CN112851786B - 可溶性的Aβ1-42变体、Aβ1-42校准品及试剂盒 - Google Patents

可溶性的Aβ1-42变体、Aβ1-42校准品及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可溶性的Aβ1‑42变体、Aβ1‑42校准品及试剂盒。该可溶性的Aβ1‑42变体包含用亚氨基酸修饰野生型Aβ1‑42蛋白中一个或多个位点的序列。由于亚氨基酸上的亚氨基在与其他氨基酸的羧基脱水缩合形成肽键后，不再存在‑N‑H‑结构，无法与肽链上的C＝O形成氢键，从而抑制β片层的形成，提高Aβ1‑42蛋白在溶液中的稳定性。

Description

可溶性的Aβ1-42变体、Aβ1-42校准品及试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，具体而言，涉及一种可溶性β淀粉样蛋白及其应用。
背景技术
β片层结构又称β折叠或β转角，是蛋白质的一种二级结构，两条以上氨基酸链(肽链)，或同一条肽链之间的不同部分可形成平行或反平行排列，肽平面之间呈手风琴状折叠，成为“股”，股与股之间会通过氢键固定，这种结构称之为β折叠。在β折叠中，所有的肽键都参与链间氢键的形成，蛋白质相邻肽链主链的-N-H-和C＝O之间形成有规则的氢键，氢键与β折叠的长轴呈垂直关系并维持着β结构的稳定。
部分蛋白质，尤其是与神经系统相关的蛋白质如β淀粉样蛋白(Aβ)、α-突触核蛋白等，由于其分子内存在高度疏水区域，且易形成β片层结构，容易发生团聚，形成聚集体，影响其稳定性。
Aβ是由淀粉样蛋白前体(amyloidprecursorprotein，APP)经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的39-43个氨基酸的片段。在大脑皮层和海马发生β淀粉样蛋白的沉积是阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)的病理特征之一。AD患者由于遗传或其他因素，引起β淀粉样蛋白产生增多或清除减少，β淀粉样蛋白积累形成寡聚体，引起微妙的突触损伤、胶质细胞活化、炎症、氧化应激和Tau蛋白过磷酸化等病理变化，导致广泛的突触功能异常和选择性的神经元死亡，使得患者产生认知功能障碍。
Aβ的主要组分是Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43，其相对分子质量约为4kDa，其中Aβ1-42具有更强的疏水性、聚集性和神经毒性。Aβ1-42寡聚体在AD患者脑中的含量是正常人群的数十倍，细胞外不可溶的Aβ沉淀和淀粉样斑块在AD患者大脑中大量存在，而可溶的Aβ1-42在AD患者脑脊液中的浓度比在正常人脑脊液中的明显减低，通过血脑屏障进入血清中的Aβ1-42含量更是远远低于在脑脊液中含量，因此Aβ1-42具有重要的研究价值。但Aβ1-42易聚集的特点，易造成蛋白的抗原表位被遮蔽，在溶液中稳定性差，限制了Aβ1-42蛋白的单体研究和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溶性的Aβ1-42，以解决其在液体环境中容易团聚而不稳定的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了可溶性的Aβ1-42变体，其包含野生型β淀粉样蛋白的经修饰的氨基酸序列，其特征在于，用亚氨基酸修饰野生型Aβ1-42，其中修饰位点包含野生型Aβ1-42中的一个或多个位点。
进一步的，亚氨基酸选自脯氨酸和/或羟脯氨酸。
进一步的，修饰位点包含野生型Aβ1-42中的第17-21或第29-36区段中的一个或者多个位点；优选的，所述的修饰位点包含野生型Aβ1-42中的第17-21或第29-36区段中的至少两个位点；更优选的，修饰位点在野生型Aβ1-42的第17-21区段中包含至少一个修饰，并且在第29-36区段中包含至少一个修饰。
进一步的，修饰方式包括替换和/或插入；优选的，所述的修饰为替换。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种Aβ1-42校准品，其包含权利要求上述的一种可溶性Aβ1-42变体的氨基酸序列。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种Aβ1-42检测试剂盒，其包含上述的一种蛋白校准品。
应用本发明的技术方案，通过亚氨基酸修饰野生型Aβ1-42，其中修饰位点包含野生型Aβ1-42中的一个或多个位点，亚氨基酸上的亚氨基在与其他氨基酸的羧基脱水缩合形成肽键以后，不再存在-NH-结构，无法与肽链上的C＝O形成氢键，抑制β片层的形成，提高Aβ1-42蛋白在溶液中的稳定性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的对比例1，实施例2、5、11、14、15、16的蛋白校准品在37℃下经硫磺素ThT荧光强度检测的稳定性结果图；以及
图2示出了根据本发明的对比例1，实施例2、5、11、14、15、16的蛋白校准品在2～8℃下经硫磺素ThT荧光强度检测稳定性结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
野生型Aβ1-42是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有42个氨基酸的多肽，在溶液中易形成β片层而产生团聚现象。
本文所述的“野生型Aβ1-42”的氨基酸序列是已知的，如SEQ ID No：1所示。该蛋白的获取方式不限，可以从生物组织中提取，也可以通过基因工程的方式获得，也可以是通过化学合成的方式获得。当野生型Aβ1-42以单体的形式存在时，第17-21氨基酸残基与第29-36氨基酸残基之间会通过肽链主链上的C＝O和-N-H-形成氢键并形成发卡结构。而野生型Aβ1-42之间会通过一个分子上的第37-42氨基酸残基与另一个分子上的第30-36氨基酸残基形成氢键，形成β片层结构，导致野生型Aβ1-42的聚集。
现有技术中针对野生型Aβ1-42由于存在分子间的氢键而容易发生团聚现象，从而致使蛋白的结构和性能发生改变。为了改善这一状况，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种可溶性的Aβ1-42，该淀粉样蛋白变体包含野生型Aβ1-42的经修饰的氨基酸序列。
进一步的，在本发明的一个优选实施方式中，提供了一种可溶性的淀粉样蛋白变体，该淀粉样蛋白变体包含野生型Aβ1-42的经修饰的氨基酸序列，其中修饰位点包含野生型Aβ1-42中的一个或者多个位点。
进一步的，采用亚氨基酸修饰野生型Aβ1-42氨基酸序列中的一个或多个位点，其中亚氨基酸选自脯氨酸或羟脯氨酸中的一种或者多种；由于亚氨基酸上的亚氨基在与其他氨基酸的羧基脱水缩合以后，不再存在-N-H-结构，无法与肽链上的C＝O形成氢键，从而抑制β片层的形成，抑制β淀粉样蛋白团聚；优选的，采用脯氨酸修饰野生型Aβ1-42中的一个或多个位点。
本文所述的“修饰位点”选自野生型Aβ1-42氨基酸序列中的第17-21位氨基酸或/和第29-36位氨基酸中的一个或者多个位点。其中通过对野生型Aβ1-42氨基酸序列中的第17-21位氨基酸中的一个或者多个位点修饰，可以破坏Aβ1-42分子内部的发卡结构，以达到抑制Aβ1-42的聚集的效果；或者通过对野生型Aβ1-42氨基酸序列中的第29-36位氨基酸中的一个或者多个位点的修饰，不仅可以破坏Aβ1-42分子内部的发卡结构，还能够抑制分子间形成氢键，从而有效的抑制Aβ1-42的聚集现象；在某些实施例中，在野生型Aβ1-42氨基酸序列中的第17-21位氨基酸中选择一个或者多个位点进行修饰；在某些实施方式中，在野生型Aβ1-42氨基酸序列中的第29-36位氨基酸中选择一个或者多个位点进行修饰；在某些实施例中，在野生型Aβ1-42氨基酸序列中的第17-21位氨基酸和第29-36位氨基酸中分别至少选择一个位点进行修饰；优选的，在野生型Aβ1-42氨基酸序列中的第17-21位氨基酸和第29-36位氨基酸中分别选择一个位点进行修饰。
本文所述的“修饰”的方式可以包括插入、替换或者两种方法同时使用。进一步的，采用亚氨基酸插入或/和替换野生型β淀粉样蛋白氨基酸序列中的一个或多个位点。在某些实施方式中，在Aβ1-42的氨基酸序列中选择一个或者多个位点进行替换；优选的，在Aβ1-42中的氨基酸序列中选择两个位点进行替换。在某些实施例中，考虑到在氨基酸序列中插入过多氨基酸，容易导致分子性质的发生巨大的变化，因此，当选择插入的方式对野生型Aβ1-42的氨基酸序列进行修饰时，优选的，只在氨基酸序列中增加一个氨基酸。
本申请上述可溶性Aβ1-42能够有效的抑制其聚集现象，因而，任何按照本申请的改进方法而获得的可溶性Aβ1-42的氨基酸序列均在本申请的保护范围内。在某些优选实施例中，可溶性Aβ1-42选自氨基酸序列SEQ ID No:2-17中的一个。
在本发明的第二种典型的实施方式中，提供了一种Aβ1-42校准品，该校准品包含a)一种可溶性Aβ1-42，b)储存液；可溶性Aβ1-42变体为前述的任意一种氨基酸序列，储存液中至少包含一种蛋白缓冲液，该校准品能够在一定期限内(一般为12个月)不发生聚集现象，保持蛋白在溶液中的稳定性。在某些实施例中，Aβ1-42校准品还可以包括BSA、防腐剂及电解质中的任意一种或多种，以增强该基础稀释液对蛋白的存储稳定效果。上述各成分的在蛋白缓冲液中的具体浓度及含量可以根据实际需要进行合理调整和设置。在一些优选的实施例中，储存液中还含有BSA，优选BSA的浓度为2～5g/L。在另一些优选的实施例中，储存液含有防腐剂，防腐剂可以为ProClin 300或叠氮钠中的一种，更优选地，防腐剂的浓度为0.1～0.5g/L。在某些优选的实施例中，上述储存液中还可以同时含有电解质。具体地，电解质可以为氯化钾、氯化钠、氯化镁及乙酸钠中的一种；更优选地，电解质的浓度为5～30g/L。
为方便检测，在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括蛋白校准品，该蛋白校准品为上述蛋白校准品。该试剂盒可用于定量检测样品中Aβ1-42的含量，且一定期限内(一般为12个月)的定量检测的结果保持一致性。具体的检测分析方法并不特别限定，优选的，可以采用免疫分析法进行定量检测；更优选的，可以采用化学发光免疫分析法进行定量检测。采用免疫分析法时，具体的检测原理也不特别限定，可以是夹心法，也可以是竞争法、也可以是捕获法、也可以是间接法。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种检测Aβ1-42校准品稳定性的方法，该方法包括：将上述Aβ1-42校准品与硫磺素T混合后进行荧光检测，或者通过检测标记物与将上述Aβ1-42校准直接或间接地结合来进行免疫检测，其中，检测标记物带有可检测标记。
上述方法中，将上述Aβ1-42校准品与硫磺素T混合后进行荧光检测的原理如下：ThT是一种硫磺色素，是一种苯并噻唑类的小分子化合物，能够与β折叠结构特异性结合，β折叠结构本身是没有荧光的，与ThT特异性结合之后能发出极强荧光，因而能指示β折叠结构的存在，β折叠结构越多，其荧光强度越高。比如，当Aβ1-42蛋白聚集时，其β折叠结构变多，荧光强度增加。
在一种具体的实施例中，上述荧光检测的方法为：取30μL样品(Aβ1-42的含量为10ng/mL)混合30μL ThT溶液，ThT的终浓度为1μmol/L，采用多功能酶标仪检测，其中检测参数设置为激发光440nm/发射光490nm检测并记录数据。
上述方法中，利用免疫检测原理可以对Aβ1-42溶液中的蛋白的效价进行检测。其表征的是溶液中具有特定功能的有效蛋白质的量(例如具有免疫反应性的蛋白的量，蛋白聚集后，蛋白的抗原表位被遮蔽，使其在免疫检测中表现效价降低)。
上述的免疫检测的具体方法不做特别的限定，常见的可以是夹心法、间接法、竞争法、捕获法。溶液中具有特定功能的有效蛋白质的量可以通过检测标记物所携带的检测标记进行表征；优选地，检测标记物为发光标记物；更优选的，检测标记物为鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；免疫检测中还包含带有可检测信号的抗体或带有可检测信号的抗原。根据选择的具体检测原理的不同，可检测信号可以标记在与可识别目的蛋白的抗体上，也可以标记在抗原上。
优选的，上述免疫检测可以通过样本分析仪进行检测。更优选地，发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在一种更优选的实施例中，效价检测方法为：利用深圳市新产业生物公司生产的Aβ1-42捕获抗体包被磁球，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)标记Aβ1-42检测抗体，制成检测试剂盒，利用其MAGLUMI免疫分析系统检测处理不同时间的发光强度。并计算偏差，偏差＝(某刻的光强度-初始光强度)/初始光强度*100％。偏差的绝对值越大，表明溶液中目的蛋白的含量减低，即表明目的蛋白不稳定。目的蛋白在37℃下保存一周内根据效价测试所测得的光强度偏差不超过40％；进一步的不超过30％；进一步的，不超过20％；进一步的不超过15％；更进一步的不超过10％。或者目的蛋白在2-8℃保存一年内根据效价测试所测得的发光强度偏差不超过35％；进一步的，不超过25％；进一步的，不超过15％；更进一步的不超过10％。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的实现方式及有益效果。
一、样品准备
野生型和可溶性Aβ1-42单体的制备：由AnaSpec New Corporate Headquarters公司基于PeptideSyn技术平台合成。将1mg Aβ1-42粉末溶于200μL冷却的六氟异丙醇(HFIP)中，室温孵育60min使Aβ1-42充分溶解，然后放置在冰上5～10min后移至通风橱内，打开瓶盖以便HFIP挥发。风干后形成透明的Aβ1-42，溶解于50μL二甲基亚矾(DMSO)后，制成Aβ1-42母液，再将该母液使用蛋白缓冲液(20mM PBS、0.5％BSA、0.15M NaCl、0.2％NaN3)稀释至10ng/mL。
表1：
Figure BDA0002269565540000051
Figure BDA0002269565540000061
二、性能检测方法
作为诊断试剂的校准品，诊断试剂的有效期一般设置为一年，因此考察2-8℃下的长期稳定性，同时考虑到试剂在运输过程中，环境温度并不会一直维持在2-8℃，因此设置一个高温加速稳定性实验。
A：高温加速稳定性检测过程：将各实施例与各对比例的目的蛋白(如Aβ1-42)的单体母液，分别添加到基础稀释液，使其终浓度为10ng/mL，将溶液存放于37℃，不同时间点取样，分别取第0天、第7天的含目的蛋白的溶液，进行效价检测。取第0天，第1天，第4天，第7天的含目的蛋白的溶液，进行ThT荧光检测和效价检测。
B：长期稳定性检测过程：
上述各实施例和各对比例溶液分别存放于2～8℃，在第0个月、第12个月取出，进行效价检测。在第0个月，第1个月，第7个月，第12个月取出，进行ThT荧光检测和效价检测。
具体的ThT荧光检测和效价检测方法如下：
1)硫磺素ThT荧光强度检测
检测方法：取30μL样品(Aβ1-42的含量为10ng/mL)混合30μL ThT溶液，ThT的终浓度为1μmol/L，采用多功能酶标仪检测，其中检测参数设置为激发光440nm/发射光490nm检测并记录数据。Aβ1-42蛋白与硫磺素T混合后进行荧光检测的原理如下：ThT是一种硫磺色素，是一种苯并噻唑类的小分子化合物，能够与β折叠结构特异性结合，β折叠结构本身是没有荧光的，与ThT特异性结合之后能发出极强荧光，因而能指示β折叠结构的存在，β折叠结构越多，其荧光强度越高。比如，当Aβ1-42蛋白聚集时，其β折叠结构变多，荧光强度增加。
2)效价检测
效价检测方法：将公司自产的Aβ1-42捕获抗体包被磁球，Aβ1-42检测抗体用ABEI标记，制成检测试剂，利用Maglumi系统检测发光强度，考察目的蛋白于2-8℃放置12个月或于37℃放置7天后光强度的偏差。该方法通过抗原抗体反应检测溶液中的目的蛋白单体含量，检测效价的降低，可以代表溶液中目的蛋白单体含量的降低，即该检测方法也能说明目的蛋白在溶液是否稳定。
偏差＝(某刻的光强度-初始光强度)/初始光强度*100％。
三、检测结果
(1)硫磺素ThT荧光强度检测
利用对比例1和实施例2、5、11、14、15、16对本申请的Aβ1-42蛋白聚集能力的影响进行了考察，通过硫磺素ThT荧光强度检测和效价检测来进行检测，检测结果见表2、图1和图2。
表2：
组别 对比例1 实施例2 实施例5 实施例11 实施例14 实施例15 实施例16
37℃放置 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度
第0天 120 119 125 126 110 122 123
第1天 591 257 264 139 117 248 245
第4天 943 523 424 143 120 434 441
第7天 1177 869 735 147 123 689 541
2-8℃放置 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度 荧光强度
第0月 129 116 122 120 112 109 110
第1月 542 249 251 129 116 238 244
第7月 846 542 451 134 121 424 453
第12月 1223 871 778 138 127 628 567
从表2、图1以及图2中可以看出，随着目的蛋白在37℃中放置7天和在2～8℃中放置12个月，对比例1中荧光强度明显增加，表明Aβ1-42蛋白发生了明显的聚集；实施例2、5中，随着温育时间的延长，相对荧光强度增加明显放缓，少量的目的蛋白发生了聚集，表明对Aβ1-42蛋白的17～21或第29～36区段内的氨基酸进行单个位点的脯氨酸替代能改善蛋白聚集的现象；实施例11、14中，其相对荧光强度基本不增加，即目的蛋白未发生明显聚集，表明对Aβ1-42蛋白的17～21与第29～36区段内的氨基酸进行两次亚氨基酸替代对改善蛋白聚集的效果更优；实施例15、16中，相对荧光强度增加也明显放缓，表明在Aβ1-42蛋白的17～21或第29～36区段插入亚氨基酸也能改善蛋白的聚集现象。
(2)效价测试
对所有对比例及实施例Aβ1-42蛋白进行了效价测试，RLU值可代表溶液中Aβ1-42蛋白单体的检测效价。
表3：
Figure BDA0002269565540000081
从表3中可以看出，相同浓度的野生型及突变型Aβ1-42蛋白在刚复溶至10ng/mL时的检测效价(RLU值)均有300万以上，即说明突变型Aβ1-42蛋白的检测效价基本不受影响。
由对比例1、实施例1-7可知，对Aβ1-42蛋白的第17～21或第29～36区段内的氨基酸进行单个位点的脯氨酸替代对蛋白的稳定性具有一定的改善。说明对Aβ1-42蛋白的第17～21或第29～36区段内的氨基酸进行脯氨酸替代能破坏目的蛋白分子内或分子间的β片层结构，抑制目的蛋白之间的聚集。
相比实施例1-7与实施例8-13可知，Aβ1-42蛋白的第17～21或第29～36区段内的氨基酸进行两次单个位点的脯氨酸突变可以更明显的改善蛋白稳定性，说明Aβ1-42蛋白的第17～21或第29～36区段内的氨基酸进行两次单个位点的脯氨酸突变对抑制团聚具有协同作用，能使Aβ1-42单体在溶液中更稳定的保存；
进一步比较实施例8-13可知，Aβ1-42蛋白的第17～21和第29～36两个区段内的氨基酸分别进行替换一个位点效果优于只在单一区段中选取替换位点，其中效果最好的是第19号氨基酸和32号氨基酸同时被脯氨酸替换，其次是第29～36单个区段内的氨基酸进行两个位点的脯氨酸突变，再其次是第17～21单个区段内的氨基酸进行两个位点的脯氨酸突变。
由实施例11和实施例14可知，实施例14对蛋白稳定性的改善效果与实施例11相当，说明亚氨基酸中的羟脯氨酸同脯氨酸一样具有抑制蛋白质形成β折叠的作用。
由实施例15和实施例16可知，在17～21或第29～36区段内插入一个脯氨酸也能改善Aβ1-42蛋白的稳定性，说明在Aβ1-42蛋白的17～21或第29～36区段内插入一个亚氨基酸同样具有抑制蛋白质形成β折叠的效果。
从实施例1-16及对比例1的检测结果及描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请所提供的可溶性Aβ1-42，通过采用亚氨基酸对野生型Aβ1-42氨基酸序列的第17～21和/或第29～36区段内进行一个或多个位点的替换/插入，能够有效的破坏蛋白质之间氢键的形成，抑制蛋白质之间的团聚，提高蛋白质长期保存的稳定性。而且同时在第17～21和/或第29～36区段内同时选取替换位点能够进一步抑制蛋白的团聚。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司
<120> 可溶性的Aβ1-42变体、Aβ1-42校准品及试剂盒
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> 野生型β淀粉样蛋白(野生型Aβ1-42)
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Pro Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Pro Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 4
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Pro Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Pro Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 6
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Pro
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Pro Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 8
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Pro Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 9
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Pro Val Phe Phe Pro Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Pro Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Pro Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 11
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Pro Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Pro Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Pro Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Pro
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Pro Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Pro Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 14
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Pro Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Pro Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 15
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (19)..(32)
<223> 位置19和32上的Xaa代表羟脯氨酸
<400> 15
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Xaa Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Xaa
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 16
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Pro Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile
20 25 30
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 17
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Pro
20 25 30
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40

Claims (4)

1.一种可溶性的Aβ1-42变体，其为经修饰的野生型Aβ1-42的氨基酸序列，其特征在于，所述修饰为，将第17位和第21位氨基酸替换为脯氨酸或羟脯氨酸，或将第29位和第36位氨基酸替换为脯氨酸或羟脯氨酸，所述野生型Aβ1-42的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.一种Aβ1-42校准品，其包含权利要求1中所述的可溶性Aβ1-42变体。
3.根据权利要求2所述的校准品，其特征在于，还包含蛋白缓冲液、BSA、防腐剂及电解质中的任意一种或多种。
4.一种Aβ1-42检测试剂盒，其包含权利要求2-3任一项 所述的Aβ1-42校准品。
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Analysis of the Secondary Structure of β-Amyloid (Aβ42) Fibrils by Systematic Proline Replacement;Akira Morimoto等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20041210;第279卷(第50期);第52784页图3 *
Mutations that Reduce Aggregation of the Alzheimer"s Aβ42 Peptide: an Unbiased Search for the Sequence Determinants of Aβ Amyloidogenesis;Christine Wurth等;《J.Mol.Biol.》;20020621;第319卷(第5期);1279-1290 *
Structural properties of Aβ protofibrils stabilized by a small molecule;Angela D.Williams等;《PNAS》;20050517;第102卷(第20期);第7118右栏最后一段至第7119页左栏第一段、图6 *

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