CN111458523A - 胃泌素-17检测试剂盒及其制备方法和检测应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胃泌素‑17检测试剂盒,包括组分I、组分II和胃泌素‑17标准品,组分I采用包被磁球的抗胃泌素‑17第一抗体,组分II采用近红外荧光染料直接或间接标记的抗胃泌素‑17第二抗体;抗胃泌素‑17第一抗体、抗胃泌素‑17第二抗体与待测样本中的胃泌素‑17分别具有结合位点;胃泌素‑17标准品用于制作胃泌素‑17标准溶液荧光信号校准曲线;检测待测样本的荧光信号强度,并根据胃泌素‑17标准溶液荧光信号校准曲线计算得到待测样本中胃泌素‑17的浓度;本发明还涉及了该胃泌素‑17检测试剂盒的制备方法和检测应用方法;本发明利用双抗体夹心免疫分析原理,同时创造性结合磁珠提取分离技术和近红外染料标记特性,能够快速、准确、灵敏地测定胃泌素‑17浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种胃泌素-17检测试剂盒,本发明还涉及了该胃泌素-17检测试剂盒的制备方法、检测应用方法。
背景技术
胃癌是一种消化系统恶性肿瘤,具有高患病率和高死亡率的特点,已成为危害人类健康和安全的最常见疾病之一。胃癌的早期诊断是降低与此疾病相关死亡率的最有效方法。但是,由于胃癌早期无症状或无特异性症状,很难对其进行早期诊断,因此迫切需要可以诊断早期胃癌的非侵入性检查。萎缩性胃炎是一种极为重要的癌变前胃部疾病,通常由幽门螺杆菌引起。萎缩性胃炎导致腺体结构丧失和胃粘膜的网状骨架塌陷。此前的研究表明,萎缩性胃炎的早期诊断对于及时治疗和监测以阻止其进展至关重要。
胃泌素-17(英文名称为gastrin-17,简称:G-17)是人体内有生物活性胃泌素的主要成分,是胃窦和十二指肠粘膜G细胞分泌的一种多肽类激素,由17个氨基酸组成。近年有研究证实血清G-17含量是早期胃癌和萎缩性胃炎的重要指标。有研究证实胃癌患者存在一定程度的高胃泌素血症,从而影响癌细胞的生长和恶化。G-17在胃癌发生和发展过程中起重要作用:一方面促进胃癌细胞增殖复制和浸润转移,另一方面抑制胃癌细胞凋亡。所以血清G-17水平对早期胃癌诊断具有重要意义。此外,胃窦萎缩者,G细胞的数量减少,血清G-17水平下降;胃体萎缩者,泌酸腺减少,胃内呈现低胃酸状态,导致血清G-17水平升高;全胃萎缩者(多灶萎缩)则G-17降低,因此血清G-17浓度检测还可以诊断胃窦或仅局限于胃体的萎缩性胃炎。
胃泌素-17的检验在临床上使用越来越广泛,到目前为止,市场上用于检测G-17的方法主要为化学发光免疫测定法和可见荧光免疫测定法。化学发光免疫测定法主要使用辣根过氧化物酶(HRP)系统,但是辣根过氧化物酶催化发光反应的工作曲线可能随时间漂移,高浓度样本发光的峰值很快衰减,而且低端斜率容易呈线性下移,导致其测量结果准确性差。而可见荧光免疫测定的检测波长在可见光区(400~650nm),细胞、组织等生物样本在此波段具有很强的自发荧光,因此检测结果受到背景荧光干扰的问题较为严重。
因此,本申请人基于自身的研发经验和理论水平决定寻求技术方案来解决以上技术问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种胃泌素-17检测试剂盒及其制备方法和检测应用方法,利用双抗体夹心免疫分析原理,同时创造性结合磁珠提取分离技术和近红外染料标记特性,能够快速、准确、灵敏地测定待测样本中的胃泌素-17浓度。
本发明采用的技术方案如下:
一种胃泌素-17检测试剂盒,包括组分I、组分II和胃泌素-17标准品,所述组分I采用包被磁球的抗胃泌素-17第一抗体,所述组分II采用近红外荧光染料直接或间接标记的抗胃泌素-17第二抗体;其中,
所述抗胃泌素-17第一抗体、所述抗胃泌素-17第二抗体与待测样本中的胃泌素-17分别具有结合位点;所述胃泌素-17标准品用于制作胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线;检测待测样本的荧光信号强度,并根据胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线计算得到待测样本中胃泌素-17的浓度。
优选地,磁球采用Fe2O3或Fe3O4磁性金属小颗粒。
本发明涉及的直接标记是指近红外荧光染料直接与抗胃泌素-17第二抗体进行标记;间接标记是指通过中间媒介链接体系实现对抗胃泌素-17第二抗体的近红外荧光素标记,优选地,中间媒介链接体系可以包括链霉亲和素、生物素或其他公知的中间媒介链接体系。当采用间接标记时,组分II包括A液和B液,其中,A液为生物素化的抗胃泌素-17第二抗体;B液为近红外荧光染料标记的中间媒介链接体系。
优选地,所述抗胃泌素-17第一抗体与胃泌素-17的结合位点和所述抗胃泌素-17第二抗体与结合位点不相同。
优选地,所述抗胃泌素-17第一抗体采用胃泌素-17的高特异性单克隆抗体;所述抗胃泌素-17第二抗体采用单克隆抗体或多克隆抗体。
优选地,所述近红外荧光染料的发射波长范围在700-900nm。
优选地,所述近红外荧光染料选自菁染料类、罗丹明类、方酸类和卟啉类中的至少一种;进一步优选地,所述近红外荧光染料可具体选自本领域中公知用于生物成像、免疫标记的染料,例如:CY系列菁染料、近红外区域IR系列染料、近红外区域Alexa Fluor系列染料和近红外区域CF系列染料,尤其近红外区域Alexa Fluor系列染料为最优选方案,具体可以采用Alexa FluorTM790染料;
优选地,所述磁球为粒径范围为0.1-5μm的磁性颗粒通过有机高分子材料包裹后的磁性颗粒包覆体,且所述磁性颗粒包覆体表面改性形成用于提高与所述胃泌素-17结合力的活性功能基团。
优选地,所述有机高分子材料选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯亚胺中的任意一种,所述活性功能基团选自-OH、-NH2、-CHO、-COOH中的任意一种。
优选地,所述磁球的浓度为0.1-10mg/mL,所述第一抗胃泌素-17抗体的浓度为10-500ug/L,所述近红外荧光染料的浓度为0.5-100ug/mL,所述第二抗胃泌素-17抗体的浓度为20-500ug/L;当采用间接标记时,中间媒介链接体系(例如链霉亲和素)浓度为0.1-1mg/mL。
优选地,分别制备抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液、近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液以及标准品;其中,
制备抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液的操作步骤包括:
A10)、分别配制缓冲液、磁球包被液以及磁球封闭液,所述磁球包被液以及磁球封闭液均分别添加有牛血清白蛋白和/或防腐剂和/或非离子型表面活性剂,优选地,牛血清白蛋白的浓度为1-10%;防腐剂的浓度为0.1-0.5%,可以选自Proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠中的任意一种,非离子型表面活性剂的浓度为0.2-1%,具体可以采用吐温80,吐温80为一种非离子型表面活性剂,是由脱水山梨醇单油酯与环氧乙烷分子共聚而成;
A20)、将磁球采用缓冲液洗涤后,悬浮于磁球包被液中,加入偶联活化剂;然后添加抗胃泌素-17第一抗体混合均匀后进行震荡反应,然后用磁球封闭液封闭;
A30)、清洗后加入磁球包被液中,充分混匀后得到所述抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液,保存备用;
制备近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液的操作步骤包括:
B10)、分别配制缓冲液、透析液以及近红外荧光染料储液或近红外荧光染料标记的中间媒介链接体系储液;
B20)、向近红外荧光染料储液或近红外荧光染料标记的中间媒介链接体系储液中添加抗胃泌素-17第二抗体和缓冲液,混合均匀后进行震荡反应,然后用盛有透析液的透析袋进行透析用于去除未结合的近红外荧光染料;
B30)、添加防腐剂,得到近红外荧光染料直接或间接标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液,保存备用;
所述标准品包括采用对胃泌素-17标准品进行不同浓度等级稀释后得到不同浓度等级的标准品溶液,检测用于各浓度等级的标准品溶液的荧光信号强度,制作得到胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线;
优选地,将所述组分I、组分II与待测样本,进行孵育反应、磁性提取以及沉淀分离后得到组分I、待测样本中的胃泌素-17、组分II的免疫复合沉淀物,检测所述免疫复合沉淀物的荧光信号强度,并根据胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线计算得到待测样本中胃泌素-17的浓度。
本发明涉及的荧光信号强度检测可以通过近红外荧光扫描仪进行。
本发明提出的胃泌素-17检测试剂盒,将磁珠提取分离与近红外荧光标记法结合起来,在保持磁珠比表面积大、吸附性强、悬浮稳定性好、有利于抗原抗体反应顺利进行的优点基础上,近红外荧光染料技术可以进一步实现灵敏度高、选择性好、背景干扰低的优点,可快速、准确、灵敏地测定待测样本中的胃泌素-17浓度。
附图说明
附图1是本发明具体实施方式进行试剂盒的线性范围验证时对理论值与检测浓度均值进行一次方程回归拟合的结果。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种胃泌素-17检测试剂盒,包括组分I、组分II和胃泌素-17标准品,组分I采用包被磁球的抗胃泌素-17第一抗体,组分II采用近红外荧光染料直接或间接标记的抗胃泌素-17第二抗体;其中,抗胃泌素-17第一抗体、抗胃泌素-17第二抗体与待测样本中的胃泌素-17分别具有结合位点;胃泌素-17标准品用于制作胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线;检测待测样本的荧光信号强度,并根据胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线计算得到待测样本中胃泌素-17的浓度。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
以下实施例采用LCS-01生物芯片扫描仪(上海萨迦生物科技有限公司生产)进行检测;Alexa 790染料来源:赛默飞世尔科技有限公司,货号:S11378;胃泌素-17第一抗体来源:eastcoast;胃泌素第二抗体来源:eastcoast;磁球来源:百运纳米科技;biotin-nhs来源:赛默飞;胃泌素-17抗原来源:eastcoast。
本实施方式具体展开了胃泌素-17检测试剂盒的制备方法,其制备过程包括分别制备抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液、近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液以及标准品;其中,
一、抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液的具体制备过程如下:
配制磷酸盐缓冲液(俗称:PBS缓冲液):称取8gNaCl,0.2gKCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4加入到烧杯中,加入1L纯化水后搅拌至完全溶解,调节pH到7.4,保存备用;
配制磁球包被液:取500mL磷酸盐缓冲液,加入2%的牛血清白蛋白(俗称:BSA),0.2%ProClin300(防腐剂),0.5%吐温80,充分混匀后保存于2-8℃备用;
配制磁球封闭液:取500mL磷酸盐缓冲液,加入5%的牛血清白蛋白(俗称:BSA),0.2%ProClin300(防腐剂),0.5%吐温80,充分混匀后保存于2-8℃备用;
将磁球用10倍体积的PBS缓冲液洗涤3次后,悬浮于5倍体积的包被液中,加入3倍体积的偶联活化剂,然后按照0.1ug/T的浓度加入抗胃泌素-17第一抗体,混匀后,置于37℃震荡反应3小时,用封闭液封闭3次,清洗后加入5倍体积的包被液中,充分混匀后得到包被抗胃泌素-17第一抗体的磁球悬浮液,在2-8℃温度环境下保存备用。
二、近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液可以采用直接标记方式或间接标记方式,
2.1直接标记的操作步骤包括:
配制透析液:称取30.3g的Tris加入到烧杯中,加入5L纯化水后搅拌至完全溶解,用盐酸将pH调至7.2-7.5,保存备用;
配制近红外荧光染料储液:称取1mg Alexa FluorTM 790 NHS Ester染料,溶于100uLDMSO中,得到浓度为10mg/mL的近红外荧光染料储液,分装后置于-20℃温度环境下避光保存备用;
取5mg抗胃泌素-17第二抗体,加入10uL近红外荧光染料储液,再加入磷酸盐缓冲液,将总体积补至10mL,混匀后,置于摇床上,在避光、室温(18-28℃)下震荡反应3小时;震荡反应结束后,将混合溶液转移至透析袋中,在避光、低温(2-8℃)下透析3次,每次间隔2小时,以除去未结合的染料,透析完成后加入0.5%ProClin300,即得到浓度为0.5mg/mL的近红外荧光染料直接标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液,在2-8℃温度环境下保存备用。
2.2间接标记的操作步骤包括:
配制透析液:称取30.3g的Tris(三羟甲基氨基甲烷)加入到烧杯中,加入5L纯化水后搅拌至完全溶解,用盐酸将pH调至7.2-7.5;
配制biotin-NHS储液:称取1mg biotin-NHS粉末,溶于1mL DMSO中,得到浓度为1mg/mL的biotin-NHS储液,分装后-20℃温度环境下保存备用;
取1mg抗胃泌素-17第二抗体,加入10uL biotin-NHS储液,再加入磷酸盐缓冲液,将总体积补至2mL,混匀后,置于摇床上,在避光、室温(18-28℃)下震荡反应3小时;震荡反应结束后,将混合溶液转移至透析袋中,在避光、低温(2-8℃)下透析3次,每次间隔2小时,透析完成后加入0.5%ProClin300,即得到浓度为0.5mg/mL的生物素化抗胃泌素-17第二抗体溶液,放置2-8℃环境中保存备用。
本实施例中的直接标记方式和间接标记方式对于本实施例的实施结果没有明显区别,本领域技术人员在实际实施时可以根据实际需要来选择具体标记方式。
三、标准品溶液包括采用对胃泌素-17标准品进行不同浓度等级稀释后得到不同浓度等级的标准品溶液,检测用于各浓度等级的标准品溶液的荧光信号强度,制作得到胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线;本实施方式的具体操作过程如下:
胃泌素-17标准品包括5份胃泌素-17抗原冻干粉,使用前复溶分别得到不同浓度等级的标准品溶液,具体包括:S1标准品溶液、S2标准品溶液、S3标准品溶液、S4标准品溶液和S5标准品溶液;其中,
预先配制S0溶液:分别称取10g蔗糖,10g聚乙二醇(MW6000)和30g牛血清白蛋白,加入到pH 7.4为1L磷酸盐缓冲液中,再加入0.2mL的PC300和5mL吐温20,充分搅拌混匀;
然后采用以上配置的S0标准品溶液将5份胃泌素-17抗原冻干粉分别稀释成5个不同浓度等级的标准品溶液,具体为:S1标准品溶液中胃泌素-17的浓度为6.25pmol/L;S2标准品溶液中胃泌素-17的浓度为12.5pmol/L的胃泌素-17抗原;S3标准品溶液中胃泌素-17的浓度为25pmol/L;S4标准品溶液中胃泌素-17的浓度为50pmol/L;S5标准品溶液中胃泌素-17的浓度为100pmol/L;复溶完成后,混匀、分装到西林瓶中,冻干,在2-8℃温度环境下保存备用。
本实施例对通过以上制备方法得到的检测试剂盒(采用直接标记的近红外荧光染料储液作为近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液)进行了检测应用,其检测应用方法采用:将抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液、近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液(直接标记方式)与待测样本,进行孵育反应、磁性提取以及沉淀分离后得到组分I、待测样本中的胃泌素-17、组分II的免疫复合沉淀物,检测免疫复合沉淀物的荧光信号强度,并根据胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线计算得到待测样本中胃泌素-17的浓度;具体的检测应用操作过程如下:
(1)将20-100uL待测样本、具有不同浓度等级(S1-S5)的标准品溶液分别加入到不同的反应孔中;(2)加入10-200uL抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液;(3)加入10-200uL近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液;(4)在37℃温度条件下孵育10-40分钟,在磁环境下清洗至少3次;(5)采用LCS-01生物芯片扫描仪检测待测样本的近红外荧光信号值(即近红外荧光信号强度);(6)采用LCS-01生物芯片扫描仪检测S1-S5标准溶液的荧光信号值,借助分析软件进行四参数Logistic拟合,得到胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线,根据待测样本的近红外荧光信号值对照计算出待测样本的胃泌素-17浓度。
本实施方式通过以上检测应用完成了主要性能指标,包括对试剂盒的精密度、试剂盒的最低检测限、试剂盒的线性范围、试剂盒的准确度的验证,具体验证结果如下:
1.试剂盒的精密度
a、批内精密度:用同批次本发明的试剂盒分别检测高、中、低值样本,每份样本分别重复测10次,计算本实施例检测试剂盒对于不同浓度样本的变异系数,测定结果请参见下表1所示:
表1 试剂盒批内精密度的测定(胃泌素-17浓度)
本实施例涉及的均值、标准差SD以及变异系数CV均采用本领域的公知计算公式计算得到,本申请对其没有特别需要说明的内容。
从表1结果可看出所检测的高、中、低值样本的批内变异系数(CV)分别为2.09%、4.13%和6.72%,均小于10%,确定本申请实施例检测试剂盒符合胃泌素-17检测试剂盒的批内精密度要求。
b、批间精密度:用3个批号的试剂盒分别检测高、中、低值样本,每份样本各测10次,计算不同浓度样本的变异系数,测定结果请参见下表2所示:
表2 试剂盒批间精密度的测定(胃泌素-17浓度)
从表2结果可看出所检测的高、中、低值样本的批间变异系数(CV)分别为2.99%、4.72%和7.85%,均小于15%,确定本申请实施例检测试剂盒符合胃泌素-17检测试剂盒的批间精密度要求。
2.试剂盒的最低检测限
使用本试剂盒检测10份S0溶液,得到检测荧光信号的平均值(A)和标准差(SD),将A+2SD的荧光信号值带入胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线中,计算出浓度值,即为本申请实施例检测试剂盒的最低检测限,检测结果请参见下表3所示:
表3 试剂盒最低检测限的测定
编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
荧光信号值 | 805 | 1102 | 1100 | 1006 | 1174 | 986 | 934 | 1200 | 1182 | 833 |
从上表3结果可计算出测定S0溶液的荧光信号平均值A=1032.2,SD=142.96,将(A+2SD)的值带入胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线,计算出本申请实施例试剂盒的检测限为0.064pmol/L,表现良好。
3.试剂盒的线性范围
将高浓度样本CH(100pmol/L)和低浓度样本CL(0.5pmol/L)分别按照如下比例进行混合成5个浓度样本(CH,3/4CH+1/4CL,1/2CH+1/2CL,1/4CH+3/4CL,CL),每个浓度样本检测3个平行孔,根据胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线计算出浓度均值,将理论值与检测浓度均值进行一次方程回归拟合,得到拟合方程的斜率和相关因子R2,要求斜率范围在0.85-1.15,R2>0.9;实际拟合结果请参见图1所示,可看出本申请实施例试剂盒在0.5-100pmol/L范围均具有良好的线性,表现良好。
4.试剂盒的准确度
配置浓度为84.52pmol/L的标准品溶液,将其与按体积1:9加入阴性血清(1.61pmol/L)中,然后采用本申请实施例的试剂盒检测后计算回收率;测定值为9.56pmol/L,回收率为96.56%,处于90%-110%之间,符合要求。
为了进一步验证本发明的临床性能,本实施例进行了如下对比试验:
使用本实施例试剂盒和Biohit公司生产的Biohit试剂盒同时检测254例血清样本,其中阳性样本约98例,阴性样本156例,血清样本浓度范围在0.3-87.2pmol/L之间,将两种试剂盒的检测结果进行对比分析;对比结果请参见下表4所示:
表4 本实施例试剂盒与Biohit试剂盒检测结果的比较
从表4结果可以看出,本发明试剂盒与Biohit试剂盒阳性符合率为97.00%,阴性符合率为99.35%,总符合率本实施例试剂盒的灵敏度可达98.43%。此外,通过相关性拟合得到R2=0.9987,表明本实施例试剂盒与Biohit试剂盒具有很好的相关性。
本实施例提出的胃泌素-17检测试剂盒,将磁珠提取分离与近红外荧光标记法结合起来,在保持磁珠比表面积大、吸附性强、悬浮稳定性好、有利于抗原抗体反应顺利进行的优点基础上,近红外荧光染料技术可以进一步实现灵敏度高、选择性好、背景干扰低的优点,可快速、准确、灵敏地测定待测样本中的胃泌素-17浓度,临床表现优异。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种胃泌素-17检测试剂盒,包括组分I、组分II和胃泌素-17标准品,其特征在于,所述组分I采用包被磁球的抗胃泌素-17第一抗体,所述组分II采用近红外荧光染料直接或间接标记的抗胃泌素-17第二抗体;其中,
所述抗胃泌素-17第一抗体、所述抗胃泌素-17第二抗体与待测样本中的胃泌素-17分别具有结合位点;所述胃泌素-17标准品用于制作胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线;检测待测样本的荧光信号强度,并根据胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线计算得到待测样本中胃泌素-17的浓度。
2.根据权利要求1的胃泌素-17检测试剂盒,其特征在于,所述抗胃泌素-17第一抗体与胃泌素-17的结合位点和所述抗胃泌素-17第二抗体与结合位点不相同。
3.根据权利要求1或2的胃泌素-17检测试剂盒,其特征在于,所述抗胃泌素-17第一抗体采用胃泌素-17的高特异性单克隆抗体;所述抗胃泌素-17第二抗体采用单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2的胃泌素-17检测试剂盒,其特征在于,所述近红外荧光染料的发射波长范围在700-900nm。
5.根据权利要求4的胃泌素-17检测试剂盒,其特征在于,所述近红外荧光染料选自菁染料类、罗丹明类、方酸类和卟啉类中的至少一种。
6.根据权利要求1的胃泌素-17检测试剂盒,其特征在于,所述磁球为粒径范围为0.1-5μm的磁性颗粒通过有机高分子材料包裹后的磁性颗粒包覆体,且所述磁性颗粒包覆体表面改性形成用于提高与所述胃泌素-17结合力的活性功能基团。
7.根据权利要求6的胃泌素-17检测试剂盒,其特征在于,所述有机高分子材料选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯亚胺中的任意一种,所述活性功能基团选自-OH、-NH2、-CHO、-COOH中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述磁球的浓度为0.1-10mg/mL,所述第一抗胃泌素-17抗体的浓度为10-500ug/L,所述近红外荧光染料的浓度为0.5-100ug/mL,所述第二抗胃泌素-17抗体的浓度为20-500ug/L。
9.一种如权利要求1-8之一所述的胃泌素-17检测试剂盒的制备方法,其特征在于,分别制备抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液、近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液以及标准品;其中,
制备抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液的操作步骤包括:
A10)、分别配制缓冲液、磁球包被液以及磁球封闭液,所述磁球包被液以及磁球封闭液均分别添加有牛血清白蛋白和/或防腐剂和/或非离子型表面活性剂;
A20)、将磁球采用缓冲液洗涤后,悬浮于磁球包被液中,加入偶联活化剂;然后添加抗胃泌素-17第一抗体混合均匀后进行震荡反应,然后用磁球封闭液封闭;
A30)、清洗后加入磁球包被液中,充分混匀后得到所述抗胃泌素-17第一抗体的包被磁球悬浮液,保存备用;
制备近红外荧光染料标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液的操作步骤包括:
B10)、分别配制缓冲液、透析液以及近红外荧光染料储液或近红外荧光染料标记的中间媒介链接体系储液;
B20)、向近红外荧光染料储液或近红外荧光染料标记的中间媒介链接体系储液中添加抗胃泌素-17第二抗体和缓冲液,混合均匀后进行震荡反应,然后用盛有透析液的透析袋进行透析用于去除未结合的近红外荧光染料;
B30)、添加防腐剂,得到近红外荧光染料直接或间接标记的抗胃泌素-17第二抗体溶液,保存备用;
所述标准品包括采用对胃泌素-17标准品进行不同浓度等级稀释后得到不同浓度等级的标准品溶液,检测用于各浓度等级的标准品溶液的荧光信号强度,制作得到胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线。
10.一种如权利要求1-8之一所述的胃泌素-17检测试剂盒的检测应用方法,其特征在于,将所述组分I、组分II与待测样本,进行孵育反应、磁性提取以及沉淀分离后得到组分I、待测样本中的胃泌素-17、组分II的免疫复合沉淀物,检测所述免疫复合沉淀物的荧光信号强度,并根据胃泌素-17标准溶液荧光信号校准曲线计算得到待测样本中胃泌素-17的浓度。
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