JP2014513283A - 腫瘍細胞を検出するためのステロイド受容体アッセイ - Google Patents

Abstract

ステロイド受容体、特にエストロゲン受容体を発現する循環腫瘍細胞の検出、列挙及び解析方法が開示される。これらの方法は、癌のスクリーニング、癌の病期分類、治療レジメンの策定、及び治療応答、癌再発又はこれらに類するもののモニタリングに有用である。そのような循環腫瘍細胞の検出、列挙及び解析を容易にする試験キットもまた提供される。

Description

本発明は腫瘍学の分野及び診断試験に関し、より具体的には癌をスクリーニングするための方法、及び化学療法治療応答、癌再発、又はこれらに類するものを予測しモニタするための方法に関する。

推定によると、毎年少なくとも数１０万例の乳癌の新規症例が存在する。そのような症例は現在、腫瘍集などの外科的手段、又は乳房切除によって確認されている。乳房切除では、この種の組織をパラフィン塊に入れ、免疫組織化学的な方法を用い、この種の組織内のステロイド受容体タンパク質の存在を評価して確認する。そのような方法は、外科的処置であるという理由から、治療コース全体を通じて疾病状態の進行をモニタする目的には使用されない。これらの方法は、何年にもわたり改善されてきたため、組織の様々な特性（例えば、プロゲステロン受容体及びＨＥＲ／２−ｎｅｕ状況）を評価でき、更には、エストロゲン受容体のエピトープの存在を確認することもできる。ただし、あらゆる場合において、この評価は外科的手技を必要とする。更に、初期に胸部組織を治療で除去した患者の場合は、これらの方法をどうしても利用できない。

循環腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）は、転移性乳癌患者の血液中に存在し、患者の治療コース全体にわたって収集できる。これらの細胞については、ＨＥＲ／２−ｎｅｕ状況を解析できる。ただし、現在までのところ、そのようなＣＴＣのエストロゲン受容体のＮ末端領域及びＣ末端領域のエピトープの存在を判別する方法はない。これらの方法は、下掲の発明に見出される。

エストロゲン受容体αに対してＣＴＣ陽性を示す患者サンプルの画像。

本発明は転移性癌の患者からの循環腫瘍細胞を特徴付ける方法を含み、本方法は
ａ）患者から生物学的試料（血液及び骨髄）を採取する段階と、
ｂ）生物学的試料を循環腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドと接触させて他のサンプル成分が実質的に除外されたような、結合された循環腫瘍細胞を生物学的試料の他のサンプル成分から分離させる段階と、
ｃ）段階（ｂ）のサンプルに特異的に結合する少なくとも１種の試薬に、段階（ｂ）のサンプルを接触させる段階と、
ｄ）段階（ｃ）のサンプルを、細胞内のステロイド受容体に対する結合親和力を有する薬剤と接触させる段階と、
ｅ）サンプルを解析して、ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の存在を判別する段階と、を含む。

本明細書において生物学的サンプルという用語には、全血液、尿、血清、血漿、痰、脳脊髄液、羊水、洗浄液及び骨髄が包含されるが、これらに限定されない。好ましい生物学的サンプルは全血液、尿、血漿、痰及び骨髄であり、より好ましくは全血液、尿、血漿、痰であり、最も好ましくは全血液である。

用語「リガンド」は、ＣＴＣの細胞表面マーカーを結合するタンパク質を指し、粘着力分子、例えば、Ｅカドヘリン、Ｎカドヘリン、ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体、及びこれらに類するものを含むが、これらに限定されない。好ましいリガンドは、ＥｐＣＡＭ抗体を含む。更なるリガンドは「磁気応答粒子」を含んでいてもよい。磁気応答粒子は、磁気分離を容易にする物質である。そのような粒子は典型的に、金属組成物又は有機金属組成物であり、任意選択的に、ポリマー、好ましくはＢＳＡなどの生物学的起源のポリマーでコーティングされていてもよい。リガンド及び磁気応答粒子の複合体は、限定はされないが蛍光ラベルを含む、検出可能なラベルに結合していてもよい。磁気応答粒子の詳細な説明は、その全体が本明細書において参照により援用されている「Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ｍｅｈｔｏｄｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ａｎｄ ａｎ Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｆｏｒｃｅ」と題した米国特許第５，９８５，１５３号に記載されている。

用語「他のサンプル成分」は、循環腫瘍細胞以外の生物学的サンプルの成分を指す。そのような成分には、白血球、正常赤血球、白血球、血管内皮細胞、無核細胞、及びこれらに類するものが包含されるが、これらに限定されない。

用語「試薬」は、様々な種類の細胞を区別する物質を指す。ＤＡＰＩ、エチジウムブロミド及びアクリジンオレンジなどの染料、ＣＤ ４５、ＣＤ４１、ＰＡＣ−１、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４６、ＣＤ３４、ＣＤ３８、サイトケラチンなどのプローブ、及びこれらに類するものが包含されるが、これらに限定されない。

用語「薬剤」は、ステロイド受容体の特定の領域に対する抗体を指す。エストロゲン陽性乳癌患者由来のＣＴＣの生物学的サンプルを解析した場合、エストロゲン受容体のＮ末端領域及びＣ末端領域に対する抗体が使用される。Ｎ末端領域に対する抗体には、ＩＤ５、ＣＦ１１、Ｅ１１５（ｒｂモノラル）、ＳＰ−１（ｒｂモノラル）、ＥＲ１１９．３及びこれらに類するものが包含されるが、これらに限定されない。好ましいＮ末端領域の抗体は、ＩＤ５及びＥ１１５（ｒｂモノ）である。Ｃ末端領域に対する抗体には、Ｈ２２２、Ｆ１０、ＴＥ１１１．５Ｄ１１が包含されるが、これらに限定されない。Ｃ末端領域に対する好ましい抗体はＨ２２２である。本発明に有用な他のモノクローナル抗体については、Ｍ．Ｐａｖａｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α ａｎｄ β；Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ６６（２００１）１〜１６を参照のこと。

用語「ステロイド受容体」は、慣例的な意味を有する。好ましいステロイド受容体は、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体及びエストロゲン受容体である。特に好ましいステロイド受容体は、エストロゲン受容体、特にエストロゲン受容体αの全てのサブタイプである。

本明細書に規定されていない限り、本発明との関連で使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。

磁性粒子を用いて免疫磁力捕捉法（immunomagnetic capture）を介して循環腫瘍細胞を末梢血から単離するプロセスは多段階式であり、まず血液サンプルの安定化及び抗凝血から始める。次いで、上皮特異的モノクローナル抗体に強磁性粒子を接合して、標的細胞の免疫磁気捕捉及び単離を遂行する。標的細胞の蛍光標識、及び／又は染料を用いた他の特徴付けマーカー（characterization marker）、並びに細胞のバイオロジーに重要な標的稀事象細胞及び抗原に対して特異的な抗体を蛍光染料に接合したものを使用して細胞母集団を同定し、特徴付ける。最後に、稀事象の同定に適したウィンドウを備えたカートリッジ内で磁気を局在化し、標的稀事象細胞の顕微鏡解析で生成された蛍光信号を測定するソフトウェアを使用して蛍光顕微鏡検査法で解析して、細胞を視覚化する。

更に、本発明は、ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の存在を確認するために、患者サンプルをスクリーニングするための試験キットを包含し、この試験キットは
ａ）循環腫瘍細胞と特異的に反応して他のサンプル成分が実質的に除外されたような、結合された循環腫瘍細胞を生物学的試料の他のサンプル成分から分離させるリガンドと、
ｂ）循環腫瘍細胞及び患者の他のサンプル成分の一方又は両方を特異的に結合する少なくとも１種の試薬と、
ｃ）患者の循環腫瘍細胞においてステロイド受容体に対する結合親和力を有する薬剤と、を含む。

本発明をより良く理解できるよう、次の実施例を挙げる。これらの実施例は、例示のみを目的としたものであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。

血液サンプルの抗凝固及び保存：市販のＣｅｌｌＳａｖｅ（登録商標）チューブを使用して血液サンプルを収集し、この判別を行った。このチューブには、サンプル内の標的細胞を安定させ、アッセイが無傷の循環腫瘍細胞を検出する能力を増強するための、ナトリウムＥＤＴＡ、抗凝固剤、及び血液接合薬剤が含有されている。この回集チューブは、解析目的に対応するように室温で最大９６時間細胞を安定させ、遠方の実験室にサンプルを出荷するのを容易にする。胸部の腺癌などの固形組織癌を患う患者の末梢血において見られる、循環腫瘍細胞の断片化を阻止する。これらの保存方法はまた、これらの稀事象細胞上のエストロゲン受容体タンパク質の検出に対しても互換性を持つ。

標的細胞の磁性捕捉：抗ＥｐＣＡＭ抗体クローンＶＵ−１Ｄ９に結合された磁性流体を、市販のＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）上皮細胞キットの一部として使用して、循環腫瘍細胞を末梢血から限局した。このキットは、約３０，０００，０００〜５０，０００，０００個の有核血球を含有した７．５ミリリットルの血液サンプル中のわずか５つの細胞からの稀事象細胞を、約２，０００〜３，０００個の白血球を有する０．５ミリリットル未満の作用容積に濃縮することで、結果として濃縮率が１５，０００倍を超える標的細胞が得られる。こうして容積を減少させた後は、蛍光試薬で染色し、捕捉された稀事象細胞を同定して特徴付けることができる。

捕捉された細胞の染色：標準ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）キットコンフィギュレーションは、無傷細胞の細胞膜及び核膜の透過化処理、並びに細胞内タンパク質及び核タンパク質の標識を可能にする、サポニン系試薬を含む。染料４’６’ジアミジノフェニルインドールを、細胞核と結合されているときにＵＶ範囲内で蛍光を発するＡＴ塩基対、ＤＮＡ特異的染料（AT base pair，DNA specific dye）として使用した。これを、単離されたサンプルに存在する有核細胞を同定するシステムで使用した。フィコエリトリン又はフルオレセインなどの蛍光染料に接合された抗サイトケラチンモノクローナル抗体を上皮特異的マーカーとして使用して、血液要素の母集団内の稀事象腫瘍細胞を同定する。ＣＤ４５（白血球共通抗原）に特異的な蛍光接合体を使用して、汚染した白血球を解析対象から除外した。

エストロゲン受容体特異試薬：エストロゲン受容体αのＮ末端領域及びＣ末端領域の両方に対する市販のモノクローナル抗体を供給し、フィコエリトリンに接合して、エストロゲン枯渇培養条件において生育した培養ＭＣＦ−７乳癌細胞系に対して滴定した。抗体クローンＨ２２２、ＳＰ−１、１Ｄ５及びＥ１１５は、正常ドナーの血液サンプル内のスパイクＭＣＦ−７細胞の両方のモデルシステムにおいて作用することが明らかにされた。また、これらのクローンは、進行した乳癌患者のサンプルにおいてＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで定量されたように陽性であることが実証された。

解析：全体が本明細書に参照により援用されている米国特許第７，０１１，７９４号に記載されているとおりに、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）アナライザＩＩ、即ち、解析チャンバー内で限局された細胞を走査する自動撮像システムで、全てのドナー及び患者のサンプルを解析した。画像を処理し、オペレーター評価の目的に候補の循環腫瘍細胞の画像を提示した。全ての細胞のＤＡＰＩ陽性、サイトケラチン陽性、及びＣＤ４５陰性を判断した。その後、使用された試薬に応じて、循環腫瘍細胞として同定された細胞を、エストロゲン受容体又は他のステロイド受容体に対して陽性もしくは陰性であるとスコアした。蛍光信号の核限局化を形態学的基準として使用し、パラフィン切片内での免疫組織化学において使用された解析を照合する。

エストロゲン受容体αに対して特異的な市販の抗体をモデルシステムで評価したところその全てが、患者サンプルにおいて反応を呈することが明らかにされた。フィコエリトリンに接合したＥ１１５ウサギモノクローナル（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）のほか、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓから寄贈されたモノクローナル抗体Ｈｅｒ−８１で定義されたＨＥＲ／２−ｎｅｕ腫瘍マーカーに対するフルオレセイン接合モノクローナルを用いて、一連の乳癌患者を評価した。ＭＣＦ−７細胞でスパイクされたドナー血液をアッセイの対照として用い、サンプル解析（sample runs）を１０回実行した。対照サンプルは全てＣＴＣに対して陽性であり、スパイクされた細胞の平均７８％±１６％はエストロゲン受容体に対して陽性であった。乳癌患者のデータを表１に要約する。図１ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザＩＩ（登録商標）で得られた、患者サンプルの典型的なＣＴＣ画像のギャラリーである。

〔実施の態様〕
（１） 転移性癌の患者からの循環腫瘍細胞を特徴付ける方法であって、
ａ）前記患者から生物学的試料（血液及び骨髄）を採取する段階と、
ｂ）他のサンプル成分を実質的に除外して、循環腫瘍細胞と特異的に反応し、そのような結合された循環腫瘍細胞を前記生物学的試料の他のサンプル成分から分離させるリガンドと、前記生物学的試料を接触させる段階と、
ｃ）段階（ｂ）の前記サンプルに特異的に結合する少なくとも１種の試薬に、段階（ｂ）の前記サンプルを接触させる段階と、
ｄ）段階（ｃ）の前記サンプルを、細胞内のステロイド受容体に対する結合親和力を有する薬剤と接触させる段階と、
ｅ）前記サンプルを解析して、ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の存在を判別する段階と、
を含む方法。
（２） 前記ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の数を特定する段階を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（３） 循環腫瘍細胞と特異的に反応する薬剤を、前記循環腫瘍細胞内の前記ステロイド受容体のＮ末端領域及びＣ末端領域の一方又は両方に連結する、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記試薬がＤＡＰＩ、サイトケラチン及びＣＤ４５陰性（CD45 neg）からなる群より選択される、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記リガンドが前記腫瘍細胞上の上皮細胞接着エピトープに特異的に結合する、実施態様１に記載の方法。

（６） 前記リガンドが磁気応答粒子を含む、実施態様１に記載の方法。
（７） 段階（ｅ）の前記サンプルが、マルチパラメーターフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野に基づく画像解析、スペクトル画像解析、手動細胞解析、ＣＥＬＬＳＴＲＡＣＫＳ（登録商標）解析、及び自動細胞解析からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって解析される、実施態様１に記載の方法。
（８） 段階（ｂ）の前記生成物を磁場にさらす段階を更に含む、実施態様６に記載の方法。
（９） 前記磁気応答粒子がコロイド状である、実施態様６に記載の方法。
（１０） 前記薬剤がＩＤ５、ＣＦ１１、Ｅ１１５（ｒｂモノ）、ＥＲ１１９．３、及びＳＰ−１（ｒｂモノ（rb mono））からなる群より選択される抗体である、実施態様１に記載の方法。

（１１） 前記薬剤が、Ｈ２２２、Ｆ１０及びＴＥ１１１．５Ｄ１１からなる群より選択される抗体である、実施態様１に記載の方法。
（１２） ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の存在について、患者サンプルをスクリーニングするための試験キットであって、
ａ）他のサンプル成分を実質的に除外して、循環腫瘍細胞と特異的に反応して、そのような結合された循環腫瘍細胞を前記生物学的試料の他のサンプル成分から分離させるリガンドと、
ｂ）循環腫瘍細胞及び患者の他のサンプル成分の一方又は両方に特異的に結合する少なくとも１種の試薬と、
ｃ）前記患者の前記循環腫瘍細胞においてステロイド受容体に対する結合親和力を有する薬剤と、
を含む試験キット。

Claims (12)

1. 転移性癌の患者からの循環腫瘍細胞を特徴付ける方法であって、
   ａ）前記患者から生物学的試料（血液及び骨髄）を採取する段階と、
   ｂ）他のサンプル成分を実質的に除外して、循環腫瘍細胞と特異的に反応し、そのような結合された循環腫瘍細胞を前記生物学的試料の他のサンプル成分から分離させるリガンドと、前記生物学的試料を接触させる段階と、
   ｃ）段階（ｂ）の前記サンプルに特異的に結合する少なくとも１種の試薬に、段階（ｂ）の前記サンプルを接触させる段階と、
   ｄ）段階（ｃ）の前記サンプルを、細胞内のステロイド受容体に対する結合親和力を有する薬剤と接触させる段階と、
   ｅ）前記サンプルを解析して、ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の存在を判別する段階と、
   を含む方法。
2. 前記ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の数を特定する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 循環腫瘍細胞と特異的に反応する薬剤を、前記循環腫瘍細胞内の前記ステロイド受容体のＮ末端領域及びＣ末端領域の一方又は両方に連結する、請求項１に記載の方法。
4. 前記試薬がＤＡＰＩ、サイトケラチン及びＣＤ４５陰性からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記リガンドが前記腫瘍細胞上の上皮細胞接着エピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
6. 前記リガンドが磁気応答粒子を含む、請求項１に記載の方法。
7. 段階（ｅ）の前記サンプルが、マルチパラメーターフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野に基づく画像解析、スペクトル画像解析、手動細胞解析、ＣＥＬＬＳＴＲＡＣＫＳ（登録商標）解析、及び自動細胞解析からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって解析される、請求項１に記載の方法。
8. 段階（ｂ）の前記生成物を磁場にさらす段階を更に含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記磁気応答粒子がコロイド状である、請求項６に記載の方法。
10. 前記薬剤がＩＤ５、ＣＦ１１、Ｅ１１５（ｒｂモノ）、ＥＲ１１９．３、及びＳＰ−１（ｒｂモノ）からなる群より選択される抗体である、請求項１に記載の方法。
11. 前記薬剤が、Ｈ２２２、Ｆ１０及びＴＥ１１１．５Ｄ１１からなる群より選択される抗体である、請求項１に記載の方法。
12. ステロイド受容体を発現する循環腫瘍細胞の存在について、患者サンプルをスクリーニングするための試験キットであって、
    ａ）他のサンプル成分を実質的に除外して、循環腫瘍細胞と特異的に反応して、そのような結合された循環腫瘍細胞を前記生物学的試料の他のサンプル成分から分離させるリガンドと、
    ｂ）循環腫瘍細胞及び患者の他のサンプル成分の一方又は両方に特異的に結合する少なくとも１種の試薬と、
    ｃ）前記患者の前記循環腫瘍細胞においてステロイド受容体に対する結合親和力を有する薬剤と、
    を含む試験キット。

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