MX2013011428A - Ensayos de receptores de esteroides para detectar celulas tumorales. - Google Patents

Ensayos de receptores de esteroides para detectar celulas tumorales.

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Abstract

Se describen métodos para la detección, enumeración y análisis de células tumorales circulantes que expresan receptores de esferoides, particularmente receptores de estrógeno; estos métodos son útiles para la exploración y determinación de las etapas del cáncer, desarrollo regímenes de tratamiento y para monitorear las respuestas al tratamiento, recurrencia del cáncer o similares; además, se proporcionan kits de pruebas que facilitan la detección, enumeración y análisis de dichas células tumorales circulantes.

Description

ENSAYOS DE RECEPTORES DE ESTEROIDES PARA DETECTAR CÉLULAS TUMORALES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con los campos de oncología y pruebas diagnósticas y, más particularmente, con métodos para exámenes de cáncer y para predecir y monitorear respuestas a tratamientos con quimioterapia, recurrencia del cáncer o similares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se calcula que hay por lo menos varios cientos de miles de nuevos casos de cáncer de mama cada año. Actualmente, dichos casos se confirman mediante medios quirúrgicos tales como la colección del tumor o del tejido de la mastectomia, por'medio de seccionar dicho tejido en bloques de parafina y usar métodos inmunohistoquímicos para evaluar y confirmar la presencia de proteínas receptoras de esferoides en ese tejido. Debido al procedimiento quirúrgico, esos métodos no se usan para monitorear la progresión del estado de la enfermedad durante el curso del tratamiento. Estos métodos se han mejorado a lo largo de los años, de manera que se pueden evaluar diferentes características del tejido, tales como receptor de progesterona y estado de HER/2-neu, así como confirmar la presencia de epitopos de receptor de estrógeno. Pero en todos los casos, esa evaluación requiere un procedimiento quirúrgico. Además, en los casos de pacientes cuyo tejido mamario fue retirado en las primeras etapas del tratamiento, estos métodos, sencillamente, no están disponibles.
Las células tumorales circulantes ("CTC") están presentes en la sangre de pacientes con cáncer de mama metastásico y se pueden recolectar durante el curso de tratamiento de un paciente. Esas células se pueden analizar para determinar su estado de HER/2-neu. Sin embargo, hasta la fecha, no existen métodos para determinar la presencia de epitopos de las regiones terminales N y C del receptor de estrógeno de dichas CTC. Estos métodos se encuentran en la siguiente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 Imágenes de muestras de paciente que muestran CTC positivas para receptor a de estrógeno.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención incluye un método para clasificar células tumorales circulantes de un paciente con cáncer metastásico; el método comprende los pasos de: a) obtener un espécimen biológico (sangre y médula ósea) del paciente; b) el espécimen biológico se mezcla con un ligando que reacciona específicamente con células tumorales circulantes, con la exclusión sustancial de otros componentes de la muestra, y permite la separación de dichas células tumorales circulantes unidas de otros componentes de la muestra del espécimen biológico; c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con por lo menos un reactivo que se una específicamente a las rrmestras de la etapa (b); d) poner en contacto la muestra de la etapa (c) con un agente que tenga afinidad de unión con receptores de esteroides en las células; y e) analizar la muestra para determinar la presencia de células tumorales circulantes que expresen receptores de esteroides.
Como se usa en la presente descripción, el término muestras biológicas incluye, pero no se limita a, sangre completa, orina, suero, plasma, esputo, líquido cerebroespinal, liquido amniótico, fluidos de lavados y médula ósea. Las muestras biológicas preferidas son sangre completa, orina, plasma, esputo y médula ósea, con mayor preferencia, sangre completa, orina, plasma y esputo, con mayor preferencia, sangre completa.
El término "ligando" se refiere a proteínas que unen marcadores de superficie celular de CTC, que incluyen, pero no se limitan a, moléculas de adhesión tales como E cadherina, N cadherina, así como anticuerpos monoclonales de EpCAM, y similares. Los ligandos preferidos incluyen anticuerpos de EpCAM. Además, el ligando puede comprender "partículas con respuesta magnética". Las partículas con respuesta magnética son sustancias que facilitan la separación magnética. Típicamente, dichas partículas son composiciones metálicas u organometálicas. Opcionalmente, pueden estar cubiertas con un polímero, preferentemente, un polímero de origen biológico tal como BSA. Los complejos del ligando y las partículas con respuesta magnética se pueden unir a etiquetas detectables que incluyen, pero no se limitan a, etiquetas fluorescentes. Una descripción más detallada de partículas con respuesta magnética se encuentra en la patente de los Estados Unidos núm. 5,985,153, titulada "Magnetic Separation Apparatus and ethods for Employing an Internal Magnetic Capture Gradient and an External Transport Forcé", la cual se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.
El término "otros componentes de la muestra" se refiere a componentes de las muestras biológicas que no sean células tumorales circulantes. Dichos componentes incluyen, pero no se limitan a, glóbulos blancos, glóbulos rojos normales, leucocitos, células endoteliales, células sin núcleo y similares.
El término "reactivo" se refiere a una sustancia que diferencia entre diferentes tipos de células. Ejemplos de reactivos incluyen, pero no se limitan a, tinturas tales como DAPI, bromuro de etidío y naranja de acridina, y sondas tales como CD 45, CD41 , PAC-1 , CD4, CD8 CD56, CD146, CD34, CD38, citoqueratina y similares.
El término "agente" se refiere a anticuerpos de regiones particulares del receptor de esteroides. Si se están analizando muestras biológicas para determinar si hay CTC de una paciente con cáncer de mama con estrogeno positivo, se usan los anticuerpos de las regiones N-terminal y C-terminal del receptor de estrogeno. Los anticuerpos de la región N-terminal incluyen, pero no se limitan a, ID5, CF1 1 , E1 15 (rb mono), SP-1 (rb mono), ER1 19.3 y similares. Los anticuerpos de la región N-terminal preferidos son ID5 y E1 15 (rb mono). Los anticuerpos de la región C-terminal incluyen, pero no se limitan a, H222, F10, TE1 1 1.5D1 1. El anticuerpo preferido de la región C-terminal es H222. Ver M. Pavao et al. Anticuerpos del receptor de estrogeno: especificidad y utilidad en la detección, localización y análisis del receptor de estrogeno a y ß; Esteroides 66 (2001 ) 1-16 para otros anticuerpos monoclonales que son útiles en esta invención.
El término "receptores de esteroides" tiene su significado habitual. Los receptores de esteroides preferidos son la progesterona, testosterona y receptores de estrogeno. Los receptores de esteroides preferidos particularmente son todos los subtipos del receptor de estrogeno, particularmente el receptor de estrogeno a.
A menos que en la presente descripción se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos que se usan en relación con la presente invención tendrán los significados comúnmente entendidos por aquellos con experiencia en la materia.
El aislamiento de células tumorales circulantes de sangre periférica mediante captura inmunomagnética con partículas magnéticas es un proceso de múltiples etapas que comienza con la estabilización y anticoagulación de la muestra de sangre. Después, se realiza una captura magnética inmune y aislamiento de las células objetivo con una partícula ferromagnética conjugada a un anticuerpo monoclonal especifico epitelial. Para identificar y clasificar las poblaciones celulares se usa etiquetado fluorescente de las células objetivo y/u otros marcadores de clasificación con tinturas y anticuerpos conjugados de tintura fluorescente específicos para la célula de evento poco común objetivo y antígenos importantes para la biología de las células. Finalmente, las células se visualizan mediante localización magnética en un cartucho con una ventana adecuada para la identificación de eventos raros y análisis con microscopía fluorescente, con software que mide las señales fluorescentes generadas del análisis microscópico de las células de evento poco común objetivo.
Adicionalmente, la invención incluye un kit de pruebas para explorar una muestra de paciente a fin de determinar la presencia de células tumorales circulantes que expresan un receptor de esteroides; el kit comprende: a) un ligando que reacciona específicamente con células tumorales circulantes, con la exclusión sustancial de otros componentes de la muestra, y permite la separación de dichas células tumorales circulantes unidas de otros componentes de la muestra del espécimen biológico; b) por lo menos un reactivo que une específicamente una o ambas células tumorales circulantes y otros componentes de la muestra de una paciente c) un agente que tiene afinidad de unión con receptores de esteroides en las células tumorales circulantes de la paciente.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para entender mejor esta invención. Estos ejemplos son solamente para propósitos ilustrativos y no se deben interpretar como limitantes del ámbito de la invención de forma alguna.
Ejemplo Anticoagulación y preservación de muestras de sangre: Se usó el tubo CellSave® disponible comercialmente para colectar muestras de sangre para esta determinación. Este tubo contiene EDTA de sodio, un anticoagulante, y agentes conservantes de la sangre que estabilizan las células objetivo en la muestra mejorando la capacidad del ensayo para detectar células tumorales circulantes intactas. Este tubo de colección facilita el envío de muestras a laboratorios distantes para su análisis, al estabilizar las células a temperatura ambiente por períodos de hasta 96 horas. Las cuentas publicadas detallan la importancia del uso de un conservante para impedir la fragmentación de células tumorales circulantes observadas en la sangre periférica de pacientes con cánceres de tejido sólido tales como adenocarcinoma de mama. Estos métodos de preservación son compatibles, además, con la detección de proteina receptora de estrógeno en estas células de evento poco común.
Captura ferromagnética de células objetivo Se usó ferrofluido unido a un clon anticuerpo VU-1 D9 anti-EpCAM como parte del kit de Célula Epitelial CellSearch® disponible comercialmente para localizar células tumorales circulantes en sangre periférica. Este kit enriquece las células de evento poco común a partir de tan poco como cinco células en una muestra de sangre de 7.5 mililitros que contiene aproximadamente 30,000,000 a 50,000,000 células de sangre con núcleo hasta un volumen de trabajo menor que 0.5 mililitros con aproximadamente 2,000 a 3,000 leucocitos, y un enriquecimiento celular objetivo resultante mayor que 15,000 veces. Este volumen reducido permite, entonces, teñir con reactivos fluorescentes para identificar y clasificar las células de evento poco común capturadas.
Tintura de células capturadas: La configuración estándar del kit CellSearch® contiene un reactivo en base a saponina para permeabilizar las membranas celulares y nucleares de las células intactas, lo que permite el etiquetado de proteínas intracelulares y nucleares. La tintura 4'6'diamidinofenilindol se usa como una tintura específica para ADN con par base AT, que es fluorescente en el rango UV cuando se une a los núcleos celulares. Esto es usado por el sistema para identificar células con núcleo presentes en la muestra aislada. Los anticuerpos monoclonales de anticitoqueratina conjugados a tinturas fluorescentes, tales como ficoeriterina o fluoresceína, se usan como marcadores específicos epiteliales para identificar las células tumorales de evento poco común en una población de elementos sanguíneos. Para impedir la contaminación de los glóbulos blancos por el análisis, se usó un conjugado fluorescente específico para CD45, un antígeno común de leucocitos.
Reactivos específicos de receptor de estrógeno: Los anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente para las regiones N-terminal y C-terminal del receptor de estrógeno alfa fueron proporcionados y conjugados a ficoeriterina, y titulados contra la línea celular de cáncer de mama MCF-7 cultivada bajo condiciones de cultivo sin estrógeno. Se observó que los clones de anticuerpo H222, SP-1 , 1 D5 y E1 15 trabajan en el sistema modelo de células MCF-7 puntiformes en las muestras normales de sangre de donante. Se demostró, además, que estos clones son positivos en muestras de pacientes con cánceres de mama avanzados, como se determinó en el sistema CellSearch®.
Análisis Todas las muestras de donantes y de pacientes se analizaron en el Analizador II CelITracks®, un sistema de imágenes automatizado que explora células localizadas en una cámara de análisis como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 7,011 ,794, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad. Se procesaron las imágenes y se presentaron imágenes de células tumorales circulantes candidatas para evaluación por parte del operador. Se determinó que todas las células eran positivas para DAPI y citoqueratina, así como negativas para CD45. Las células identificadas como células tumorales circulantes se clasificaron, después, como positivas o negativas para receptor de estrógeno u otro receptor de esteroides, dependiendo de los reactivos usados. La localización nuclear de la señal fluorescente se usó como criterio morfológico, al hacer coincidir el análisis usado en inmunohistoquimica en secciones de parafina.
Todos los anticuerpos comerciales específicos para receptor de estrógeno alfa evaluados en el sistema modelo demostraron ser reactivos en muestras de pacientes. Una serie de pacientes con cáncer de mama se evaluó con el anticuerpo monoclonal de conejo E115 (Epitomics Inc.) conjugado a ficoeriterina, así como un anticuerpo monoclonal conjugado de fluoresceína al marcador de tumor HER/2-neu como lo define el anticuerpo monoclonal Her-81 de la Universidad de Texas. Se realizaron diez exámenes de muestras con sangre de donante seleccionada con células MCF-7 como control del ensayo. Todas las muestras control fueron positivas para CTC, con un promedio de 78 % +/- 16 % de las células seleccionadas positivas para receptor de estrógeno. Los datos de la paciente con cáncer de mama se resumen en la Tabla 1. La Figura 1 es una galería de imágenes típicas de CTC del Analizador II CelITracks® obtenidas de muestras de pacientes.
Tabla 1 Resumen de una serie piloto de pacientes con cáncer de mama

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un método para clasificar células tumorales circulantes de una paciente con cáncer metastásico; el método comprende las etapas de: a) proveer un espécimen biológico previamente obtenido (sangre y médula ósea); b) poner en contacto el espécimen biológico mezclándolo con un ligando que reacciona específicamente con células tumorales circulantes, con la exclusión sustancial de otros componentes de la muestra, que permite la separación de dichas células tumorales circulantes unidas de otros componentes de la muestra del espécimen biológico; c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con por lo menos un reactivo que se une específicamente a las muestras de la etapa (b); d) poner en contacto la muestra de la etapa (c) con un agente que tenga afinidad de unión con receptores de esteroides en las células; y e) analizar la muestra para determinar la presencia de células tumorales circulantes que expresen receptores de esteroides.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente la etapa de determinar el número de células tumorales circulantes que expresan los receptores de esteroides.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente que reacciona específicamente con células tumorales circulantes se acopla a una o ambas regiones N-terminal y C-terminal de dichos receptores de esteroides en las células tumorales circulantes.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el reactivo se selecciona del grupo que consiste en DAPI, citoqueratina y CD45 neg.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ligando se une específicamente a un epítopo de adhesión a célula epitelial en la célula tumoral.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ligando comprende partículas con respuesta magnética.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra de la etapa (e) se analiza itiediante por lo menos un proceso seleccionado del grupo que consiste en citometría de flujo multiparamétrica, microscopía inmunofluorescente, citometría de escaneo por láser, análisis de imágenes base en campo claro, análisis de imágenes espectrales, análisis manual de células, análisis CELLSTRACKS®, y análisis automatizado de células.
8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende adicionalmente someter el producto de la etapa (b) a un campo magnético.
9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque las partículas con respuesta magnética son coloidales.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en ID5, CF1 1 , E115 (rb mono), ER 19.3 y SP-1 (rb mono).
1 1. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en H222, F10 y TE1 1 1 .5D11
12. Un kit de pruebas para examinar una muestra de paciente para determinar la presencia de células tumorales circulantes que expresen un receptor de esteroides; el kit comprende: a) un ligando que reacciona específicamente con células tumorales circulantes, con la exclusión sustancial de otros componentes de la muestra, y permite la separación de dichas células tumorales circulantes unidas de otros componentes de la muestra del espécimen biológico; b) por lo menos un reactivo que une específicamente una o ambas células tumorales circulantes y otros componentes de la muestra de una paciente; c) un agente que tenga afinidad de unión con receptores de esteroides en las células tumorales circulantes de la paciente.
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