CN102353777A - 人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,包括:人巨细胞病毒抗原包被的微孔板;梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液;以及酶标记的抗人IgG抗体。上述人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒中含有以国际单位IU为基础的梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液,检测过程中,利用该标准品溶液进行标准曲线制作,再根据样品所测得的数据,通过标准曲线计算出样品中人巨细胞病毒IgG抗体的含量,准确方便,对人巨细胞病毒相关疾病的预防及治疗具有重要的指导意义。此外,本发明还涉及一种人巨细胞病毒IgG抗体的检测方法。
Description
【技术领域】
本发明涉及医学和生物学检测领域,尤其涉及一种人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)是一种DNA病毒,属于人病原体疱疹病毒属。HCMV主要感染途径包括接触被感染病人的体液,同时也可通过胎盘传播或发生医源性传染,如输血、移植手术等。在发达和不发达国家的HCMV感染率在45~50%之间,个别国家和地区感染率超过90%。HCMV感染是医源性免疫抑制如器官移植病人和艾滋病患者出现并发症的主要原因,同时HCMV感染是导致胎儿先天畸形的重要病原之一,严重危害人类健康及优生优育。
HCMV感染期间会刺激人体免疫系统产生IgG及IgM等抗体,其中IgG抗体阳性是HCMV既往感染的标志,也是病毒潜伏的标志。因此开发人巨细胞病毒IgG抗体的检测试剂,可监测人巨细胞病毒IgG抗体水平变化,进而了解病毒的存在及感染状态,对于控制HCMV传播、促进优生优育、降低器官移植患者死亡率等具有重要意义。此外,该试剂还能用于HCMV抗体药物开发中的抗体效价的检测,具有生产实践意义。
目前对于HCMV抗体的检测方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedImmune Sorbed Assay,ELISA),荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等。其中,以ELISA法及化学发光法为主。ELISA法综合了操作简便、灵敏度高、特异性好、适用于常规实验室使用以及技术成熟等优点,最为常用。化学发光法需一定的仪器,对操作水平要求也较高,使用不方便。
传统开发的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒只能进行IgG抗体的定性分析,没有一种定量检测系统,因此实际应用受限。
【发明内容】
基于此,有必要提供一种能进行定量分析的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒。
一种人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,包括:人巨细胞病毒抗原包被的微孔板;梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液;以及酶标记的抗人IgG抗体。
优选的,人巨细胞病毒抗原包被的微孔板为人巨细胞病毒的PP150与PP52融合肽段包被的微孔板。
优选的,所述梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液包括浓度范围为0-10IU/mL的系列人巨细胞病毒IgG抗体溶液。
优选的,所述酶标记的抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。
优选的,所述试剂盒还包括如下组分中的至少一种:样品稀释液;洗涤液;显色液;以及终止液。
优选的,所述样品稀释液为含Tween-20、BSA和ProClin300的磷酸盐缓冲液;或者所述样品稀释液为含Tween-20、HSA和ProClin300的磷酸盐缓冲液。
优选的,所述洗涤液为含Tween-20及ProClin300中至少一种的磷酸盐缓冲液。
优选的,所述显色液为柠檬酸-磷酸盐缓冲液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、过氧化氢和二甲亚砜。
优选的,所述终止液为0.2~1M的硫酸。
上述人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒中含有以国际单位IU为基础的梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液,检测过程中,利用该标准品溶液进行标准曲线制作,再根据样品所测得的数据,通过标准曲线计算出样品中人巨细胞病毒IgG抗体的含量,准确方便,对HCMV相关疾病的预防及治疗具有重要的指导意义。
此外,还有必要提供一种能进行定量分析的人巨细胞病毒IgG抗体检测方法。
一种人巨细胞病毒IgG抗体的检测方法,包括如下步骤:
对微孔板进行人巨细胞病毒抗原的包被;
将样品血清或血浆进行稀释后加入至人巨细胞病毒抗原包被的微孔板中;
对人巨细胞病毒IgG抗体溶液进行浓度定标,将不同浓度梯度的人巨细胞病毒IgG抗体溶液加入至所述微孔板的其它板孔中,并设置空白对照孔;
将所述微孔板置于36℃~38℃环境中孵育55~95分钟后,洗涤3~5次;
向所述微孔板的各孔中加入酶标记的抗人IgG抗体,并于36℃~38℃的环境中孵育25~65分钟后,洗涤3~5次;
对所述微孔板进行显色处理,以空白对照孔为对照,读取各孔的吸光度值,并根据已浓度定标的人巨细胞病毒IgG抗体溶液的吸光度值计算样品血清或血浆中人巨细胞病毒IgG抗体的量。
上述检测过程中可以根据已知浓度的人巨细胞病毒IgG抗体溶液进行标准曲线制作,再根据样品血清或血浆所测得的数据,通过标准曲线计算出样品血清或血浆中人巨细胞病毒IgG抗体的含量,准确方便,对HCMV相关疾病的预防及治疗具有重要的指导意义。
【附图说明】
图1为人巨细胞病毒IgG抗体检测标准曲线。
【具体实施方式】
下面主要结合附图及具体实施例对人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒和检测方法作进一步详细的说明。
本实施方式的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,包括以下组分:
人巨细胞病毒(HCMV)抗原包被的微孔板:优选的,采用HCMV PP150与PP52融合肽段作为抗原包被微孔板,其中,每孔含有0.1~1μg的抗原。在其它实施方式中,还可以采用HCMV的其它肽段作为抗原进行微孔板的包被。
梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液:优选的,采用WHO(世界卫生组织)的国际单位IU进行定标,标准品溶液可以包括浓度范围为0-10IU/mL的系列人巨细胞病毒IgG抗体溶液,如浓度分别为7IU/mL、5IU/mL、3IU/mL、1IU/mL、0.4IU/mL及0IU/mL的人巨细胞病毒IgG抗体溶液,或者浓度分别为8IU/mL、4IU/mL、2IU/mL、1IU/mL、0.4IU/mL及0IU/mL的人巨细胞病毒IgG抗体溶液。
样品稀释液:本实施方式的样品稀释液为pH 7.0~7.4浓度为0.02~0.1M的磷酸盐缓冲液。优选的,还可以向该磷酸盐缓冲液中还加入有0.4~0.6%(wt%)的Tween-20、0.5~2%(wt%)的BSA或、以及0.1~0.6%(wt%)的ProClin 300作为防腐剂或稳定剂等。
洗涤液:本实施方式的洗涤液为pH 6.8~7.4的0.02~0.1M磷酸盐缓冲液。优选的,还可以向该磷酸盐缓冲液中还加入有0.4%~0.6%(wt%)Tween-20和0.01~0.06%(wt%)的ProClin 300。
酶标记的抗人IgG抗体:本实施方式采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG单克隆抗体。在其他实施方式中,还可以采用碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等酶进行鼠或羊的抗人IgG抗体标记,再采用相应的显色液进行显色反应。
显色液:对应上述酶标记抗抗体,本实施方式的显色液包括3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢、二甲亚砜和pH 3.5~3.8的柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
终止液:本实施方式的终止液为0.2~1M的硫酸。
在其他优选的实施方式中,该人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,仅包括HCMV抗原包被的微孔板、酶标记的抗人IgG抗体和采用WHO的国际单位IU进行定标的梯度浓度人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液,以及样品稀释液、洗涤液、显色液及终止液的配置说明书等。
本实施方式还提供了一种人巨细胞病毒IgG抗体的检测方法,具体包括如下步骤:
步骤S1:对微孔板进行HCMV抗原的包被。
优选的,采用HCMV PP150与PP52融合肽段作为抗原包被微孔板,使每孔含有0.1~1μg的抗原。在其它实施方式中,还可以采用HCMV的其它肽段作为抗原进行微孔板的包被。
步骤S2:将样品血清或血浆进行稀释后加入至HCMV抗原包被的微孔板中。
用样品稀释液样品血清或血浆进行梯度稀释,一般稀释100~1000倍,再向板孔内分别加入100μl的已稀释的样品血清或血浆。
步骤S3:对人巨细胞病毒IgG抗体溶液进行浓度定标,将不同浓度梯度的人巨细胞病毒IgG抗体溶液加入至微孔板的其它板孔中,并设置空白对照孔。
优选的,采用WHO的国际单位IU进行定标,标准品溶液可以包括浓度分别为8IU/mL、4IU/mL、2IU/mL、1IU/mL、0.4IU/mL及0IU/mL的人巨细胞病毒IgG抗体溶液,或者采用其他浓度梯度的人巨细胞病毒IgG抗体溶液,如浓度分别为7IU/mL、5IU/mL、3IU/mL、1IU/mL、0.4IU/mL及0IU/mL的人巨细胞病毒IgG抗体溶液。
步骤S4:将微孔板置于36℃~38℃环境中孵育55~95分钟后,用洗涤液洗涤3~5次。
步骤S5:向微孔板的各孔中加入酶标记的抗人IgG抗体,并于36℃~38℃的环境中孵育25~65分钟后,用洗涤液洗涤3~5次。
优选的,可以采用辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠抗人IgG单克隆抗体。在其他实施方式中,还可以采用碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等酶进行鼠或羊的抗人IgG抗体标记,再采用相应的显色液进行显色反应。
步骤S6:对微孔板进行显色处理,以空白对照孔为对照,读取各孔的吸光度值,并根据已知浓度的人巨细胞病毒IgG抗体溶液的吸光度值计算样品血清或血浆中人巨细胞病毒IgG抗体的量。
可以根据已知浓度的人巨细胞病毒IgG抗体溶液制作标准曲线,再根据样品血清或血浆所测得的数据,通过标准曲线计算出样品血清或血浆中人巨细胞病毒IgG抗体的含量,准确方便,对HCMV相关疾病的预防及治疗具有重要的指导意义。
以下为人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒性能检测实施例部分:
一、提供人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其中试剂盒各组分如下:
HCMV PP150+PP52融合肽段包被的96孔酶标板,其中每孔含有融合肽段0.5μg。
梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液:包括浓度分别为8IU/mL、4IU/mL、2IU/mL、1IU/mL、0.4IU/mL及0IU/mL的人巨细胞病毒IgG抗体溶液;各浓度抗体溶液中加入有0.5%(wt%)的ProClin 300作为防腐剂及2%(wt%)酪蛋白作为稳定剂。
10×的浓缩洗涤液:pH 7.2的含5%(wt%)的Tween-20的0.5M磷酸盐缓冲液,加入0.5%(wt%)的防腐剂ProClin 300。
样品稀释液:pH 7.2浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液,其中,所述磷酸盐缓冲液中加入有0.5%(wt%)的Tween-20、1%(wt%)的BSA和0.5%(wt%)的ProClin300。
酶标记抗抗体:取HRP标记的鼠抗人IgG单克隆抗体,以棋盘滴定法进行优化,按合适的比例,如1∶2000,用pH 7.2的含1%(wt%)BSA和0.5%(wt%)Tween-20的0.05M磷酸盐缓冲液进行稀释。此外,还向酶标记抗抗体中加入0.5%的ProClin 300作为防腐剂。
显色液:pH为3.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢与二甲亚砜组成的混合液。
终止液:0.5M的硫酸。
二、操作流程
1.平衡:将试剂盒各组份及样品于室温平衡30分钟以上。
2.样品标记:将检测所需数目的微孔条放到酶标板框上并将微孔条对应的样品标列清楚。同时以人巨细胞病毒IgG抗体的标准品溶液进行实验。
3.样品稀释:用样品稀释液按800倍进行稀释。向各孔内分别加入100μl的已稀释样本血清或血浆。留一个孔为底物空白使用。
4.样品孵育:将样品于湿盒内37℃(±1℃)孵育60分钟(±5分钟)。孵育后,以洗涤液清洗板孔5次。
5.酶标记物孵育:于各孔内(底物空白孔除外)加入100微升酶标记抗抗体,湿盒内37℃(±1℃)孵育30分钟(±1分钟)。孵育后,以洗涤液清洗板孔5次。
6.加入显色液:于每孔内加入100μl显色液,包括底物空白孔。湿盒内37℃(±1℃)孵育15分钟(±1分钟)。
7.终止反应:每孔内加入100μl终止液,轻微振荡微孔板以混合溶液。
8.读取消光度:以底物空白孔为空白对照,60分钟内读取450nm的OD值。
9.试验结果判定
用已知人巨细胞病毒IgG抗体含量的标准品溶液进行标准曲线制作,再根据所测的OD值,通过标准曲线及方程计算出样品中人巨细胞病毒IgG抗体含量,以国际单位(IU/mL)表示。其中0IU/mL及0.4IU/mL标准品还可分别作为阴性及临界标准品,进行定性试验。
三、试剂盒定性检测
分别采用静脉注射人免疫球蛋白,人血白蛋白、人抗HCMV阳性血清及人抗HCMV阴性血清作为样品进行试验,检测有无交叉反应,特异性良好,结果如下表1。
表1
样品 | 总例数 | 阳性 | 阴性 | 阳性检出率 | 阴性检出率 |
静脉注射人免疫球蛋白 | 10 | 10 | 0 | 100% | 0 |
人血白蛋白 | 10 | 0 | 10 | 0 | 100% |
人抗HCMV阳性血清 | 10 | 10 | 0 | 100% | 0 |
人抗HCMV阴性血清 | 10 | 0 | 10 | 0 | 100% |
四、定量检测
将本试剂盒标准品溶液(8、4、2、1、0.4、0IU/mL)进行人巨细胞病毒IgG抗体的检测,设阴性对照孔和空白对照孔,按上述操作进行检测,重复5次对标准品的浓度和吸光度值进行双对数线性回归,绘制标准曲线,并确定线性范围,如图1。从图1可见,本试剂盒线性范围为0.055~6.99IU/ml,回归方程为y=1.2512x-1.7799,回归系数为0.9936,线性性能良好。
基于以上结果,进行临床样品的检测,如下表2,其中血浆1~3为临床阳性样品,4为临床阴性样品,皆来自广州儿童医院(样品编号为20091125-1至20091125-4),空白组不加样品。根据以上标准回归方程,可以计算得到样品的人巨细胞病毒IgG的含量。
表2
该人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒中含有以国际单位IU为基础的梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液,检测过程中,利用该标准品溶液进行标准曲线制作,再根据样品所测得的数据,通过标准曲线计算出样品中人巨细胞病毒IgG抗体的含量,准确方便,对HCMV相关疾病的预防及治疗具有重要的指导意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,包括:
人巨细胞病毒抗原包被的微孔板;
梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液;以及
酶标记的抗人IgG抗体。
2.如权利要求1所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,人巨细胞病毒抗原包被的微孔板为人巨细胞病毒的PP150与PP52融合肽段包被的微孔板。
3.如权利要求1所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述梯度浓度的人巨细胞病毒IgG抗体标准品溶液包括浓度范围为0-10IU/mL的系列人巨细胞病毒IgG抗体溶液。
4.如权利要求1所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述酶标记的抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。
5.如权利要求1所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括如下组分中的至少一种:
样品稀释液;
洗涤液;
显色液;以及
终止液。
6.如权利要求5所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液为含Tween-20、BSA和ProClin300的磷酸盐缓冲液;或者所述样品稀释液为含Tween-20、HSA和ProClin300的磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求5所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述洗涤液为含Tween-20及ProClin300中至少一种的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求5所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述显色液为柠檬酸-磷酸盐缓冲液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、过氧化氢和二甲亚砜。
9.如权利要求5所述的人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述终止液为0.2~1M的硫酸。
10.一种人巨细胞病毒IgG抗体的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
对微孔板进行人巨细胞病毒抗原的包被;
将样品血清或血浆进行稀释后加入至人巨细胞病毒抗原包被的微孔板中;
对人巨细胞病毒IgG抗体溶液进行浓度定标,将不同浓度梯度的人巨细胞病毒IgG抗体溶液加入至所述微孔板的其它板孔中,并设置空白对照孔;
将所述微孔板置于36℃~38℃环境中孵育55~95分钟后,洗涤3~5次;
向所述微孔板的各孔中加入酶标记的抗人IgG抗体,并于36℃~38℃的环境中孵育25~65分钟后,洗涤3~5次;
对所述微孔板进行显色处理,以空白对照孔为对照,读取各孔的吸光度值,并根据已浓度定标的人巨细胞病毒IgG抗体溶液的吸光度值计算样品血清或血浆中人巨细胞病毒IgG抗体的量。
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