CN107602695B - 荧光抗体保存液、试剂盒及其用途和荧光保存抗体方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种荧光抗体保存液、试剂盒及其用途和保存荧光抗体方法。所述荧光抗体保存液包括明胶；半胱氨酸；庆大霉素；以及柠檬酸钠。本发明中的荧光抗体保存液能够长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温。

Description

荧光抗体保存液、试剂盒及其用途和荧光保存抗体方法
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及荧光抗体保存液、试剂盒及其用途和保存荧光抗体方法。
背景技术
荧光素是一种合成有机化合物，有着广泛的应用，例如在荧光抗体技术中用作荧光示踪物。即将荧光素作为示踪物与单克隆抗体或多克隆抗体结合，形成荧光标记抗体，对相应抗原进行检测已成为一项重要的检测技术。
荧光抗体试剂需要低温避光保存，对运输和存储的条件要求高，从而增加了试剂成本。这些缺点影响了荧光抗体试剂的商业化应用。
由此，有效保持荧光抗体的生物活性和荧光稳定性、方便保存及运输的荧光抗体保存液仍有待开发。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提出一种荧光抗体保存液、试剂盒、荧光抗体保存液或试剂盒在免疫检测中的用途和保存荧光抗体方法。本发明的荧光抗体保存液具有下列优点至少之一：长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温。
需要说明的是，本发明是基于以下发现完成的：
目前，适用于保存荧光抗体的保存液保存效果不佳，容易造成荧光抗体在保存过程中生物活性下降，且荧光逐渐淬灭，影响荧光抗体的使用。
有鉴于此，发明人经过大量实验意外地发现，含有明胶、半胱氨酸、庆大霉素和柠檬酸钠的荧光抗体保存液能够很好地保护荧光抗体，使其在常温下仍可以长期保持生物活性，且荧光稳定性较好。由此，根据本发明实施例的荧光抗体保存液具有以下优点至少之一：长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种荧光抗体保存液。根据本发明实施例，所述荧光抗体保存液包括：明胶；半胱氨酸；庆大霉素；以及柠檬酸钠。发明人经过大量实验意外地发现，含有明胶、半胱氨酸、庆大霉素和柠檬酸钠的荧光抗体保存液能够很好地保护荧光抗体，使其在常温下仍可以长期保持生物活性，且荧光稳定性较好。具体地，明胶的添加增加了体系中蛋白质浓度，防止荧光抗体水解；半胱氨酸的添加不仅能够有效地防止荧光抗体氧化，还可以起到很好的缓冲作用，调节体系pH；庆大霉素的添加能够有效地抑制微生物生长，延长保存期；柠檬酸钠的添加起到很好的缓冲作用，调节体系pH。由此，根据本发明实施例的荧光抗体保存液具有以下优点至少之一：长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温。
根据本发明实施例，上述荧光抗体保存液还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明实施例，所述明胶的浓度为5～10g/L。由此，以便进一步较好地长期保持荧光抗体的稳定性，避免荧光抗体的降解。
根据本发明实施例，所述半胱氨酸的浓度为1～5g/L。由此，以便进一步避免荧光抗体的氧化，进而长期保持荧光抗体的生物活性和荧光稳定性。
根据本发明实施例，所述庆大霉素的浓度为40～80μg/L。由此，可有效地抑制微生物的生长。
根据本发明实施例，所述柠檬酸钠的浓度为0.02～0.1mol/L。由此，以便进一步较好地维持荧光抗体保存液的酸碱度，使其长期保持荧光抗体的生物活性和荧光稳定性。
根据本发明实施例，所述荧光抗体保存液的pH值为6.0～7.2。由此，以便进一步长期保持荧光抗体的生物活性和荧光稳定性。
在本发明的另一个方面，本发明提出了一种含有前面所描述的荧光抗体保存液的试剂盒。由于本发明的荧光抗体保存液能够长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温。由此，利用含有该荧光抗体保存液的试剂盒能够有效地实现免疫检测。
在本发明的又一个方面，本发明提出了前面所描述的荧光抗体保存液或试剂盒在免疫检测中的用途。由于本发明的荧光抗体保存液能够长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温，由此，利用该荧光抗体保存液或者含有该荧光抗体保存液的试剂盒能够有效地实现免疫检测。
在本发明的又一个方面，本发明提出一种保存荧光抗体的方法。根据本发明实施例，所述方法包括：将荧光抗体置于上述荧光抗体保存液内。荧光抗体在本发明的荧光抗体保存液内能够长期保持生物活性以及荧光稳定性，且耐高温。
根据本发明的实施例，所述荧光抗体是由荧光素IR800或CF647标记的。由此，能够使得荧光抗体进一步具有较强的荧光稳定性。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例1中IR800-CRP Ab荧光抗体的荧光扫描对比图；
图2显示了实施例1中IR800-CRP Ab荧光抗体的荧光强度点状图；
图3显示了实施例2中CF647-CRP Ab荧光抗体的荧光扫描对比图；
图4显示了实施例2中CF647-CRP Ab荧光抗体的荧光强度点状图；
图5显示了对比例1中IR800-CRP Ab荧光抗体的荧光扫描对比图；以及
图6显示了对比例1中IR800-CRP Ab荧光抗体的荧光强度点状图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了一种荧光抗体保存液、试剂盒、荧光抗体保存液或试剂盒在免疫检测中的用途和保存荧光抗体方法，下面将分别对其进行详细描述。
荧光抗体保存液
在本发明的一个方面，本发明提出了一种荧光抗体保存液。根据本发明实施例，该荧光抗体保存液包括明胶；半胱氨酸；庆大霉素；以及柠檬酸钠。本发明的荧光抗体保存液具有下列优点至少之一：能够长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温。
发明人经过大量的实验意外地发现，荧光抗体保存液中的蛋白浓度对于荧光抗体的稳定性发挥着重要的作用，在高蛋白浓度下荧光抗体的稳定性好，在低蛋白浓度下荧光抗体易水解。明胶是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，可为体系提供一个高蛋白含量的环境，从而使得荧光抗体长期保持稳定。
荧光抗体保存液中抗氧化剂是防止荧光抗体因氧化而失效的关键。发明人发现，半胱氨酸是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸，是一种良好的天然来源抗氧化剂，可以很好地还原氧化物，防止荧光抗体因氧化而失效。进一步地，发明人意外地发现，半胱氨酸具有很好的缓冲作用，可以调节pH。另外，荧光抗体保存液中还含有缓冲物质柠檬酸钠，柠檬酸钠和半胱氨酸配合来阻碍荧光抗体保存液酸碱度的变化，为荧光抗体提供适宜的酸碱度，对长期保持荧光素稳定性、维持荧光抗体活性、防止荧光抗体聚集起到至关重要的作用。然而其他氨基酸起到的效果不佳，例如甘氨酸。甘氨酸虽然能很好地调节荧光抗体保存液的酸碱度，但其不具有还原性，不能抑制荧光抗体的氧化，需要额外添加抗氧化剂，如维生素C、维生素E或二硫苏糖醇等。
为了进一步提高荧光抗体保存液的稳定性，发明人选择向其中添加抑菌物质。目前，可以抑制微生物生长的抑菌物质很多，起到的效果也不尽相同。有些抑菌物质在发挥抑菌作用的同时对人体的伤害巨大，使用者必须采取良好的防护措施，例如叠氮化钠等；也有些抑菌物质会影响抗体活性或者荧光特性，影响荧光抗体的使用。有鉴于此，发明人经过大量实验创造性地发现，将庆大霉素加入到荧光抗体保存液后，可抑制多种微生物的生长。另外，发明人意外地发现，庆大霉素能够使得保存液具备较好的热稳定性，例如短期耐受37℃高温，由此适用于常温保存，避免低温保存对运输和存储带来的不便。
明胶、半胱氨酸、庆大霉素和柠檬酸钠的复配是发明人经过大量实验创造性发现的，在此条件下所得到的荧光抗体保存液能够长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，可以在常温下长期保存，最长可达1年。而且，具有耐高温性。另外，明胶、半胱氨酸、庆大霉素和柠檬酸钠不会影响荧光素和抗体本身的特性。
根据本发明实施例，明胶的浓度为5～10g/L。由此，能够为荧光抗体提供适宜的高蛋白浓度环境，使其长期保持稳定性，避免降解。具体地，若明胶浓度过低，荧光抗体将处于低蛋白浓度的环境中，容易使其降解从而导致荧光抗体失去活性；若明胶浓度过高，导致保存液过于粘稠甚至凝固，不便于后续的免于检测。
根据本发明实施例，半胱氨酸的浓度为1～5g/L。由此，能够抑制荧光抗体氧化，避免荧光抗体因氧化而失效。同时，半胱氨酸能够调节荧光抗体保存液的pH，使得荧光抗体保存液的pH维持在6.0～7.2的范围内。具体地，若半胱氨酸的浓度过低，不能有效地抑制荧光抗体的氧化，缓冲效果也不好，容易出现荧光抗体的抗体生物活性下降，且荧光逐渐淬灭；若半胱氨酸的浓度过高，会造成抗体间二硫键被还原，使其失活。
根据本发明实施例，庆大霉素的浓度为40～80μg/L。由此可有效抑制荧光抗体保存液中微生物的生长，并使得荧光抗体具有短时间内耐受37℃高温的特性。具体地，若庆大霉素的浓度过低，则不能很好地抑制微生物的生长；若庆大霉素的浓度过高，会影响荧光抗体的生物活性。
根据本发明实施例，柠檬酸钠的浓度为0.02～0.1mol/L。由此能够调节荧光抗体保存液的酸碱度，将pH保持在6.0～7.2的范围内。由于半胱氨酸具备缓冲效果，所以能够减少柠檬酸钠的添加。具体地，若柠檬酸钠的浓度过低，不能起到缓冲作用，容易出现抗体生物活性下降、荧光逐渐淬灭、荧光抗体聚集沉淀；若柠檬酸钠的浓度过高，则荧光抗体因盐析作用而聚集沉淀。
根据本发明实施例，荧光抗体保存液的pH值为6.0～7.2。抗体的最适pH值在6左右，荧光素的最适pH值在7左右，发明人经过大量实验发现，利用半胱氨酸和柠檬酸钠将荧光抗体保存液的pH维持在6.0～7.2的范围内，为荧光抗体提供一个酸碱度稳定的环境，能够避免荧光抗体因过酸或过碱而产生聚集沉淀。
试剂盒
在本发明的另一个方面，本发明提出了一种试剂盒，该试剂盒含有上述荧光抗体保存液。由于本发明的荧光抗体保存液能够长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温，由此，利用含有该荧光抗体保存液的试剂盒能够有效地实现免疫检测。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对荧光抗体保存液所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所描述的荧光抗体保存液或试剂盒在免疫检测中的用途。由于本发明的荧光抗体保存液能够长期保持荧光抗体的生物活性以及荧光稳定性，且耐高温，由此，利用该荧光抗体保存液或者含有该荧光抗体保存液的试剂盒能够有效地实现免疫检测。
需要说明的是，本发明所使用的术语“免疫检测”应作广义理解，主要是指利用抗原和相应的抗体特异性结合的特性，对抗原(待测物)进行检测的技术。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对荧光抗体保存液和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
保存荧光抗体的方法
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种保存荧光抗体的方法，包括：将荧光抗体置于上述荧光抗体保存液内。荧光抗体在本发明的荧光抗体保存液内能够长期保持生物活性，荧光稳定性，且耐高温。
根据本发明的实施例，荧光抗体是由荧光素IR800或CF647标记的。发明人发现，荧光素IR800或CF647具有较好的稳定性，能够在常温下长期保持荧光特性，不易淬灭。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对荧光抗体保存液所描述的特征和优点，同样适用于该保存荧光抗体的方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
(1)荧光抗体的制备
将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的荧光素IR800溶于DMSO，配制成浓度2mmol/L的IR800-NHS溶液。在100μL反应体系中加入终浓度为10μmol/L抗人c反应蛋白(CRP)单克隆抗体、100μmol/L IR800-NHS、10mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，用无菌去离子水补足到100μL。室温反应1.5h后，用illustra NAP-25Columns脱盐柱进行纯化，最后用500μL PBS洗脱，收集纯化后的荧光抗体(CRP抗体)。
(2)荧光抗体保存液的制备
按表1配方配制荧光抗体保存液，室温下搅拌溶解，22μm滤膜过滤，备用。
表1保存液配方
Figure BDA0001368540410000061
(3)荧光抗体保存
分别用上一步骤中制得的两种荧光抗体保存液将IR800-CRP Ab进行1:1稀释。稀释后的荧光抗体溶液各分装为小份，每一份于37℃避光放置。
(4)荧光强度检测
分别在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天取一份荧光抗体检测荧光强度。
表2不同保存时间IR800-CRP Ab的扫描荧光强度
Figure BDA0001368540410000062
(5)CRP抗体芯片制备
将CRP抗体用10mmol/L PBS缓冲液稀释到0.2mg/mL，通过微量蛋白打印仪GeSimNano-Plotter TM 2.1打印到等离子体金芯片上。按照3nL每个点、每个点重复4次打印，最终获得直径约400微米的圆形斑点，室温孵育2h即制得CRP抗体芯片。
(6)CRP抗体芯片检测
将CRP抗体芯片置于含1％BSA的PBS中摇动1小时封闭，以减少非特异性结合。用150μL/孔的PBST(0.05％吐温20)清洗后，每孔加入100微升的CRP抗原(1mg/L)，摇动半小时。芯片用PBST洗涤三次，随后加入IR800-CRP Ab或CF647-CRP Ab荧光抗体(4nmol/L)在黑暗中摇动染色半小时，后依次用PBST洗涤三次、纯水清洗一次，离心机甩干。
用MidaScan扫描仪扫描芯片，扫描IR800-CRP Ab时选择785纳米通道，扫描IR800-CRP Ab时选择670纳米通道，激光强度设置为7.0、分辨率设置为20微米。扫描后获得16位灰度图像。用MidaScan Software V1.0.0或更高版本软件分析该图像。选择栅阵列分析模式测量每个点的强度，点阵的形貌由程序自动识别。每个点的强度通过所选区域总信号强度除以面积获得。图像上平行的4个点的平均荧光强度被定义为测试的强度。CRP荧光抗体活性与所获图像上的荧光强度之间存在正相关关系。IR800-CRP Ab的检测结果图1、图2所示。可以看出，荧光抗体在保存液中保存10天后，仍具有较强的荧光强度，生物活性较高，稳定性较高。
实施例2
利用实施例1的方法制备荧光抗体，区别在于将荧光素IR800替换为荧光素CF647，其余步骤相同。荧光强度检测结果如表3所示，CRP抗体芯片检测结果如图3、图4所示。可以看出，荧光抗体在保存液中保存10天后，仍具有较强的荧光强度，生物活性较高，稳定性较高。
表3不同保存时间CF647-CRP Ab的扫描荧光强度
Figure BDA0001368540410000071
对比例1
利用实施例1的方法进行荧光抗体保存与检测，区别在于，荧光抗体保存液的成分不同，其成分如表4所示，CRP抗体芯片检测结果如图5、图6所示。可以看出，相较于实施例1，荧光抗体在该保存液中保存10天后，荧光强度显著下降，荧光抗体的生物活性显著降低，稳定性较差。
表4荧光抗体保存液成分
Figure BDA0001368540410000081
表5不同保存时间IR800-CRP Ab的扫描荧光强度
Figure BDA0001368540410000082
对比例2
利用实施例1的方法进行荧光抗体保存与检测，区别在于，明胶的浓度为12g/L。
此时保存液因明胶浓度过高，37℃保存两天时溶液已凝固，导致荧光抗体无法溶解。
对比例3
利用实施例1的方法进行荧光抗体保存与检测，区别在于，半胱氨酸的浓度为8g/L。
Figure BDA0001368540410000083
由于半胱氨酸浓度过高，会造成抗体间二硫键被还原，使其失活，导致荧光强度显著下降。
对比例4
利用实施例1的方法进行荧光抗体保存与检测，区别在于，庆大霉素的浓度为100μg/mL。
Figure BDA0001368540410000091
庆大霉素浓度过高，虽然也能较大程度地保持荧光抗体的活性，但荧光强度初始值比实施例1低很多，表明庆大霉素浓度过高影响了荧光抗体的初始活性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种荧光抗体保存液，其特征在于，由下列物质组成：
5～10g/L的明胶；
1～5g/L的半胱氨酸；
50～80μg/L的庆大霉素；
0.05～0.1mol/L的柠檬酸钠；以及
水。
2.根据权利要求1所述的荧光抗体保存液，其特征在于，所述荧光抗体保存液的pH值为6.0～7.2。
3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述荧光抗体保存液。
4.权利要求1或2所述荧光抗体保存液或权利要求3所述的试剂盒在免疫检测中的用途。
5.一种保存荧光抗体的方法，其特征在于，包括：将荧光抗体置于权利要求1或2任一项所述荧光抗体保存液内。
6.根据权利要求5所述的保存荧光抗体的方法，其特征在于，所述荧光抗体是由荧光素IR800或CF647标记的。
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