CN112710596A - 使用流式细胞仪定性/定量检测目标抗体浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用流式细胞仪定性/定量检测目标抗体浓度的方法，该方法包括如下步骤：步骤1）取目标抗体标准样品进行多倍稀释，获得多个标准样品溶液，在该多个标准样品溶液中加入目标抗原进行封闭，然后在其中加入荧光标记的目标抗体并测试其阳性荧光信号值，采用多个标准样品溶液的浓度与最终获得的阳性荧光信号值制作标准曲线；步骤2）取待测样品溶液，在该待测样品溶液中加入目标抗原进行封闭，然后在其中加入荧光标记的目标抗体或荧光标记的抗IgG的抗体并测试其阳性荧光信号值，根据步骤1）获得的标准曲线估算待测样品溶液中的目标抗体浓度；其中，抗IgG的抗体和目标抗体Fc种属相同。
Description
技术领域
本发明属于抗体定性定量检测方法，具体涉及一种使用流式细胞仪定性/定量检测目标抗体浓度的方 法。
背景技术
传统检测抗体浓度采用的是ELISA化学发光的方法，由于抗原铺板及反应时间较长，整个实验方法检 测时间在24小时以上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用流式细胞仪定性/定量检测目标抗体浓度的方法，该方法包括如下步 骤：
步骤1)取目标抗体标准样品进行多倍稀释，获得多个标准样品溶液，在该多个标准样品溶液中加入 目标抗原进行封闭，然后在其中加入荧光标记的目标抗体并测试其阳性荧光信号值，采用多个标准样品溶 液的浓度与最终获得的阳性荧光信号值制作标准曲线；
步骤2)取待测样品溶液，在该待测样品溶液中加入目标抗原进行封闭，然后在其中加入荧光标记的 目标抗体或荧光标记的抗IgG的抗体并测试其阳性荧光信号值，根据步骤1)获得的标准曲线估算待测样 品溶液中的目标抗体浓度；其中，抗IgG的抗体和目标抗体Fc种属相同。
在一些实施例中，所述目标抗体为杂交瘤或CHO细胞培养上清中的抗体；在一些实施例中，所述 的目标抗原为小鼠脾脏细胞或人血淋巴细胞样品或抗原偶连的磁珠或微球；小鼠脾脏细胞或人血淋巴细胞 样品或抗原偶连的磁珠或微球，加入100uL目标抗体标准样品(梯度浓度),对于待测上清液或待测溶液， 取100uL加入小鼠脾脏或人淋巴细胞样品封闭半小时后加入荧光标记的目标抗体，记录阳性荧光信号值， 作标准曲线并通过标准曲线预估待测上清液或溶液中抗体的浓度；在另一些实施例中，小鼠脾脏细胞或人 血淋巴细胞样品或抗原偶连的磁珠或微球，加入100uL目标抗体标准样品(梯度浓度),对于待测上清液或 待测溶液，取100uL加入小鼠脾脏或人淋巴细胞样品半小时后加入荧光标记的二抗，记录阳性荧光信号值， 作标准曲线并通过标准曲线预估待测上清液或溶液中抗体的浓度。
在一些实施例中，，该方法具体包括如下步骤：
步骤a)准备小鼠脾脏细胞；取小鼠脾脏，放置于滤网内，加入培养基进行研磨，收集研磨滤液；
步骤b)取目标抗体标准样品进行N倍稀释获得N个梯度稀释标准封闭液，取待测样品溶液分别进行 N倍稀释获得N个梯度稀释待测样品，其中，N不小于5，；
步骤b)取2N+2个离心管，分别加入定量的步骤a)准备的细胞研磨滤液，离心；
步骤c)离心后去上清液，N个离心管内分别加入N个梯度稀释标准封闭液，N个离心管内分别加入 N个梯度稀释待测样品，剩余2个离心管中加入FACS buffer作为阳性对照及阴性对照,涡旋混匀，室温 避光孵育，离心2分钟；
步骤d)去上清液，在N个目标抗体标准样品封闭液离心管、N个待测样品稀释液离心管、1个阳性 对照离心管中加入定量的荧光标记的目标抗体,阴性对照中加入定量的缓冲溶液，
室温避光孵育，孵育完，离心；
步骤e)记录2N+2样品阳性PE信号的信号中值。
在一些实施例中，所述步骤a)中：取小鼠脾脏，脾脏时尽量不要附带脂肪组织，放置于40um(淋巴 细胞)或100um(目标细胞为DC，巨噬细胞,单核细胞等)滤网内，加入10mLRPMI 1640(10％FBS)培养基 进行研磨，收集研磨滤液。
在一些实施例中，目标抗体标准样品:浓度1mg/mL,对其进行10倍稀释做标准曲线，例如：在一些 实施例中，所述步骤b)的具体步骤为：目标抗体的浓度2mg/mL，用标准品制作1:25(80ug/mL),1:50 (40ug/mL),1:100(20ug/mL),1:200(10ug/mL),1:400(5ug/mL),1:800(2.5ug/mL),1:1600(1.25ug/mL),1:3200 (625ng/mL),1:6400(312.5ng/mL),1:12800(156.25ng/mL)梯度稀释标准封闭液；
用未知浓度待测样品获得1:25,1:50,1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400，1:12800稀释液。
在一些实施例中，所述步骤c)的具体步骤为：离心后去上清液，并加入100uL标准品封闭液(10个样 品)，样品梯度稀释液(10个样品)，剩余2个离心管中加入FACS buffer(阳性对照及阴性对照)，涡旋混匀； 室温避光孵育30分钟；孵育完，4℃，3500rpm离心2分钟。
在一些实施例中，所述步骤d)的具体步骤为：去上清液，在10个标准品封闭液离心管，10个样品 稀释液离心管，1个阳性对照离心管中加入100uL的FACS buffer和1uL荧光标记的目标抗体,阴性对照 中加入1uL FACS Buffer；室温避光孵育15分钟；孵育完，加入900uL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm 离心2分钟；去上清液，加入1mL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟；去上清液，加入500uL 的FACS buffer，混匀后于Attune○RNxT声波聚焦流式细胞仪检测。
在一些实施例中，所述步骤d)的具体步骤为：去上清液，在N个目标抗体标准样品封闭 液离心管、N个待测样品稀释液离心管、1个阳性对照离心管中加入定量的荧光标记的抗IgG 抗体,阴性对照中加入定量的缓冲溶液，室温避光孵育，孵育完，离心。在一些实施例中，荧光 标记的目标抗体例如采用iFluor标记。
本发明采用的封闭抗体法，通过杂交瘤细胞分泌到上清液中的抗体与孵育细胞上所含的 目标抗原的结合，提前封闭结合位点。封闭后荧光标记的相同克隆号抗体无法再和孵育细胞 上的目标抗原结合，进而对流式细胞仪上检测的荧光信号进行封闭，信号封闭的强度反应了 杂交瘤细胞上清液中分泌抗体的浓度。
本发明采取使用流式细胞仪定性/定量检测目标抗体浓度的方法，该方法可以在3小时内完成快速检 测，适用于杂交瘤或CHO细胞培养上清中的抗体浓度进行快速检测。
附图说明
图1与图2为实施例1制作的标准曲线；
图3为实施例2制作的标准曲线。
具体实施方式
实验例1
1.试剂与样品：
检测抗小鼠CD4(克隆:GK1.5)抗体的浓度(未知浓度),
标准品:已定量抗小鼠CD4(克隆:GK1.5)抗体:浓度2mg/mL
用标准品制作1:25(80ug/mL),1:50(40ug/mL),1:100(20ug/mL),1:200(10ug/mL),1:400(5ug/mL),1:800 (2.5ug/mL),1:1600(1.25ug/mL),1:3200(625ng/mL),1:6400(312.5ng/mL),1:12800(156.25ng/mL)梯度稀释标 准封闭液
样品:用未知浓度抗小鼠CD4(克隆:GK1.5)抗体制作检测样品:1:25,1:50,1:100,1:200,1:400,1:800, 1:1600,1:3200,1:6400,1:12800稀释液
阳性对照:CD4-PE单染
阴性对照:Unstain样品
2.实验室环境和安全控制
2.1实验室温湿度要求：温度在15℃-30℃范围内，湿度在40％-80％范围内。
2.2安全控制：进行操作检测或分析实验时，需穿戴手套(必要时着双层手套)及其它必 要的防护装备(例如口罩)，当手套污染时，需更换新手套，手套不可清洗或消毒后再使用； 实验室的工作人员在每天工作结束后，应以5％的漂白水(或75％酒精)擦拭消毒工作台面， 并将所有使用过的器具进行清洁归位。
3.质量控制
3.1阳性对照品：未经过标准品或样品孵育封闭的细胞，直接通过CD4-PE染色的对照品。
3.2阴性对照：生产无关抗体的细胞上清，或者细胞培养基。
3.2空白：不加任何抗体。
3.3频率：每次实验操作。
3.4结果要求：阳性对照品的信号强度明显低于阴性对照品的信号强度。
4.操作程序
4.1试剂和仪器
4.1.1主要试剂：FACS buffer(流式缓冲液)，红细胞裂解液。
4.1.2主要耗材：2mL离心管、移液枪、枪头。
4.1.3主要仪器：超净工作台、离心机，移液枪、Acoustic Focusing Cytometernal(流式细 胞仪器)。
4.2小鼠脾脏准备阶段
4.2.1 FACS buffer
4.2.2细胞准备：取小鼠脾脏，脾脏时尽量不要附带脂肪组织，放置于40um(淋巴细胞) 或100um(目标细胞为DC，巨噬细胞,单核细胞等)滤网内，加入10mLRPMI 1640含10％FBS (胎牛血清)培养基进行研磨，收集研磨滤液。(注意：研磨过程中要注意不可过于用力将滤网 戳破。)
4.2.3离心机4℃预冷
4.3抗体流式检测操作流程
4.3.1取22个2mL的离心管，加入100uL步骤4.2.2准备的细胞，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.2离心后去上清液，并加入100uL标准品封闭液(10个样品)，样品梯度稀释液(10个 样品)，剩余2个离心管中加入FACS buffer(阳性对照及阴性对照),涡旋混匀。
4.3.3室温避光孵育30分钟。
4.3.4孵育完，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.5去上清液，在10个标准品封闭液离心管，10个样品稀释液离心管，1个阳性对照 离心管中加入100uL的FACS buffer和1uL CD4-PE(GK1.5),阴性对照中加入1uL FACSBuffer。
4.3.6室温避光孵育15分钟。
4.3.7孵育完，加入900uL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.8去上清液，加入1mL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.9去上清液，加入500uL的FACS buffer，混匀后于Attune○RNxT声波聚焦流式细胞 仪检测。
4.4上机检测：记录22个样品阳性PE信号的信号中值(Median)，详见表1；根据CD4标准样品的浓度和样品阳性PE信号的信号中值制作标准曲线，详见图1与图2(纵坐标为阳性PE信号的信号中值(Median)，横坐标为CD4标准样品的浓度)，其中，图1为浓度为0.01mg/mL-0.09mg/mL区间的曲线走势图，而图2则示意了浓度小于0.0007mg/mL区间的 曲线走势图，可以从图1与图2看出，其拟合的标准曲线拟合度高，表明了其在定量检测中 的误差小，定量检测准确度高；然后依据标准曲线和待测样品的PE信号的信号中值估算待 测样品的浓度，详见表2。
表1
表2
结论:通过流式细胞仪定量检测后的待测抗体的浓度为2.05mg/ml。与传统方法BCA测定的浓度一致。
实验例2
试剂与样品：检测抗小鼠IGD(克隆:11-26C)抗体的浓度(未知浓度),
标准品:已定量抗小鼠IGD(克隆:11-26C)抗体:浓度2mg/mL
用标准品制作1:25(80ug/mL),1:50(40ug/mL),1:100(20ug/mL),1:200(10ug/mL),1:400(5ug/mL),1:800 (2.5ug/mL),1:1600(1.25ug/mL),1:3200(625ng/mL),1:6400(312.5ng/mL),1:12800(156.25ng/mL)梯度稀释标 准封闭液
样品:用未知浓度抗小鼠IGD(克隆:11-26C)抗体制作检测样品:1:25,1:50,1:100,1:200,1:400,1:800, 1:1600,1:3200,1:6400,1:12800稀释液
阳性对照:IGD-PE单染
阴性对照:Unstain样品
2.实验室环境和安全控制
2.1实验室温湿度要求：温度在15℃-30℃范围内，湿度在40％-80％范围内。
2.2安全控制：进行操作检测或分析实验时，需穿戴手套(必要时着双层手套)及其它必 要的防护装备(例如口罩)，当手套污染时，需更换新手套，手套不可清洗或消毒后再使用； 实验室的工作人员在每天工作结束后，应以5％的漂白水(或75％酒精)擦拭消毒工作台面， 并将所有使用过的器具进行清洁归位。
3.质量控制
3.1阳性对照品：未经过标准品或样品孵育封闭的细胞，直接通过CD4-PE染色的对照品。
3.2阴性对照：生产无关抗体的细胞上清，或者细胞培养基。
3.3空白：不加任何抗体。
3.4频率：每次实验操作。
3.5结果要求：阳性对照品的信号强度明显低于阴性对照品的信号强度。
4操作程序
4.1试剂和仪器
4.1.1主要试剂：FACS buffer，红细胞裂解液。
4.1.2主要耗材：2mL离心管、移液枪、枪头。
4.1.3主要仪器：超净工作台、离心机，移液枪、Acoustic Focusing Cytometernal(流式细 胞仪器)。
4.2小鼠脾脏准备阶段
4.2.1 FACS buffer
4.2.2细胞准备：取小鼠脾脏，脾脏时尽量不要附带脂肪组织，放置于40um(淋巴细胞) 或100um(目标细胞为DC，巨噬细胞,单核细胞等)滤网内，加入10mL RPMI 1640(10％FBS) 培养基进行研磨，收集研磨滤液。(注意：研磨过程中要注意不可过于用力将滤网戳破。)
4.2.3离心机4℃预冷
4.3抗体流式检测操作流程
4.3.1取22个2mL的离心管，加入100uL步骤4.2.2准备的细胞，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.2离心后去上清液，并加入100uL标准品封闭液(10个样品)，样品梯度稀释液(10个 样品)，剩余2个离心管中加入FACS buffer(阳性对照及阴性对照)，涡旋混匀。
4.3.3室温避光孵育30分钟。
4.3.4孵育完，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.5去上清液，在10个标准品封闭液离心管，10个样品稀释液离心管，1个阳性对照 离心管中加入100uL的FACS buffer和1uL IGD-PE(11-26C),阴性对照中加入1uL FACSBuffer。
4.3.6室温避光孵育15分钟。
4.3.7孵育完，加入900uL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.8去上清液，加入1mL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.9去上清液，加入500uL的FACS buffer，混匀后于Attune○RNxT声波聚焦流式细胞 仪检测。
4.4.0上机检测：记录22个样品阳性PE信号的信号中值(Median)；详见表3；
根据IgD标准样品的浓度和样品阳性PE信号的信号中值制作标准曲线，详见图3；然后 依据标准曲线和待测样品的PE信号的信号中值估算待测样品的浓度，详见表4。
表3
| IgD标准品 | 浓度(mg/ml) | PE荧光中值 |
| 样品1 | 0.08 | 7131 |
| 样品2 | 0.04 | 8255 |
| 样品3 | 0.02 | 7587 |
| 样品4 | 0.01 | 8723 |
| 样品5 | 0.005 | 7848 |
| 样品6 | 0.0025 | 9365 |
| 样品7 | 0.00125 | 9404 |
| 样品8 | 0.000625 | 10976 |
| 样品9 | 0.0003125 | 17861 |
| 样品10 | 0.00015625 | 34764 |
| 阳性对照 | 1E-21 | 94437 |
表4
结论:通过流式细胞仪定量检测后的待测抗体的浓度为5.44mg/ml。与传统方法BCA测定的浓度一致。
实施例3二抗荧光检测法
1.试剂与样品:
检测抗人CD4(克隆:OKT4)抗体的浓度(未知浓度),
标准品:已定量抗人CD4(克隆:OKT4)抗体:浓度2mg/mL；用标准品制作1:25(80ug/mL),1:50(40ug/mL), 1:100(20ug/mL),1:200(10ug/mL),1:400(5ug/mL),1:800(2.5ug/mL),1:1600(1.25ug/mL),1:3200(625ng/mL), 1:6400(312.5ng/mL),1:12800(156.25ng/mL)梯度稀释标准液；
样品:用未知浓度抗人CD4(克隆:OKT4)抗体制作检测样品:1:25,1:50,1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600, 1:3200,1:6400,1:12800稀释液
阴性对照:抗小鼠IgG-PE单染。
2.实验室环境和安全控制
2.1实验室温湿度要求：温度在15℃-30℃范围内，湿度在40％-80％范围内。
2.2安全控制：进行操作检测或分析实验时，需穿戴手套(必要时着双层手套)及其它必 要的防护装备(例如口罩)，当手套污染时，需更换新手套，手套不可清洗或消毒后再使用； 实验室的工作人员在每天工作结束后，应以5％的漂白水(或75％酒精)擦拭消毒工作台面， 并将所有使用过的器具进行清洁归位。
5质量控制
5.1阴性对照：生产无关抗体的细胞上清，或者细胞培养基。
3.2空白：不加任何抗体。
3.3频率：每次实验操作。
3.4结果要求：阳性对照品的信号强度明显低于阴性对照品的信号强度。
6操作程序
4.1试剂和仪器
4.1.1主要试剂：FACS buffer，红细胞裂解液。
4.1.2主要耗材：2mL离心管、移液枪、枪头。
4.1.3主要仪器：超净工作台、离心机，移液枪、Acoustic Focusing Cytometernal(流式细 胞仪器)。
4.2小鼠脾脏准备阶段
4.2.1 FACS buffer
4.2.2细胞准备：取小鼠脾脏，脾脏时尽量不要附带脂肪组织，放置于40um(淋巴细胞) 或100um(目标细胞为DC，巨噬细胞,单核细胞等)滤网内，加入10mL RPMI 1640(10％FBS) 培养基进行研磨，收集研磨滤液。(注意：研磨过程中要注意不可过于用力将滤网戳破。)
4.2.3离心机4℃预冷
4.3抗体流式检测操作流程
4.3.1取21个2mL的离心管，加入100uL步骤4.2.2准备的细胞，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.2离心后去上清液，并加入100uL梯度稀释标准液(10个样品)，样品梯度稀释液(10 个样品)，剩余1个离心管中加入FACS buffer(阴性对照),涡旋混匀。
4.3.3室温避光孵育30分钟。
4.3.4孵育完，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.5去上清液，在10个标准品封闭液离心管，10个样品稀释液离心管，1个阴性对照 离心管中加入100uL的FACS buffer和1uL抗小鼠IgG-PE。
4.3.6室温避光孵育15分钟。
4.3.7孵育完，加入900uL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.8去上清液，加入1mL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟。
4.3.9去上清液，加入500uL的FACS buffer，混匀后于Attune○RNxT声波聚焦流式细胞 仪检测。
4.4.0上机检测：记录21个样品阳性PE信号的信号中值(Median)。
Claims (9)
1.一种使用流式细胞仪定性/定量检测目标抗体浓度的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1）取目标抗体标准样品进行多倍稀释，获得多个标准样品溶液，在该多个标准样品溶液中加入目标抗原进行封闭，然后在其中加入荧光标记的目标抗体并测试其阳性荧光信号值，采用多个标准样品溶液的浓度与最终获得的阳性荧光信号值制作标准曲线；
步骤2）取待测样品溶液，在该待测样品溶液中加入目标抗原进行封闭，然后在其中加入荧光标记的目标抗体或荧光标记的抗IgG的抗体并测试其阳性荧光信号值，根据步骤1）获得的标准曲线估算待测样品溶液中的目标抗体浓度；其中，抗IgG的抗体和目标抗体Fc种属相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标抗体为杂交瘤或CHO细胞培养上清中的抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标抗原为小鼠脾脏细胞或人血淋巴细胞样品或抗原偶连的磁珠或微球。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
步骤a）准备小鼠脾脏细胞；取小鼠脾脏，放置于滤网内，加入培养基进行研磨，收集研磨滤液；
步骤b）取目标抗体标准样品进行N倍稀释获得N个梯度稀释标准封闭液，取待测样品溶液分别进行N倍稀释获得N个梯度稀释待测样品，其中，N不小于5，；
步骤b）取2N+2个离心管，分别加入定量的步骤a）准备的细胞研磨滤液，离心；
步骤c）离心后去上清液，N个离心管内分别加入N个梯度稀释标准封闭液， N个离心管内分别加入N个梯度稀释待测样品，剩余2个离心管中加入FACS buffer 作为阳性对照及阴性对照, 涡旋混匀，室温避光孵育，离心2分钟；
步骤d）去上清液，在N个目标抗体标准样品封闭液离心管、N个待测样品稀释液离心管、1个阳性对照离心管中加入定量的荧光标记的目标抗体, 阴性对照中加入定量的缓冲溶液，
室温避光孵育，孵育完，离心；
步骤e）记录2N+2样品阳性PE信号的信号中值。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中：取小鼠脾脏，脾脏时尽量不要附带脂肪组织，放置于 40um(淋巴细胞)或100um(目标细胞为DC，巨噬细胞, 单核细胞等)滤网内，加入 10mL RPMI 1640 (10%FBS)培养基进行研磨，收集研磨滤液。
6.根据要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤b）的具体步骤为：目标抗体的浓度2mg/mL，用标准品制作 1:25 (80ug/mL), 1:50 (40ug/mL), 1:100 (20ug/mL), 1:200(10ug/mL), 1:400 (5ug/mL), 1:800 (2.5ug/mL), 1:1600 (1.25ug/mL), 1:3200(625ng/mL), 1:6400 (312.5ng/mL), 1:12800 (156.25ng/mL)梯度稀释标准封闭液；
用未知浓度待测样品获得1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400，1：12800稀释液。
7.根据要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤c）的具体步骤为：离心后去上清液，并加入100uL标准品封闭液(10个样品)，样品梯度稀释液(10个样品)，剩余2个离心管中加入FACS buffer (阳性对照及阴性对照), 涡旋混匀；室温避光孵育30分钟；孵育完，4℃，3500rpm离心2分钟。
8.根据要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤d）的具体步骤为：去上清液，在10个标准品封闭液离心管，10个样品稀释液离心管，1个阳性对照离心管中加入100uL的FACSbuffer和1uL 荧光标记的目标抗体, 阴性对照中加入1uL FACS Buffer；室温避光孵育15分钟；孵育完，加入900uL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟；去上清液，加入1mL的FACS buffer，混匀，4℃，3500rpm离心2分钟；去上清液，加入500uL的FACS buffer，混匀后于Attune○RNxT声波聚焦流式细胞仪检测。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤d）的具体步骤为：去上清液，在N个目标抗体标准样品封闭液离心管、N个待测样品稀释液离心管、1个阳性对照离心管中加入定量的荧光标记的抗IgG抗体, 阴性对照中加入定量的缓冲溶液，室温避光孵育，孵育完，离心。
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