CN105510581A - 巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒 - Google Patents

巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作液、样品稀释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品；所述微孔板上包被有巨细胞病毒抗原；所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体；所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mol/L尿素配制而成。本发明采用酶联免疫间接法原理进行检测，可以帮助区分巨细胞病毒感染是否为原发感染或新的复发感染，弥补了我国对人血清或血浆中巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测的空白，适合于手工操作，且操作方法简便，可用于大量样本的检测，为临床医生评估胎儿的健康状况和采取进一步的措施提供有力的帮助。

Description

巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，尤其是涉及一种巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒。
背景技术
人巨细胞病毒(humanCytomegalovirus,HCMV)又称细胞包涵体病毒，属于疱疹病毒β亚科，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。本病毒对宿主或培养细胞有高度的种特异性，人巨细胞病毒只能感染人、及在人纤维细胞中增殖，是婴儿宫内、产道和母乳感染，以及因免疫抑制剂、器官和骨髓移植、艾滋病等所致免疫低下患者罹患严重感染的重要病原。
巨细胞病毒是新生儿先天性致畸的重要病原微生物之一，它对胎儿的危害比风疹病毒要大，最易引起胎儿、新生儿、婴儿的急性、慢性感染及迟发后遗症。孕妇的原发或新的复发感染均可引起新生儿宫内或围产期感染，当孕妇患有巨细胞活动感染时，病毒可通过胎盘进入胎儿体内引起先天性感染。孕妇的原发感染对胎儿的危害比复发感染严重，它不仅可引起先天性感染，而且后遗症较多且严重，原发性孕期感染CMV的胎儿80%可出现智力低下，视力受损，听力丧失等症状，特别是引起婴儿的巨细胞包涵体病（CI），患儿可多个系统、多个器官受损，其病死率达10％~20％（CI的特点是网状内皮系统和中枢神经系统受侵）。我国孕期妇女原发感染CMV的比例为3%~4%，而原发感染导致胎儿受到影响的机率为50%，IgG亲和力检测可以帮助区分是否为原发感染或新的复发感染，因为低亲和力的IgG抗体出现在感然后的前几个月，随着时间的推移，抗体逐渐成熟为高亲和力的抗体，高亲和力的IgG抗体可以排除发生在4个月以内的感染，这对于在怀孕的前3个月检测出IgM抗体阳性的孕妇，可以看出感染是否发生在怀孕前。
目前，巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测有中和抗体法和变性剂法。中和抗体法是利用抗原溶液将样本中的高亲和力抗体中和掉，剩余的是低亲和力抗体，亲和力指数=1-中和结果/未中和结果，根据亲和力指数判定结果。中和抗体法的亲和力指数受到加入的中和抗原量和样本中抗体浓度的影响，为得到准确的结果需将抗体浓度稀释到一定的范围内进行检测，这种方法适合于全自动检测系统，对于手工操作则显得比较麻烦，且该检测产品属国外进口产品，价格昂贵。变性剂法是利用尿素或二乙胺等变性剂处理结合在固相载体上的抗体，低亲和力的抗体很容易被洗脱掉，高亲和力的抗体仍旧结合在固相载体上。亲和力指数=变性处理的结果/未变性处理的结果，根据亲和力指数判定结果。变性法比较简单，但对于全自动检测系统来说，高浓度的变性剂容易造成交叉污染，故比较适合于手工操作，但截至目前，尚没有基于ELISA平台变性剂法检测巨细胞病毒IgG抗体亲和力的试剂盒批准上市。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合手工操作且操作简便的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作液、样品稀释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品；所述微孔板上包被有巨细胞病毒抗原；所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体；所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mol/L尿素配制而成。
所述试剂盒中还包括底物液、显色液和终止液。
所述微孔板上包被的巨细胞病毒抗原为巨细胞基因重组抗原pp150（UL32）和gp52（UL44）按质量比1:1的比例用pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至0.1～0.4ug/人份后再包被到空白微孔板上,达到最佳的包被效果，。
所述酶结合物工作液中的抗体按体积比1:1000~10000的比例，用含牛血清、防腐剂P300和表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液进行稀释，以兼顾灵敏度和特异性，使试剂盒达到最佳水平。
所述高亲和力质控品中CMVIgG高亲和力抗体按体积比1:100~500的比例，用pH7.40.02MPBS并含有BSA的缓冲液进行稀释。选择最佳稀释比例，以满足试剂盒的性能要求。
所述低亲和力质控品中CMVIgG低亲和力抗体按体积比1:550~100的比例，用pH7.40.02MPBS并含有BSA的缓冲液进行稀释。选择最佳稀释比例，以满足试剂盒的性能要求。
所述对照缓冲液是含牛血清、防腐剂P300和表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液；所述样品稀释液是含Casein、防腐剂P300、表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液。
所述显色剂是含有TMB-HCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，PH3.0；底物液是含有过氧化氢尿素的柠檬酸-乙酸盐缓冲液，PH5.0；所述终止液为0.4M硫酸溶液。
本发明采用酶联免疫间接法原理进行检测，用巨细胞病毒抗原包被微孔板，辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG作为酶结合物工作液。向微孔板中加入待测样本（每个样本均做复孔），温育反应后特异性CMVIgG抗体被结合在微孔板上，充分洗涤去掉未结合物，向其中一孔加入解离缓冲液，另外一孔加入对照缓冲液，温育反应后低亲和力CMVIgG抗体在解离缓冲液作用下与抗原分离。本发明试剂盒可以帮助区分巨细胞病毒感染是否为原发感染或新的复发感染，弥补了我国对人血清或血浆中巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测的空白，适合于手工操作，且操作方法简便，可用于大量样本的检测，为临床医生评估胎儿的健康状况和采取进一步的措施提供有力的帮助。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做更加详细的阐述。
本发明所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作液、样品稀释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品；所述微孔板上包被有巨细胞病毒抗原；所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体；所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mol/L尿素配制而成。
一、本发明试剂盒的制备
1、制备微孔板
根据文献资料及软件分析，设计引物将目的基因gP52的优势抗原表位扩增至PET-28a表达载体中，转化至大肠杆菌BL(DE3)进行IPTG诱导表达，大量收获菌体后进行超声破碎处理，离心取上清进行镍柱亲和纯化，得到对应的抗原蛋白样品。通过引物设计将目的基因pp150的优势抗原表位扩增至PET-30a表达载体中，转化至大肠杆菌BL(DE3)进行IPTG诱导表达，大量收获菌体后进行超声破碎处理，离心取上清进行镍柱亲和纯化，得到对应的抗原蛋白样品。
将得到的巨细胞基因重组抗原pp150（UL32）和gp52（UL44）按质量比1:1的比例用pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至0.1～0.4ug/人份,作为微孔板的包被液，每孔各加入100ul，在2～8℃条件放置16～32小时，洗板一次，加入封闭液120μl/孔，封闭液为PH7.4、0.02M的PBS缓冲液中加入10%蔗糖和1%Casein（酪蛋白）,在2～8℃放置12～24小时，达到最佳的保护抗原蛋白稳定的效果，甩去封闭液，置于恒温干燥间干燥16~36小时。
2、制备酶结合物工作液
在pH7.4的Tris-Hcl缓冲液中，添加20%牛血清、0.1%防腐剂P300和0.1%表面活性剂Tween-20，配制成稀释液；
用上述配制的稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体，其中抗体与稀释液的体积比为1:1000~10000,本实施例中选用的比例为1:4000；
3、制备高亲和力质控品
采用PH7.4的0.02MPBS缓冲液中加入5%BSA配制成稀释液；
然后用上述配制的稀释液，按1:100~1:500的体积比稀释CMVIgG高亲和力抗体（本实施例选择1:200），得到高亲和力质控品；
4、制备低亲和力质控品
采用PH7.4的0.02MPBS缓冲液中加入5%BSA配制成稀释液；
然后用上述配制的稀释液，按1:550~1000的体积比稀释CMVIgG低亲和力抗体（本实施例选择1:600），得到低亲和力质控品；
5、制备对照缓冲液
按下述组分配制对照缓冲液：pH7.4的Tris-Hcl缓冲液中加入20%牛血清，0.1%防腐剂P-300，0.1%表面活性剂Tween-20配制而成；
6、制备解离缓冲液
采用尿素作为变性剂，在PBST缓冲液中加入8Mol/L尿素制备成解离缓冲液；
7、制备样品稀释液
按下述组分配制样品稀释液：采用pH7.4的Tris-Hcl缓冲液，加入5%Casein（酪蛋白），0.1%防腐剂P-300、0.1%表面活性剂Tween-20配制而成。
8、制备显色剂和底物液
显色剂是将0.03%TMB-HCl溶解在柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，PH3.0；底物液是将0.05%过氧化氢尿素溶解在柠檬酸-乙酸盐缓冲液中，PH5.0；二者等体积混合使用。
9、制备终止液
本发明所用终止液为0.4M的硫酸溶液。
二、使用本发明试剂盒检测巨细胞病毒IgG抗体亲和力的方法（本发明试剂盒针对的标本为血清或血浆）：
采用三步法检测：
把样品在孔外用样品稀释液按1:100（1000ul样品稀释液+10ul样品）的比例稀释样品，缓慢混匀后，加入微孔板100ul/孔，每份样品加复孔，充分混匀，置于37℃恒温箱中30分钟后，洗去其它没有结合的物质后，其中一孔加入离解缓冲液，另外一孔加对照缓冲液，置于37℃恒温箱中10分钟后，充分洗涤，加入酶结合物工作液100ul/孔，置于37℃恒温箱中30分钟后，充分洗涤，分别加入底物液和显色剂各50ul/孔，充分混匀后置于37℃恒温箱中10分钟，加入终止液50ul/孔，在450/620nm波长下读数。
检测结果解释：
1.IgG抗体亲和力=解离缓冲液孔OD值/对照缓冲液孔OD值×100%。
2.若样本的对照缓冲液孔OD值≥0.15说明样本中含有IgG抗体，可进行亲和力计算；若样本的对照缓冲液孔OD值＜0.15，说明样本不含IgG抗体，或IgG抗体含量不足以被检出，无需进行亲和力计算
。
三、本发明试剂盒性能指标
1、灵敏度
本试剂盒检测商品化血清转化盘RP-003（至感染后99天）、RP-019（至感染后68天）和PTC-901（至感染后67天），IgG抗体检测均为低亲和力，与AbbottATCHITCMVIgGAvidity的符合率为100%。RP-019感染104天后本试剂盒检测为高亲和力，AbbottATCHIT仍检测为低亲和力。检测结果对比情况如下表1。
表1商品化血清转化盘检测结果
。
2、特异性
检测744份CMVIgG阳性同时IgM阴性（既往感染）的样本，除去17份检测为灰区样本，19份检测结果为低亲和力，特异性为97.4%（708/727）。
3、分析特异性
单纯疱疹病毒IgG抗体、风疹病毒IgG抗体、弓形虫IgG抗体、EBVIgG抗体、VZVIgG抗体、细小病毒B19IgG抗体、流感病毒IgG抗体、抗核抗体、类风湿因子和系统性红斑狼疮患者样本对CMVIgG抗体亲和力检测结果无显著影响。
4、重复性
分析内变异系数（CV%）小于15%；分析间变异系数（CV%）不大于15%；批间变异系数（CV%）不大于20%。
5、干扰物质
20mg/dl胆红素、500mg/dl血红蛋白、3000mg/dl甘油三酯对检测结果无显著影响。
6、抗凝剂影响
使用EDTA、枸椽酸钠或肝素钠的抗凝血浆对检测结果无显著影响。
7、方法学对比
与商品化试剂盒对比检测1080份临床样本，高亲和力符合率为98.34%，低亲和力符合率为98.17%，总体符合率为98.06%。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作液、样品稀释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品；其特征在于：所述微孔板上包被有巨细胞病毒抗原；所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体；所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mol/L尿素配制而成。
2.根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括底物液、显色液和终止液。
3.根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于：所述微孔板上包被的巨细胞病毒抗原为巨细胞基因重组抗原pp150和gp52按质量比1:1的比例用pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至0.1～0.4ug/人份后,达到最佳的包被效果，再包被到空白微孔板上。
4.根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于：所述酶结合物工作液中的抗体按体积比1:1000~10000的比例，用含牛血清、防腐剂P300和表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液进行稀释。
5.根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于：所述高亲和力质控品中CMVIgG高亲和力抗体按体积比1:100~500的比例，用pH7.40.02MPBS并含有BSA的缓冲液进行稀释。
6.根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于：所述低亲和力质控品中CMVIgG高亲和力抗体按体积比1:550~1000的比例，用pH7.40.02MPBS并含有BSA的缓冲液进行稀释。
7.根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于：所述对照缓冲液是含牛血清、防腐剂P300和表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液；所述样品稀释液是含Casein、防腐剂P300、表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液。
8.根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于：所述显色剂是含有TMB-HCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，PH3.0；底物液是含有过氧化氢尿素的柠檬酸-乙酸盐缓冲液，PH5.0；所述终止液为0.4M硫酸溶液。
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