骤①得到的初混液中加入设定量的乙醇，混匀后用超纯水定容至100mL，得到终混液，所述终混液在定容前用0.2M磷酸缓冲液调节pH至7.0-7.6；

③、将步骤②得到的终混液经灭菌工序后分装，制得所述细胞保存液。