CN116008569B - 一种检测胃泌素17的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Abstract
本发明提供了一种检测胃泌素17的试剂盒及其制备方法，该试剂盒包含试剂R1、试剂R2、校准品和质控品；其中，所述试剂R1包括缓冲液、聚马来酸等；所述试剂R2包括缓冲液、G17抗体包被的胶乳颗粒等。本发明通过改善试剂R1及试剂R2的配方提升了试剂的检测精确性、稳定性、灵敏度和特异性；配合全自动生化分析仪使用，具有检测速度快、自动化检测、操作简便的优点，从而提升了临床对胃泌素17的检测性能。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种快速检测胃泌素17含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术
胃泌素17(gastrin17，G17)是一种主要由G细胞分泌的重要胃肠道肽类激素，G细胞是典型的开放型细胞，以胃窦部最多，其次是胃底、十二指肠和空肠等处。人胰岛的D细胞亦能分泌胃泌素。胃泌素起源于1905年，英国学者Edkins发现在猫的胃窦黏膜中获得的粗提取物在实验中可增加动物分泌胃酸，故认为其为一种胃肠激素并命名为Gastrin。后来，Dockray GJ等人研究发现胃泌素基因定位于17号染色体的长臂，全长为4.1kb，能够编码101个氨基酸残基组成的多肽-胃泌素原。人体中，95%以上有生物活性的胃泌素是α-酰胺化胃泌素，主要含两种异构体胃泌素17和胃泌素34，其中80%～90%是胃泌素17。胃泌素17仅由胃窦部G细胞分泌，因此胃泌素17是反映胃黏膜损伤情况的重要指标。
检测血清胃泌素可以用于辅助检查很多的疾病，当人体内胃泌素17处于低值状态时，通常提示患者的胃部存在一些高酸的状况，而当胃泌素17处于高值状态时，则提示患者的胃内部存在一些炎症，患者可能表现出一些高胃泌素血症的发病症状，在胃泌素瘤、胃癌、胃窦细胞增生、十二指肠溃疡、萎缩性胃炎等疾病中都可见血清胃泌素升高。 此外，《中国早期胃癌筛查流程专家共识意见（草案）（2017，上海）》推荐联合检测G17、PG 及幽门螺杆菌检测可提高早期胃癌的检出率。
目前已知的胃泌素17检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫层析法(FICA)、化学发光法等。酶联免疫吸附法不仅操作繁琐，检测时间长，而且线性范围偏窄，不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。而荧光免疫层析法的有机染料标记物光照下易分解，易发生光漂白现象，具有浓度猝灭特征，会影响分析结果的准确性和可靠性。另外，化学发光法仪器昂贵，检测成本高。这些问题给胃泌素17项目的临床使用带来了很大的不便。
因此，目前急需一种能够快速检测样本，并获得能够灵敏、准确检测胃泌素17的方法。而胶乳免疫比浊法是非常主流的一种快速检测样本的免疫检测方法，它的基本检测原理是：抗原抗体在缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，透光率下降。在一定的比例范围内，反应液的浊度和抗原抗体的量呈线性相关关系。然而该方法的灵敏度和准确度不如化学发光法，提高的灵敏度和准确度关键在于抗原抗体、胶乳颗粒的选择，以及反应流程和反应条件的优化。
发明内容
本发明为了克服上述不足，提供了一种检测速度快、自动化程度高、操作简便的胃泌素17胶乳免疫比浊测定试剂盒，以及该试剂盒的制备方法。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种试剂组合物，用于检测胃泌素17，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，试剂R1和试剂R2的容积比为3：1；其中，试剂R1的pH为7.0~7.8，包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、增浊剂和聚马来酸；试剂R2的pH为7.2~7.8，包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、悬浮剂、活化剂、标记剂、清洗剂和胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒；其中，缓冲液为100mmol/LTris-HCL缓冲液、稳定剂中包含BSA和NaCl；试剂R1中防腐剂为终浓度为0.01~0.05%的PC300溶液、试剂R2中防腐剂为终浓度为0.05~0.1%的NaN3溶液；胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒浓度为1~10mg/L、胶乳颗粒的粒径为30~80 nm。
优选地，在试剂R1中，稳定剂中BSA的含量为3~7%、NaCl的含量为50mmol/L；聚马来酸的浓度为0.2~0.6 mmol/L；增浊剂为2~6%的吐温-20。
优选地，在试剂R2中，稳定剂中，BSA的含量为0.05~0.5%、NaCl的含量为50mmol/L，还包含1~5%的电解质CaCl2；悬浮剂为3~5%的甘油，活化剂为100mmol/L含5% EDC的 PBS缓冲液，标记剂为100mmol/L Hepes缓冲液，清洗剂为50~150mmol/L甘氨酸缓冲液。
第二方面，本发明提供了一种检测胃泌素17的试剂盒，包含上述试剂组合物，还包含有质控品和校准品，质控品和校准品均包含至少2个浓度水平的胃泌素17抗原，缓冲液均为含人血清的磷酸缓冲液，其中人血清的含量不少于5%、且缓冲液pH值均为7.25~7.35。
优选地，质控品包含至少2个浓度水平的胃泌素17抗原，这2个浓度水平分别为：水平1：5 pmol/L~15 pmol/L；水平2：20 pmol/L~30 pmol/L。
优选地，校准品包含至少5个浓度水平的胃泌素17抗原，这5个浓度水平分别为：水平1：2.6pmol/L~3.1pmol/L；水平2：4.8pmol/L~5.2pmol/L；水平3：9.5pmol/L~10.5pmol/L；水平4：24.5pmol/L~25.5pmol/L；水平5：44.5pmol/L~45.5pmol/L。
第三方面，本发明提供了一种胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒的制备方法，包括以下步骤：S1：取胶乳颗粒于交联缓冲液中，加入交联剂和PH调节剂，将交联缓冲液的PH值从6.0调整到8.0，得到羧基修饰后的胶乳颗粒溶液（使胶乳颗粒的表面修饰成羧基）；S2：加入胃泌素17抗体，进行偶联，得胃泌素17抗体-胶乳颗粒偶联体系；S3：加入封闭剂，于25~30℃摇床封闭1h~3h，得胃泌素17抗体-胶乳颗粒混合体系；S4：加入标记剂，得到标记完成的胃泌素17抗体-胶乳颗粒；S5：加入清洗剂，清洗S4中标记完成的胃泌素17抗体-胶乳颗粒，得胃泌素17抗体胶乳颗粒；S6：加入活化剂活化后得活化的胃泌素17抗体胶乳颗粒；S7：制备保存剂，在保存缓冲液中依次添加稳定剂、防腐剂、悬浮剂，混合均匀后得到保存剂；S8：将S6活化的胃泌素17抗体胶乳颗粒保存在S7保存剂中，得到含有胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒溶液，即为试剂R2，分装，4℃保存待用。
优选地，胶乳颗粒的粒径为30~80 nm、且终浓度为1~10mg/L；交联缓冲液为50-150mmol/L的MES缓冲液；交联剂为NHS；PH调节剂为MOPSNa溶液；胃泌素17抗体包被浓度为1~10mg/L；封闭剂为1~3％BSA；标记剂为50-150mmol/L的Hepes缓冲液；清洗剂为50-150mmol/L的甘氨酸缓冲液；活化剂为50-150mmol/L含5% EDC的PBS缓冲液；保存缓冲液为50-150mmol/L的Tris-HCL缓冲液、稳定剂为0.05~0.5%的BSA、防腐剂为0.05~0.1%的NaN3溶液、悬浮剂为3~5%的甘油；试剂R2的PH范围为7.2~7.8。
在一个优选实施例中，胶乳颗粒的粒径为50 nm、且浓度为5mg/L；交联缓冲液为100mmol/L的MES缓冲液；胃泌素17抗体包被浓度为5mg/L；标记剂为100mmol/L的Hepes缓冲液，清洗剂为100mmol/L的甘氨酸缓冲液，活化剂为100mmol/L含5% EDC的PBS缓冲液；保存缓冲液为100mmol/L的Tris-HCL缓冲液。
第四方面，本发明提供了一种试剂组合物、一种检测胃泌素17的试剂盒和一种胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒的制备方法，在制备用于检测胃泌素17的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种优化的用于检测胃泌素17的试剂组合物及其制备方法，该试剂盒包含试剂R1、试剂R2、校准品和质控品；其中，所述试剂R1包括缓冲液、聚马来酸等；所述试剂R2包括缓冲液、G17抗体包被的胶乳颗粒等。相对于传统的胶乳免疫比浊法，本发明通过改善试剂R1及试剂R2的配方不仅明显提升了试剂的检测精确性、稳定性、灵敏度和特异性，而且易于保存、线性范围更广。
本发明所述的用于检测胃泌素17的试剂组合物在制备过程中，根据制备目的，优选了一系列缓冲液，比如优选MES缓冲液作为交联缓冲液、优选Hepes缓冲液作为标记剂、优选甘氨酸缓冲液作为清洗剂、优选PBS缓冲液作为活化剂、优选Tris-HCL缓冲液作为保存缓冲液，并进一步优化了各种缓冲液的浓度条件，使其发挥最优的交联、标记、清洗、活化和保存作用的同时，在一定范围内调节溶液的缓冲能力，为试剂盒提供最优的反应环境。尤其是Tris-HCl缓冲液不仅能够长期保持G17抗体包被的胶乳颗粒的活力，对检测过程中各种酶化学反应等无抑制作用，亦不干扰胶乳免疫反应的过程，缓冲能力为调节pH在7.0~7.8，该缓冲液的离子强度和pH值更不会抑制检测过程中的乳胶凝集反应。
本发明中试剂R1中：特别添加了聚阴离子聚马来酸，不仅可以降低乳糜颗粒干扰，而且对于试剂R1的稳定性无影响，有效提升看试剂R1的抗干扰能力；稳定剂中BSA的含量为3~7%，优选为5%，使得该试剂盒在常温条件下的稳定性显著提高。
本发明中试剂R2中：胶乳免疫比浊法的核心在于对胶乳颗粒的选择，核心指标为粒径和使用浓度，粒径越大，灵敏度越高；粒径越小，线性越长。一般情况下，灵敏度大于100ng/mL的，可以试用200nm以下的微球，灵敏度小于100ng/mL的可以先试用200nm以上的微球。然而本发明中对应于检测线性范围在3～45 pmol/L（相当于6～90pg/mL或0.006～0.09ng/mL）内，本发明创造性地发现粒径为30~80 nm（属于远远小于200nm以下的微球）胶乳颗粒更为合适；本发明进一步地研究发现当胶乳颗粒的粒径小于或等于30nm时，有时不能保证测量具有临床意义的准确度，当胶乳颗粒的粒径大于或等于80nm时，有时无法测量高水平的正常样品，因此30~80 nm为胶乳颗粒的最适粒径范围，可以提高试剂的灵敏度和准确度，而且本发明在原料筛选过程中选择的胶乳颗粒大小更均匀、球形状态更完美、折射率更低，更能保证检测胃泌素17的线性范围。本发明试剂R2中筛选的G17抗体，具有高特异性，能够和血清中的胃泌素17发生特异性结合，特异性地反应出人体内胃泌素17的含量范围，且线性相关性高、3-45 pmol/L线性范围内更灵敏、更准确。
此外，本发明还优化了胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒的制备方法。其中，G17抗体是通过化学交联的方法偶联于胶乳颗粒的表面。偶联前，先对胶乳颗粒表面进行羧基修饰，所用化学交联剂为NHS，优选的交联缓冲液为MES缓冲液，优选的PH调节剂为MOPSNa，如此修饰后的胶乳颗粒不仅可以提高与G17抗体的结合率，而且还为G17抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了G17抗体与胃泌素17结合的活性区域，提高产品的准确度。偶联过程中，先把PH由6.0调整到8.0后，加入G17抗体，并于25~30℃摇床封闭1h~3h，使得抗体胶乳颗粒终浓度范围为1~10mg/L，使用标记剂标记后，将标记完成的胶乳颗粒采用含5%EDC的活化剂进行活化后分装，4℃保存。
最终本发明中G17抗体包被的胶乳颗粒的终浓度为1~10mg/L，优选为5mg/L（相当于0.001~0.01mg/mL，优选为0.005mg/mL），相对于目前已上市的对照试剂中G-17-Ab的终浓度为0.0125mg/mL，在灵敏度和特异性增强的前提下，使用终浓度降低为对照试剂终浓度的2.5倍（0.0125mg/mL÷0.005mg/mL=2.5倍），从产品的成果转化角度看，可以有效降低主要原材料的生产成本。
本发明中试剂R2的稳定剂中，不仅筛选出BSA的含量范围为0.05~0.5%、NaCl的含量范围为1~5%（优选为50mmol/L），还特别添加了1~5%的电解质CaCl2，相对于试剂R1的稳定剂，适量的电解质不仅可以进一步稳定G17抗体的结构，还能够提升G17抗体与胃泌素17的结合能力，尤其是添加的CaCl2可以用来维持G17抗体的三维结构，避免乳胶颗粒标记后造成对G17抗体的选择性丧失，保证胃泌素17与G17抗体的结合活性。
进一步地，保存剂中，筛选了最佳的稳定剂、防腐剂、悬浮剂及其最优浓度范围；BSA 作为稳定剂的最优浓度范围为0.05-0.5%、NaN3作为防腐剂的最优浓度范围为0.05-0.1%、甘油作为悬浮剂的最优浓度范围为3-5%，筛选出这些组分的最优浓度，进一步提高了试剂R2的稳定性和灵敏度，尤其是使得该试剂盒在常温条件下的稳定性显著提高，不仅增加了本发明试剂盒常温保存的便利性，还提高了本发明相关产品在辅助临床应用中的实用性。
综上可知，本发明公布的检测胃泌素17的试剂组合物及其试剂盒（胶乳免疫比浊法），颠覆性地调整了试剂R1及试剂R2的配方，不仅有效降低了生产成本、制作简单，可以在全自动生化分析仪上使用、自动化程度高，而且相比同类产品，具有更高的精密度、特异性、检测范围、准确度和稳定性，取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1为本发明3个实施例所述的检测胃泌素17的试剂盒的性能评价中的线性相关性结果图，图中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3；
图2为本发明3个实施例所述的检测胃泌素17的试剂盒的性能评价中的线性范围结果图，图中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3；
图3为本发明3个实施例和对照试剂所对应的检测胃泌素17的试剂盒的性能评价中的准确度结果图，图中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为对照试剂；
图4为本发明中的2个实施例和对照试剂所对应的检测胃泌素17的试剂盒的性能评价中的准确度结果图，图中，A为实施例1，E为实施例4；
图5为本发明3个实施例和对照试剂所对应的检测胃泌素17的试剂盒的性能评价中的稳定性结果图，图中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为对照试剂，a为0个月，b为3个月，c为6个月，d为12个月。
具体实施方式
下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例，其中相同或相似的表示相同的概念，比如胃泌素17可以简称G17，胃泌素17的抗体可以简称G17抗体等。
在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，聚马来酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司；G17抗体购自北京博尔迈生物技术有限公司（规格：100µL，货号：MDTK-MG17-110）；Tris-HCL缓冲液购自赛默飞世尔科技公司（100mmol/L）；牛血清白蛋白（BSA）购自盐城赛宝生物科技有限公司；甘油购自禾大化学品(上海)有限公司；NaN3 购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；胶乳颗粒购自捷和泰(北京)生物科技有限公司；交联剂NHS购自上海品究化工有限公司；MOPSNa购自苏州启航生物科技有限公司；自动生化分析仪为日立自动生化分析仪7180。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
本发明实施的应用对象仅仅涉及采自于体外的是指采自于人体或动物体的组织、体液或排泄物等的生物样本，比如已经脱离了有生命的人体或动物体的血液样品（全血/血清/血浆）和体液样品（尿液/粪便/脑脊液/浆膜腔积液/精液/前列腺液/阴道分泌物/胃液/十二指肠引流液及胆汁/痰液）等，不是有生命的人体或动物体，而是离体的无生命的生物样本；所述检测的直接目的，属于对体外无生命的样本含量的检测，检测目的是为了检测样品中的胃泌素17的含量，从而有利于辅助医生在诊断过程中进一步间接地了解对应的人体内胃泌素17的含量状态时，且本发明中所述的产品及其应用均不存在直接获得疾病的诊断结果或健康状况的过程，因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。
本发明提供了一种用于检测胃泌素17的试剂组合物及其试剂盒（胶乳免疫比浊法）及胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒的制备方法，下面描述一下本发明的具体实施例，具体内容如下：
本发明所述检测胃泌素17的产品，采用胶乳免疫比浊法，可以用全自动生化分析仪进行自动生化结果分析，通用检测过程操作步骤如下：
一种试剂组合物，用于检测胃泌素17，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，试剂R1的pH为7.0~7.8，包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、增浊剂和聚马来酸；所述试剂R2的pH为7.2~7.8，包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、悬浮剂、活化剂、标记剂、清洗剂和胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒。
其中，试剂R2中胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒的制备过程如下：
S1：选取粒径为30~80 nm、且终浓度为1~10mg/L的胶乳颗粒于交联缓冲液（50-150mmol/L的MES缓冲液）中，加入交联剂（NHS）和PH调节剂（MOPSNa溶液），将交联缓冲液的PH值从6.0调整到8.0，得到羧基修饰后的胶乳颗粒溶液（使胶乳颗粒的表面修饰成羧基）；
S2：加入购自北京博尔迈生物技术有限公司（规格：100µL，货号：MDTK-MG17-110）的胃泌素17的抗体（简称G17抗体），G17抗体包被浓度为1~10mg/L，与胶乳颗粒偶联后得胃泌素17抗体-胶乳颗粒偶联体系；
S3：加入封闭剂（1~3％BSA），于25~30℃摇床封闭1h~3h，得胃泌素17抗体-胶乳颗粒混合体系；
S4：加入标记剂（50-150mmol/L的Hepes缓冲液），得到标记完成的胃泌素17抗体-胶乳颗粒；
S5：加入清洗剂（50-150mmol/L的甘氨酸缓冲液），清洗S4中标记完成的胃泌素17抗体-胶乳颗粒，得胃泌素17抗体胶乳颗粒；
S6：加入活化剂（50-150mmol/L含5% EDC的PBS缓冲液），活化后得活化的胃泌素17抗体胶乳颗粒；
S7：制备保存剂，在保存缓冲液（50-150mmol/L的Tris-HCL缓冲液）中依次添加稳定剂（0.05~0.5%的BSA）、防腐剂（0.05~0.1%的NaN3）、悬浮剂（3~5%的甘油），混合均匀后得到保存剂，
S8：将S6所述活化的胃泌素17抗体胶乳颗粒保存在S7所述保存剂中，得到含有胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒溶液，即为试剂R2，用PH调节剂将试剂R2的PH范围调整为7.2~7.8，分装，4℃保存待用。
其中，胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒的制备过程中，优选地，胶乳颗粒的平均粒径为50 nm、且浓度为5mg/L；交联缓冲液为100mmol/L的MES缓冲液；胃泌素17抗体包被浓度为5mg/L；标记剂为100mmol/L的Hepes缓冲液，清洗剂为100mmol/L的甘氨酸缓冲液，活化剂为100mmol/L含5% EDC的PBS缓冲液；保存缓冲液为100mmol/L的Tris-HCL缓冲液。
一种检测胃泌素17的试剂盒，包含试剂组合物（试剂R1和试剂R2）、质控品和校准品，其中，质控品和所述校准品均包含至少2个浓度水平的胃泌素17抗原，缓冲液均为含人血清的磷酸缓冲液，其中人血清的含量不少于5%、且缓冲液pH值均为7.25~7.35。
其中，质控品中胃泌素17抗原包含2个浓度水平，分别为：水平1：5pmol/L~15pmol/L；水平2：20pmol/L~30pmol/L。校准品中胃泌素17抗原包含5个浓度水平，这5个浓度水平分别为：水平1：2.6pmol/L~3.1pmol/L；水平2：4.8pmol/L~5.2pmol/L；水平3：9.5pmol/L~10.5pmol/L；水平4：24.5pmol/L~25.5pmol/L；水平5：44.5pmol/L~45.5pmol/L。
其中，校准品中优选地，5个浓度水平的配置浓度分别为：水平1：3pmol/L；水平2：5pmol/L；水平3：10pmol/L；水平4：25pmol/L；水平5：45pmol/L。
检测过程所用试剂、试剂组合物及其用量设置如下：设置3种反应管，包括空白管、样品管和校准管，空白管加30μL蒸馏水、样品管加30μL待测样品、校准管加30μL标准品；3种反应管先各加入试剂R1溶液180μL，于37℃孵育5分钟后；每个反应管再各加入试剂R2溶液60μL，混匀30秒后，用全自动生化分析仪读取3种反应管对应的吸光度（A1）；再置于37℃孵育5分钟后，用全自动生化分析仪再次读取3种反应管对应的吸光度（A2）；其中全自动生化分析仪的检测条件为：主波长设置为600nm，孵育温度为37℃，比色杯光径1cm，检测原理为吸光度差值ΔA（即终点上升法），计算公式如下：ΔA=A2-A1，
。
实施例1：一种试剂组合物1的制备
试剂组合物1包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中试剂R1中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表1：试剂组合物1的试剂R1的组成
用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.3。
其中，试剂R2中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表2：试剂组合物1的试剂R2的组成
用PH调节剂将试剂R2溶液的PH调节至pH值为7.5。
实施例2：一种试剂组合物2的制备
试剂组合物2包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中试剂R1中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表3：试剂组合物2的试剂R1的组成
用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.4。
其中，试剂R2中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表4：试剂组合物2的试剂R2的组成
用PH调节剂将试剂R2溶液的PH调节至pH值为7.5。
实施例3：一种试剂组合物3的制备
试剂组合物3包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中试剂R1中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表5：试剂组合物3的试剂R1的组成
用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.6。
其中，试剂R2中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表6：试剂组合物3的试剂R2的组成
用PH调节剂将试剂R2溶液的PH调节至pH值为7.7。
实施例4：一种试剂组合物4的制备
试剂组合物4包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中试剂R1中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表7：试剂组合物4的试剂R1的组成
用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.3。
其中，试剂R2中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表8：试剂组合物4的试剂R2的组成
用PH调节剂将试剂R2溶液的PH调节至pH值为7.5。
对照试剂：胃泌素17测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）
对照试剂选取国内目前唯一胶乳免疫比浊法批准上市的“胃泌素17测定试剂盒”（规格：通用型200T；胃泌素17校准品：5×0.5mL/瓶（选配）；胃泌素17质控品：2×0.5mL/瓶（选配）），购自湖南常津生物科技有限公司，注册证编号为湘械注准20212400818，批准日期为2022年10月26日。试剂中各组分对的具体用量或终浓度如下：
表9：对照试剂的主要组成成分
对照试剂的预期用途为本试剂盒用于体外定量测定人血清中胃泌素17的含量；对照试剂的储存条件及有效期：本试剂盒在2-8℃密封保存稳定12个月，开启后在2-8℃保存稳定30天。
性能评价：线性相关性评价
利用上述实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3，与对照试剂分别进行对照检测，随机检测30份临床血清样本，分别得到实施例1-3的测试值与对照值，具体数据结果如下表10所示（测试值与对照值的单位 pmol/L）。
表10线性相关性对照检测结果
根据表10所示检测结果得到实施例1-3对应的线性相关性结果图，如图1所示，结果实施例1的线性相关曲线为y＝1.0005x+0.1712，相关系数r＝0.9982；实施例2的线性相关曲线为y＝0.9893x+0.4942，相关系数r＝0.9976；实施例3的线性相关曲线为y＝1.0038x+0.4064，相关系数r＝0.9982；说明实施例1-3与对照试剂对照检测所得结果均具有较大的相关性。
性能评价：线性范围评价
根据优选的5个浓度水平配制校准品，5个浓度水平的配置浓度分别为：水平1：3pmol/L；水平2：5pmol/L；水平3：10pmol/L；水平4：25pmol/L；水平5：45pmol/L，校准品范围为3-45 pmol/L。使用本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3，分别检测5个浓度水平的校准品，以校准品的5个浓度水平为自变量，以检测结果为因变量求出线性回归方程，检测结果如图2所示。
根据图2所示，实施例1-3的回归方程分别为：
实施例1，y＝1.0056x+0.3211，相关系数r＝0.9997；
实施例2，y＝1.0106x+0.2907，相关系数r＝0.9994；
实施例3，y＝0.9784x+0.3402，相关系数r＝0.9989；明显可见实施例1-3的检测结果与稀释浓度之间的线性关系均良好，且检测的线性范围均可达45 pmol/L。
性能评价：批内精密度评价
用生理盐水替换蒸馏水加入空白管，使用本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3，分别检测优选的5个浓度水平配制的校准品及质控品，针对每个校准品、质控品各连续检测10次，计算均值与标准差SD；对照试剂同时做平行试验对比。检测结果如下表11所示。
表11批内精密度对照检测结果
从表11可见本发明所述实施例1-3对校准品、质控品检测的批内精密度均不超过3%，而对照试剂对校准品、质控品检测的批内精密度却无法保证批内精密度在5%的范围内。
性能评价：准确度评价
使用本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3，对线性范围覆盖内已知浓度的任意5份临床样品进行连续2次的检测，并与对照试剂平行检测进行对照，计算偏差。检测数据结果如表12所示。
表12准确度的对照检测结果
根据表12所示的准确度的对照检测结果做图，详见图3所示。从图3可见，本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3对临床样品检测的理论值与测定值的线性差异不大，且均明显优于对照试剂，可见本发明通过优化试剂R1、试剂R2各组成成分，以及优化G17抗体包被胶乳颗粒的制备方法，最终得到的3组试剂组合物，相比于对照试剂，均具有较高特异性，即可以特异性地与胃泌素17的结合，提高了试剂的准确度和灵敏度。
性能评价：抗干扰能力评价
使用本发明实施例1、4配制的试剂组合物1和试剂组合物4，对线性范围覆盖内已知浓度的任意5份临床轻度乳糜血样品进行连续2次的检测，计算偏差。检测数据结果如表13所示。
表13抗干扰能力的检测结果
根据表13所示的抗干扰能力的检测结果做图，详见图4所示。由于本发明实施例1配制的试剂组合物1与实施例4配制的试剂组合物4相比，差别仅在于试剂组合物1中添加了0.4 mmol/L聚马来酸。从图4可见，检测结果显示实施例1对临床轻度乳糜血样品检测的理论值与测定值的线性差异不大，且明显优于实施例4（不含聚马来酸），由此可见本发明通过优化试剂R1组成成分，特别添加了聚阴离子聚马来酸，不仅可以降低乳糜颗粒干扰，而且对于试剂R1的稳定性无影响，有效提升了试剂的抗干扰能力，从而提高了试剂的准确度。
进一步地，根据上文表12准确度的对照检测结果可知：由于实施例1、实施例2和实施例3中聚马来酸的浓度水平分别为0.4 mmol/L、0.2 mmol/L和0.6 mmol/L，对应的准确度的结果R2分别为：0.9950、0.9991和0.9954，均明显高于不含聚马来酸的对照试剂的准确度的结果（R2=0.9790），该对比也验证了本发明优化后的试剂组合物配方，主要是通过添加了聚马来酸，并进一步优化了聚马来酸的使用浓度，可以降低乳糜颗粒干扰，有利于显著提高试剂的抗干扰能力。
性能评价：稳定性评价
临床试验中稳定性评价一般包括37℃条件下热加速稳定性评价试验和2~8℃条件下的长期稳定性评价试验。
（1）37℃稳定性
将本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3分别置于37℃水浴中，分别放置1天、3天、5天、7天，对优选的校准品的水平3（10pmol/L）分别进行连续3次的检测分析。用本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3，分别与对照试剂做平行比对，37℃热加速后的检测结果数据如表14所示。
表14 37℃的稳定性对照检测结果
由表14可知，相比于对照试剂，本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3在37℃存放7天（近似于在2~8℃保存1年）后，变异系数均不超过3%、且明显优于对照试剂（CV=5.55%），说明实施例1-3配制的试剂组合物37℃热加速后仍能够保持非常高的反应活性。由此可知：相对于对比试剂，本发明实施例1-3配制的试剂组合物在常温条件下的稳定性更高，由此可以增加了本发明在临床应用过程中的存放便利性和实用性。
（2）2~8℃稳定性
将本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3分别置于2~8℃冷库中，验证试剂的长期稳定性。每种试剂分别取存放当天、2~8℃冷库存放3个月、6个月和12个月这4个时间段的样本，对5个浓度水平的校准品进行检测分析，分别与对照试剂做平行比对，37℃热加速后的检测结果数据如图5所示。
由图5可知，相比于对照试剂，相比于对照试剂，本发明实施例1-3配制的试剂组合物1、试剂组合物2和试剂组合物3，在2~8℃各保存4个不同时间后，对5个浓度水平的校准品检测的理论值与测定值的线性差异不大，且均明显优于对照试剂，即本发明优化的试剂组合物，相比于对照试剂，均拥有较高的稳定性，进一步增加了本发明在临床诊断中应用的实用性。
本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对那些细节进行不同的修饰或替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (5)
1.一种用于检测胃泌素17的试剂组合物，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其特征在于：
所述试剂R1和所述试剂R2的容积比为3：1；其中，
所述试剂R1的pH为7.0~7.8，包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、增浊剂和聚马来酸；所述试剂R2的pH为7.2~7.8，包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、悬浮剂、活化剂、标记剂、清洗剂和胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒；其中，
所述缓冲液为100mmol/LTris-HCl缓冲液；所述试剂R1中防腐剂为终浓度为0.01~0.05%的PC300溶液、所述试剂R2中防腐剂为终浓度为0.05~0.1%的NaN3溶液；
所述试剂R1中，
所述稳定剂中BSA的含量为3~7%、NaCl的含量为50mmol/L；所述增浊剂为2~6%的吐温-20；所述聚马来酸的浓度为0.2~0.6 mmol/L；
所述试剂R2中，
所述稳定剂中，BSA的含量为0.05~0.5%、NaCl的含量为50mmol/L，还包含1~5%的电解质CaCl2；所述悬浮剂为3~5%的甘油，所述活化剂为100mmol/L含5% EDC的 PBS缓冲液，所述标记剂为100mmol/L Hepes缓冲液，所述清洗剂为50~150mmol/L甘氨酸缓冲液；所述胃泌素17抗体包被的胶乳颗粒浓度为1~10mg/L、所述胶乳颗粒的粒径为30~80 nm。
2.一种检测胃泌素17的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的试剂组合物，还包含有质控品和校准品，所述质控品和所述校准品均包含至少2个浓度水平的胃泌素17抗原，缓冲液均为含人血清的磷酸缓冲液，其中人血清的含量不少于5%、且缓冲液pH值均为7.25~7.35。
3.根据权利要求2所述的检测胃泌素17的试剂盒，其特征在于，所述质控品包含至少2个浓度水平的胃泌素17抗原，这2个浓度水平分别为：
水平1：5 pmol/L~15 pmol/L；
水平2：20 pmol/L~30 pmol/L。
4.根据权利要求2所述的检测胃泌素17的试剂盒，其特征在于，所述校准品包含至少5个浓度水平的胃泌素17抗原，这5个浓度水平分别为：
水平1：2.6pmol/L~3.1pmol/L；
水平2：4.8pmol/L~5.2pmol/L；
水平3：9.5pmol/L~10.5pmol/L；
水平4：24.5pmol/L~25.5pmol/L；
水平5：44.5pmol/L~45.5pmol/L。
5.权利要求1所述的用于检测胃泌素17的试剂组合物、权利要求2-4所述的检测胃泌素17的试剂盒，在制备用于检测胃泌素17的产品中的应用。
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