CN1431223A - 重组人巨细胞病毒融合蛋白及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明重组人巨细胞病毒融合蛋白及其制备方法、应用涉及基因工程技术和诊断试剂领域。本发明是利用基因工程技术制备一种新型的重组蛋白，即人巨细胞病毒PP150蛋白C端的25个氨基酸和gp52蛋白C端的164个氨基酸串联形成的融合蛋白，PP150蛋白C端的25个氨基酸在融合蛋白的N端，gp52蛋白C端的164个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，其中gp52蛋白C端164个氨基酸内的第162个氨基酸由赖氨酸(Lys)替换为天冬酰酸(Asn)，融合蛋白的N端增加了1个蛋基酸(Met)，全长192个氨基酸。该蛋白用于检测人巨细胞病毒抗体或抗原及用于制备单抗和多抗。
Description
技术领域
本发明是利用基因工程技术，制备重组人巨细胞病毒融合蛋白。融合蛋白的两个片段分别来自于人巨细胞病毒的gp52蛋白和PP150蛋白，两个片段利用基因工程技术连接表达，形成新的融合蛋白，产生的新型融合蛋白可用作抗原，用于人巨细胞病毒抗体或抗原的检测等。本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域。
技术背景
人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，简写HCMV)是一种DNA病毒，其感染人体后可在体内长期潜伏，并可被激活产生复发感染。HCMV感染的孕妇既可通过胎盘传染胎儿，又可经产道及母乳传染给新生儿，胎儿和新生儿感染HCMV后可产生小头畸形、智力障碍等严重损害[Rawl inson WD.Broadsheet.Pathology，1999；31(2)：109～115]。艾滋病和其它免疫缺陷型患者感染HCMV，是造成患者死亡的重要原因之一[Rawlinson WD.Broadsheet.Pathology，1999；31(2)：109～115]。另外，在器官移植的患者中也常发现HCMV感染。
建立HCMV的快速检测方法对孕妇及献血员等进行检查，对优生优育及阻止HCMV传播有重要意义。目前检测HCMV的方法主要包括：HCMV病毒的细胞培养，PCR法检测HCMV DNA，ELISA法及免疫印迹法检测HCMV抗体(IgM和IgG)及抗原。其中ELISA法检测HCMV抗体或抗原是最常采用的方法[Daininer A，Bader U，Eggers M，et al.JClin Virol，1999；13(3)：161～171]。
多种HCMV病毒蛋白可刺激机体产生相应的抗体。应选用抗原性强、特异性好的蛋白抗原，用于检测HCMV抗体。我国使用的HCMV病毒蛋白抗原多是培养病毒提取物，含有多个蛋白产物，抗原特异性不强，易产生假阳性。国外的研究证实[Vornhagen R，Plachter B，Hinderer W，et al.J Clin Microbiol，1994；32：981～985.Plachter B，Weiczorekl，Ziegelmaier B，et al.J Clin Microbiol，1992；30：201～206]，HCMV的gp52蛋白和PP150蛋白具有较强的抗原性，在HCMV感染者的血清中其相应的抗体检出率较高，但是用全长的gp52和PP150蛋白作抗原检测HCMV抗体会出现假阳性，因此，应选用其内抗原性强、特异性好的部分片段作抗原。通过计算机分析，发现gp52蛋白的C端及PP150蛋白的C端存在有较强的抗原决定簇。我们用PCR方法扩增了gp52蛋白的C端基因片段，同时合成了PP150蛋白C端25个氨基酸的基因片段，将两个基因片段串联克隆至同一质粒表达载体，构建成功了高效表达两者融合蛋白的工程菌，建立了表达蛋白的纯化方法，纯化获得了高纯度的融合蛋白，并用作抗原检测HCMV抗体。
发明内容
本发明是利用基因工程技术制备一种新型的重组蛋白，即人巨细胞病毒PP150蛋白C端从第1024个氨基酸到第1048个氨基酸的25个氨基酸和gp52蛋白C端从第270个氨基酸到第433个氨基酸的164个氨基酸串联形成的融合蛋白，PP150蛋白C端的25个氨基酸在融合蛋白N端，gp52蛋白C端的164个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，其中gp52蛋白C端164个氨基酸内的第162个氨基酸由赖氨酸(Lys)替换为天冬酰酸(Asn)，融合蛋白的N端增加了1个蛋基酸(Met)，全长192个氨基酸。该蛋白用于检测人巨细胞病毒抗体或抗原及用于免疫制备抗人巨细胞病毒单抗和多抗。重组人巨细胞病毒融合蛋白及其制备方法、应用是采取以下步骤实施的：HCMV PP150蛋白C端基因片段的合成及复性：
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HCMV PP150蛋白的氨基酸序列(GeneBank，接通号：M16022)，发现HCMV PP150蛋白的C端的25个氨基酸可形成较强的抗原决定簇，25个氨基酸为：Gly Gly Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile LeuGln Lys Ile Glu Lys Ile Lys Asn Thr Glu Glu。选用这些氨基酸的细菌偏爱密码子，合成两条互补的DNA片段，正链为：5’-CATGGGC GGT GCT AAA ACT CCG TCT GAC GCTGTT CAG AAC ATC CTG CAG AAA ATC GAA AAA ATC AAA AAC ACT GAA GAA G-3’；负链为：5’-GATCC TTC TTC AGT GTT TTT GAT TTT TTC GAT TTT CTG CAG GAT GTT CTG AACAGC GTC AGA CGG AGT TTT AGC ACC GCC-3’。两条链的5’端均进行了磷酸化。两条链退火和复性后形成上述25个氨基酸的基因片段，并且在5’端形成一个NcoI粘性末端，在3’端形成一个BamNI粘性末端，使该基因片段易于克隆至质粒pET28a(+)内的Nco I和BamHI酶切位点内。HCMV gp52蛋白C端抗原表位的筛选及基因片段的克隆：
1)抗原表位的筛选
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HCMV gp52蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号：X17403)，筛选出gp52蛋白内的强抗原表位，即从第270个氨基酸到第433个氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下：
筛选gp52内的抗原表位氨基酸序列(270aa～433aa)：Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly LysSer Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn Ala Gly GlyLeu His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn Glu Pro Met Gly LeuGly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys His Asp Arg Gly Gly GlyGly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp His Asp HisGlv Leu Ser Ser Lys Glu Lys Tyr Glu Gln Hi s LysIle Thr Ser Tyr Leu Thr SerLys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg Asn SerGly Asn Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr PheGlu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys Gly
筛选的蛋白抗原表位的DNA序列(808～1302bp)：GAA CCT TTC CAG CGT GGC GAT CCC TTC GAC AAA AAT TAC GTC GGG AAC AGC GGC AAGTCG CGT GGC GGC GGC GGT GGT GGC GGC AGC CTC TCT TCG CTG GCC AAT GCC GGC GGTCTG CAT GAC GAC GGC CCG GGT CTG GAT AAC GAT CTC ATG AAC GAG CCC ATG GGT CTCGGC GGT CTG GGA GGA GGT GGC GGC GGT GGC GGC AAG AAG CAC GAC CGC GGT GGC GGCGGT GGT TCC GGT ACG CGG AAA ATG AGC AGC GGT GGC GGC GGC GGT GAT CAC GAC CACGGT CTT TCC TCC AAG GAA AAA TAC GAG CAG CAC AAG ATC ACC AGC TAC CTG ACG TCCAAA GGT GGA TCG GGC GGC GGC GGA GGA GGA GGA GGC GGC GGT TTG GAT CGC AAC TCCGGC AAT TAC TTC AAC GAC GCG AAA GAG GAG AGC GAC AGC GAG GAT TCT GTA ACG TTCGAG TTC GTC CCT AAC ACC AAG AAG CAA AAG TGC GGC TAA
2)gp52蛋白C端抗原表位的基因克隆
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物。设计的上游引物为P1(808-825bp)：5’-CGGGATCCGAACCTTTCCAGCGTGGC-3’；下游引物为P2(1285-1302bp)：5’-CGAATTCTTAGCCGCAGTTTTGCTTCTT-3’。在上游引物上增加了BamHI酶切位点(下画线部分)，在下游引物上增加了EcoR I酶切位点(下画线部分)及终子密码子，另外，合成引物时对下游引物的序列进行了定点突变，由原来的碱基C改为碱基G(斜体)，该密码子编码的氨基酸由Lys(K)变为Asn(N)。
取HCMV(AD169株，由中国药品生物制品所提供)细胞培养上清200μl，加100μl蛋白酶K(10mg/ml)，置56℃水浴4小时。用酚/氯仿法纯化HCMV DNA，将获得的HCMV DNA溶于20μl去离子水内，置-20℃冻存备用。
以上述提纯的HCMV DNA为模板，用引物P1、P2 PCR扩增gp52蛋白C端抗原表位的基因片段，扩增条件为：94℃30秒、65℃30秒、72℃60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。电泳回收、纯化扩增的基因片段，溶于去离子水内，置-20℃冻存备用。表达融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。将合成的PP150 C端多肽的基因片段正、负链分别溶于缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH7.4、50mmol/L NaCl)内，溶解后两条链的终浓度相同。取等量正、负链溶液置于同一离心管内混匀，置100℃水溶内变性5min，取出后置室温自然冷却，使两条链复性为双链基因片段，其5’形成Nco I粘性末端，3’端形成BamHI粘性末端。
用用EcoR I和BamHI双酶切纯化的gp52基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述三种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使PP150蛋白C端基因片段与gp52基因片段串联插入到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白。重组质粒的筛选与鉴定：
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg/ml)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和个对照菌(质粒pET28a转化菌)，分别提取质粒。首先用Nde I酶切分析，在质粒pET28a(+)内存一个Nde I酶切位点(位于Nco I和BamH I位点之间)，当外源基因插入Nco I和BamH I位点之间后，两位点之间的Nde I酶切位点被去掉，因此重组后的质粒不能被Nde I酶切开，而非重组的质粒则会被Nde I切开。将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有串联的PP150蛋白C端基因片段与gp52基因片段，序列完全正确：
ATG GGC GGT GCT AAA ACT CCG TCT GAC GCT GTT CAG AAC ATC CTG CAG AAA ATCGAA AAA ATC AAA AAC ACT GAA GAA GGA TCC GAA CCT TTC CAG CGT GGC GAT CCC TTCGAC AAA AAT TAC GTC GGG AAC AGC GGC AAG TCG CGT GGC GGC GGC GGT GGT GGC GGCAGC CTC TCT TCG CTG GCC AAT GCC GGC GGT CTG CAT GAC GAC GGC CCG GGT CTG GATAAC GAT CTC ATG AAC GAG CCC ATG GGT CTC GGC GGT CTG GGA GGA GGT GGC GGC GGTGGC GGC AAG AAG CAC GAC CGC GGT GGC GGC GGT GGT TCC GGT ACG CGG AAA ATG AGCAGC GGT GGC GGC GGC GGT GAT CAC GAC CAC GGT CTT TCC TCC AAG GAA AAA TAC GAGCAG CAC AAG ATC ACC AGC TAC CTG ACG TCC AAA GGT GGA TCG GGC GGC GGC GGA GGAGGA GGA GGC GGC GGT TTG GAT CGC AAC TCC GGC AAT TAC TTC AAC GAC GCG AAA GAGGAG AGC GAC AGC GAG GAT TCT GTA ACG TTC GAG TTC GTC CCT AAC ACC AAG AAG CAAAAC TGC GGC TAA
构建的重组质粒表达PP150蛋白C端(25个氨基酸)与gp52蛋白C端(164个氨基酸)的融合蛋白，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，其中gp52蛋白C端164个氨基酸内的第162个氨基酸由赖氨酸(Lys)替换为天冬酰酸(Asn)，融合蛋白的N端增加了一个蛋基酸(Met)，全长192个氨基酸，其氨基酸序列如下：
Met Gly Gly Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu Gln
5 10 15
Lys Ile Glu Lys Ile Lys Asn Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Phe Gln
20 25 30
Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser
35 40 45
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn Ala
50 55 60
Gly Gly Leu His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn
65 70 75 80
Glu Pro Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Lys Lys His Asp Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser Lys
115 120 125
Glu Lys Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gly Asn Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp
165 170 175
Ser Val Thr Phe Glu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Asn Cys Gly
180 185 190表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为22000的融合蛋白，表达量约为35％，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带。表达融合蛋白的纯化：
1)表达融合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.15、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT)内，冰浴超声破菌10min，离心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的离子交换纯化。
2)DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化
将DEAE-Sepharose FF阴离子柱连接至常压层析系统，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.15、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min。上样后用平衡液冲洗，然后依次用含50、100、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl洗脱峰蛋白，该峰含表达的融合蛋白。
3)S-Sepearse FF阳离子柱纯化
将上步DEAE-Sepharose FF阴离子纯化获得的含融合蛋白的洗脱峰(100mmol/LNaCl峰)，装入透析袋内，对透析液(20mmol/L PB(pH7.4)、1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/LDTT)搅拌透析4h。用上述透析液冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将透析后的融合蛋白直接上样，上样流速1.5ml/min。上样结束后用透析液充分洗柱，再依次用含50、100、1000mmol/L NaCl的透析液洗脱蛋白，收集100mmol/LNaCl洗脱峰蛋白，即为纯化的融合蛋白。纯化的融合蛋白用作抗原检测HCMV抗体：
将纯化的融合蛋白用50mmol/L的碳酸盐(pH9.6)倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗gp52 IgM(或IgG)阳性血清和抗PP150 IgM(或IgG)阳性血清及正常人血清，结果显示，融合蛋白能与抗gp52 IgM(或IgG)和抗PP150IgM(或IgG)阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明该融合蛋白内gp52蛋白片段和PP150蛋白C端蛋白均有较好抗原性和特异性。
同样用辣根过氧化物酶(HRP)标记该融合蛋白，用扑获法检测抗HCMV IgM或IgG抗体，有较高的敏感性和特异性。该融合蛋白用作抗原，用金标法检测抗HCMV IgM或IgG抗体，亦有较高的敏感性和特异性。本发明与现有技术相比具有的优点
目前我国使用的HCMV病毒蛋白抗原多是培养病毒提取物，含有多个蛋白产物，抗原特异性不强，易产生假阳性。国外使用的HCMV gp52蛋白和PP150蛋白具有较强的抗原性，在HCMV感染者的血清中其相应的抗体检出率较高，但是用全长的gp52和PP150蛋白作抗原检测HCMV抗体会出现假阳性。因此，应选用其内抗原性强、特异性好的部分片段作抗原。
我们表达的HCMV PP150蛋白C端多肽与gp52蛋白C端片段融合蛋白，有较多优点：
①用这两个蛋白作抗原检测抗HCMV-IgM血清时，不再需要分别制备这两种蛋白，也不需要调整两个抗原的使用比例，因此应用方便且成本较低。
②将这两个蛋白的抗原性较强的片段融合表达，不仅抗原性强，而且可减少非特异反应，同时，也避免了小肽作抗原的不稳定问题。
③当用捕获法检测抗HCMV IgM时，只需酶标记这一种融合蛋白，不再需要分别标记两个蛋白。因此，当检测抗体需要多个蛋白抗原时，制备多价融合蛋白抗原，是理想的发展方向之一。
④本文构建的表达HCMV PP150C端多肽与gp52C端的融合蛋白的工程菌，表达量可达菌体可溶性蛋白的35％，并且以可溶性形式存在，易于纯化，可大量纯化制备该融合蛋白。目前未见表达该融合蛋白的报道。
⑤我们曾将HCMV PP150C端多肽与gp52C端的另一段蛋白片段(从第255个氨基酸到第420个氨基酸)融合表达，但是，其抗原性较本文申请专利的融合蛋白的抗原性弱，所以对其没有申请专利。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明：
图1是用多种分子生物学软件对HCMV gp52蛋白内的抗原表位进行分析结果。结果显示，在gp52蛋白的C端从第255个氨基酸到第420个氨基酸含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。
图2是表达HCMV PP150C端多肽与gp52C端融合蛋白的重组质粒构建流程图。
图3是用1.2％的Agarose凝胶检测5个重组子的PCR扩增产物。M：低分子量DNA标准(TaKaRa，DL2000)；C：含质粒pET28a(+)的对照菌；1～5∶5个转化子均扩增出588bp的目的基因片段，即图内箭头标示的位置。
图4是表达PP150C端多肽与gp52C端融合蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。1～5∶1～5号重组菌，5个重组子均表达相对分子量约为22000的融合蛋白，即图内箭头标示的位置；6：对照菌E.coli BL21(DE3)。
图5是表达gp52蛋白纯化前后的SDS-PAGE分析结果。M：低分子量蛋白标准(Pharmacia)；1：对照菌BL21(DE3)；2：表达PP150和gp52融合蛋白的工程菌；3：工程菌超声裂解上清；4：用DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化的PP150和gp52融合蛋白；5：S-Sepharose FF阳离子柱纯化后的的PP150和gp52融合蛋白。
图6是PP150和gp52融合蛋白抗原免疫印迹结果。1：正常人血清；2：抗-HCMVgp52蛋白IgM阳性人血清；3：抗-HCMV PP150蛋白IgM阳性人血清。箭头所示橙色沉淀带。
具体实施方式
本发明实施方式的详细说明：
人巨细胞病毒PP150蛋白C端的25个氨基酸与gp52蛋白
C端164个氨基酸的融合表达
选用细菌偏爱的密码子，化学合成PP150蛋白C端25个氨基酸的基因片段。用PCR方法扩增gp52蛋白基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET28a(+)内的NcoI/BamHI和BamHI/EcoRI位点，使两者串联在一起，并且翻译框架一致，可表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得了高效表达该融合蛋白的工程菌，表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的35％左右，并以可溶性形式存在。
材料与方法
1.菌种与质粒：宿主菌BL21(DE3)及表达载体pET28a(+)为美国Novagen公司产品。
2.分子生物学试剂：限制性内切酶NcoI、NdeI、BamHI、EcoRI、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为德国QIAGEN公司产品。DTT及IPTG为Promega公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。
3.基因片段的合成：由大连TaKaRa公司帮助合成。
4.基因克隆方法：DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。
5.DNA序列分析：用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。
结果
1.HCMV PP150蛋白C端基因片段的合成及复性：
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HCMV PP150蛋白的氨基酸序列(GeneBank，接通号：M16022)，发现HCMV PP150蛋白的C端的25个氨基酸可形成较强的抗原决定簇，25个氨基酸为：Gly Gly Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile LeuGln Lys Ile Glu Lys Ile Lys Asn Thr Glu Glu。
选用这些氨基酸的细菌偏爱密码子，合成两条互补的DNA片段，正链为：5’-CATGGGC GGT GCT AAA ACT CCG TCT GAC GCT GTT CAG AAC ATC CTG CAG AAA ATCGAA AAA ATC AAA AAC ACT GAA GAA G-3’；负链为：5’-GATCC TTC TTC AGT GTT TTT GATTTT TTC GAT TTT CTG CAG GAT GTT CTG AAC AGC GTC AGA CGG AGT TTT AGC ACC GCC-3’。两条链的5’端均进行了磷酸化。两条链退火和复性后形成上述25个氨基酸的基因片段，并且在5’端形成一个Nco I粘性末端，在3’端形成一个BamHI粘性末端，使该基因片段易于克隆至质粒pET28a(+)内的Nco I和BamHI酶切位点内。2.gp52蛋白C端抗原表位的筛选及基因克隆：
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HCMV gp52蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号：X17403)，筛选出gp52蛋白内的强抗原表位，即从第270个氨基酸到第433个氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下：
筛选gp52内的抗原表位氨基酸序列(270aa～433aa)：Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly LysSer Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn Ala Gly GlyLeu His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn Glu Pro Met Gly LeuGly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys His Asp Arg Gly Gly GlyGly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp His Asp HisGly Leu Ser Ser Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr SerLys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg Asn SerGly Asn Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr PheGlu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys Gly
筛选的蛋白抗原表位的DNA序列(808～1302bp)：GAA CCT TTC CAG CGT GGC GAT CCC TTC GAC AAA AAT TAC GTC GGG AAC AGC GGC AAGTCG CGT GGC GGC GGC GGT GGT GGC GGC AGC CTC TCT TCG CTG GCC AAT GCC GGC GGTCTG CAT GAC GAC GGC CCG GGT CTG GAT AAC GAT CTC ATG AAC GAG CCC ATG GGT CTCGGC GGT CTG GGA GGA GGT GGC GGC GGT GGC GGC AAG AAG CAC GAC CGC GGT GGC GGCGGT GGT TCC GGT ACG CGG AAA ATG AGC AGC GGT GGC GGC GGC GGT GAT CAC GAC CACGGT CTT TCC TCC AAG GAA AAA TAC GAG CAG CAC AAG ATC ACC AGC TAC CTG ACG TCCAAA GGT GGA TCG GGC GGC GGC GGA GGA GGA GGA GGC GGC GGT TTG GAT CGC AAC TCCGGC AAT TAC TTC AAC GAC GCG AAA GAG GAG AGC GAC AGC GAG GAT TCT GTA ACG TTCGAG TTC GTC CCT AAC ACC AAG AAG CAA AAG TGC GGC TAA
合成的用于扩增gp52蛋白C端抗原表位基因的上游引物为P1(808-825bp)：5’-CGGGATCCGAACCTTTCCAGCGTGGC-3’；下游引物为P2(1285-1302bp)：5’-CGAATTCTTAGCCGCAGTTTTGCTTCTT-3’。合成的引物用去离子水溶解，使引物终浓度均为100pmol/μl。
取HCMV(AD169株，由中国药品生物制品所提供)细胞培养上清200μl，加100μl蛋白酶K(10mg/ml)，置56℃水浴4小时。用酚/氯仿法纯化HCMV DNA，将获得的HCMV DNA溶于20μl去离子水内，置-20℃冻存备用。
上述提纯的HCMV DNA为模板，用引物P1、P2 PCR扩增gp52蛋白C端抗原表位的基因片段，反应浓度为：HCMV DNA为模板2μl、引物P1、P2各1μl、10xBuffer 5.0μl、2.5mmol/L dNTP4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去离子水36.5μl，总体积50μl。扩增条件为：94℃30秒、65℃30秒、72℃60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。电泳回收、纯化扩增的基因片段，溶于20μl去离子水内，置-20℃冻存备用。
3.表达融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于20μl去离子水内。
将合成的PP150C端多肽的基因片段正、负链分别溶于缓冲液(50mmol/L Tris-HClpH7.4、50mmol/L NaCl)内，溶解后两条链的终浓度相同。取等量正、负链溶液置于同一离心管内混匀，置100℃水溶内变性5min，取出后置室温自然冷却，使两条链复性为双链基因片段，其5’端形成Nco I粘性末端，3’端形成BamHI粘性末端。
取用EcoRI和BamHI双酶切纯化的gp52基因片段，电泳回收后，溶于20μl去离子水内。
取上述三种酶切后DNA片段，按等摩尔浓度混匀，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接(置16℃连接过夜)，使PP150蛋白C端基因片段与gp52基因片段串联插入到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间(构建流程见图2)，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白。
4.重组质粒的筛选：
将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，将转化产物涂布含卡那霉素(60μg/ml)的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选5个转化子菌落，分别接种到含4ml液体LB培养基(含卡那霉素60μg/ml)的试管内，置37℃振荡培养6h，取菌液1ml，离心收菌。分别用50μl去离子水悬浮菌体，沸水煮5min，离心(4℃，12000rpm)5min，取上清(内有质粒)2μl用作PCR模板，以合成的PP150蛋白C端多肽基因的正链和扩增gp52基因片段的下游引物为引物对，PCR扩增插入载体内的融合基因片段，PCR反应浓度为：质粒模板2μl、PP150蛋白C端多肽基因的正链和引物P2各1μl、10xBuffer 5.0μl、2.5mmol/L dNTP4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去离子水36.5μl，总体积50μl。扩增条件为：94℃30秒、65℃30秒、72℃60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。取PCR扩增产物5μl，用1.2％的Agarose凝胶检测，结果，5个转化子均扩增出591bp的目的基因片段(见图3)，而含质粒pET28a(+)的对照菌没有扩增出该基因片段。初步证实，这5个转化子均含有串联的PP150蛋白C端多肽基因和扩增的gp52基因片段。
5.表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的上述5个阳性转化子，分别接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测。电泳检测显示(图4)，5个重组子均表达相对分子量约为22000的融合蛋白，表达量约为30％～38％，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带。获得了高表达人巨细胞病毒PP150蛋白C端25个氨基酸和gp52蛋白C端164个氨基酸融合蛋白的工程菌。6.DNA序列分析结果：
将表达目的蛋白的1号转化子，提取质粒进行DNA序列测定，质粒内的PP150蛋白C端多肽基因和gp52基因片段的DNA序列完全正确，结果如下：ATG GGC GGT GCT AAA ACT CCG TCT GAC GCT GTT CAG AAC ATC CTG CAG AAA ATC GAAAAA ATC AAA AAC ACT GAA GAA GGA TCC GAA CCT TTC CAG CGT GGC GAT CCC TTC GACAAA AAT TAC GTC GGG AAC AGC GGC AAG TCG CGT GGC GGC GGC GGT GGT GGC GGC AGCCTC TCT TCG CTG GCC AAT GCC GGC GGT CTG CAT GAC GAC GGC CCG GGT CTG GAT AACGAT CTC ATG AAC GAG CCC ATG GGT CTC GGC GGT CTG GGA GGA GGT GGC GGC GGT GGCGGC AAG AAG CAC GAC CGC GGT GGC GGC GGT GGT TCC GGT ACG CGG AAA ATG AGC AGCGGT GGC GGC GGC GGT GAT CAC GAC CAC GGT CTT TCC TCC AAG GAA AAA TAC GAG CAGCAC AAG ATC ACC AGC TAC CTG ACG TCC AAA GGT GGA TCG GGC GGC GGC GGA GGA GGAGGA GGC GGC GGT TTG GAT CGC AAC TCC GGC AAT TAC TTC AAC GAC GCG AAA GAG GAGAGC GAC AGC GAG GAT TCT GTA ACG TTC GAG TTC GTC CCT AAC ACC AAG AAG CAA AACTGC GGC TAA
表达重组人巨细胞病毒融合蛋白的纯化材料和方法1.主要试剂：DEAE-SepharoseFF阴离子和S-SepharoseFF阳离子凝胶为Pharmacia公司产品，IPTG、DTT为Promega公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。2.表达gp52蛋白的超声裂解：将培养的表达gp52蛋白的工程菌离心(8000rpm，10mins，4℃)，弃上清，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HClpH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT)内，冰浴超声破菌10mins，离心(12000rpm、20mins，4℃)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的离子交换纯化。3.DEAE-Sepharoe FF阴离子柱纯化：将DEAE-Sepharose FF阴离子柱(胶高20cm，直径1.2cm)连接至Bio-Rad常压层析系统，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA、0.1mMmol/L DTT)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min。上样后用平衡液冲洗，直至记录笔回至上样前基线。依次用含50、100、150、200、250、300、400mmol/L及1mol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，分别收集各洗脱峰蛋白进行SDS-PAGE检测。4.S-Sepharose FF阳离子柱纯化：将上步DEAE-Sepharose FF阴离子纯化获得的含gp52蛋白的洗脱峰(50mmol/L NaCl峰)，装入透析袋内，对20mmol/L PB(pH7.0)、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT溶液搅拌透析4h。将S-SepharoseFF阳离子柱(胶高15cm，直径1.2cm)连接至BioRad常压层析系统，用上述PB溶液冲洗平衡，然后将透析后的gp52蛋白直接上样，上样流速1.5ml/min。上样结束后用PB溶液充分洗柱，使记录笔回至基线，依次用含50、100、200、300mmol/L及1mol/L NaCl的PB溶液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白进步SDS-PAGE检测。结果1.DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化gp52蛋白
不同浓度NaCl洗脱的各峰蛋白进行SDS-PAGE分析显示，gp52蛋白主要存在于100mmol/L NaCl洗脱峰内，其它浓度NaCl洗脱峰内无此蛋白带。此步获得gp52蛋白已有很高的纯度(见图5)。2.S-Sepharose FF阳离子柱纯化融合蛋白
将不同浓度NaCl从S-Sepharose FF柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示，gp52蛋白仅存在于100mmol/L NaCl洗脱峰内(见图5)，显色一条很浓的gp52蛋白带(22kD处)，仅在其稍前有一条很弱的gp52蛋白降解带，其它洗脱峰内无gp52蛋白带(见图5)。
纯化重组人巨细胞病毒融合蛋白的鉴定及应用
将纯化的重组人巨细胞病毒融合蛋白用作抗原，通过免疫印迹(Western Blot)和间接ELISA试验方法，检测HCMV抗体(IgM或IgG)阳性及阴性血清，以鉴定该重组蛋白抗原的特异性和抗原性。实验结果显示，该重组蛋白有很好的特异性和抗原性，可用作抗原检测HCMV抗体。材料和方法1.抗HCMV IgM阳性血清：由南京军区总医院微生物室提供。2.酶联反应材料：酶联板为深圳产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人μ链单克隆抗体由南京军区总医院微生物室提供，碱性磷酸酶(AKP)标记的鼠抗人μ链单克隆抗体购自晶美公司。其它材料为酶联反应的常规材料。3.ELISA试验：采用间接ELISA检测血清中的IgM抗体。基本步骤为：用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)稀释重组蛋白包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。次日用封闭液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，0.5％蔗糖)封闭，每孔130μl，37℃1h(或4℃过夜)。将待测的抗HCMVIgM阴、阳性血清用样本稀释液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，0.5mmol/L NaCl)1∶100稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100μl，每个样本加2孔，37℃反应30min，用PBST液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，0.5％吐温-20)洗5遍后，加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人μ链单抗，每孔100μl，37℃反应30min，PBST洗5遍，加底物TMB溶液100μl，37℃避光显色10min，加50μl 4N硫酸混匀终止反应，用酶联仪测定A450值。4.免疫印迹试验：将纯化的重组蛋白等进行12％SDS-PAGE，电泳结束后，电转移至硝酸纤维素膜，用含1％小牛血清白蛋白的PBS液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4)室温振荡封膜2h，将膜移至用PBS液1∶50稀释的抗HCMV-IgM阳性或阴性血清中，37℃反应1h。取出膜用PBST液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，0.5％吐温-20)充分洗洗涤后，移至用PBS液1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的鼠抗人μ链单克隆抗体溶液内，37℃反应1h。取出膜充分洗涤后加底物二甲基联苯胺(DAB)溶液，室温显色5min，用去离子水冲洗干净。结果1.间接ELISA检测血清中的HCMV IgM抗体
将纯化的PP150与gp52融合蛋白1∶500～1∶8000倍比稀释包被酶联板，检测已知的1份抗gp52 IgM阳性血清、1份抗PP150 IgM阳性血清和1份正常人血清，结果显示(见表1)，融合蛋白能与抗gp52 IgM和抗PP150 IgM阳性血清反应，不与正常人血清反应，初步说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。
表1融合蛋白的ELISA实验结果(A450值)包被融合蛋白 1∶500 1∶1000 1∶2000 1∶4000 1∶8000抗gp52 IgM阳性血清 1.258 0.984 0.815 0.468 0.294抗PP150 IgM阳性血清 0.956 0.785 0.688 0.391 0.180正常人血清 0.070 0.049 0.042 0.028 0.024
将纯化的融合蛋白与已知不同浓度的牛血清白蛋白(第五部分)共同电泳、显色后比较，确定纯化的重组融合蛋白浓度约为1.5mg/ml。用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)1∶1000稀释后包被酶联板，检测已知4份抗HCMV-IgM阴性血清和8份抗HCMV-IgM阳性血清。结果显示，4份抗HCMV-IgM阴性血清均不显色，8份抗HCMV-IgM阳性血清均出现显色反应，说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。用酶联仪测定各孔样本的A450值见表2。另外又检测了184份正常人血清，它们的A450值均小于0.05，进一步证实了该融合蛋白有较好的特异性。表2纯化融合蛋白ELISA实验结果(A450)*1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.029 0.033 0.041 0.029 0.389 0.467 0.502 0.593 0.708 0.833 1.182 1.3930.031 0.028 0.039 0.026 0.373 0.493 0.531 0.584 0.696 0.871 1.237 1.4601～4：抗-HCMV IgM阴性血清，5～12：抗-HCMV IgM阳性血清
2.免疫印迹结果
将纯化的重组融合蛋白进行12％SDS-PAGE，加3道重组融合蛋白进行电泳，然后电转移至硝酸纤维素膜融合抗原。将转移有3道重组融合蛋白硝酸纤维素膜按泳道3条，分别用于下列3种血清的免疫印迹分析：抗HCMV gp52蛋白IgM阳性血清；抗PP150蛋白IgM阳性血清；正常人血清反应。免疫印迹结果显示，该融合蛋白能与抗gp52 IgM阳性血清和抗PP150 IgM阳性血清产生特异反应，在硝酸纤维素膜上融合蛋白处出现橙色沉淀带(见图6，箭头所示)，不与正常人血清反应。进一步证实该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。
重组人巨细胞病毒融合蛋白序列表<110>李越希<120>重组人巨细胞病毒融合蛋白及其制备方法、应用<160>2<210>1<211>192<212>PRT<213>人工序列<220><221><222><223>一种重组人巨细胞病毒融合蛋白，即人巨细胞病毒PP150蛋白C端从第1024个氨基酸到第1048个氨基酸的25个氨基酸和gp52蛋白C端从第270个氨基酸到第433个氨基酸的164个氨基酸串联形成的融合蛋白，PP150蛋白C端的25个氨基酸在融合蛋白N端，gp52蛋白C端的164个氨基酸在融合蛋白N端融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸(即融合蛋白的第27和28个氨基酸)连接，其中gp52蛋白C端164个氨基酸内的第162个氨基酸(即融合蛋白的第190个氨基酸)由赖氨酸(Lys)替换为天冬酰酸(Asn)，融合蛋白的N端(即融合蛋白的第1个氨基酸)增加了1个蛋基酸(Met)，全长192个氨基酸。<400>1Met Gly Gly Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu Gln
5 10 15Lys Ile Glu Lys Ile Lys Asn Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Phe Gln
20 25 30Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser
35 40 45Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn Ala
50 55 60Gly Gly Leu His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn65 70 75 80Glu Pro Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95Lys Lys His Asp Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met
100 105 110Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser Lys
115 120 125Glu Lys Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys Gly
130 135 140Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg Asn145 150 155 160Ser Gly Asn Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp
165 170 175Ser Val Thr Phe Glu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Asn Cys Gly
180 185 190<210>2<211>579<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)...(579)<220><221>mis-feature<222>(1)...(3)<223>合成PP150蛋白C端多肽基因时增加的起始密码子。<220><221>mis-feature<222>(4)...(78)<223>人工合成的PP150蛋白C端多肽基因序列。<220><221>mis-feature<222>(79)...(84)<223>连接PP150蛋白C端多肽基因和gp52蛋白C端片段基因的EcoR I酶切位点。<220><221>mis-feature<222>(85)...(579)<223>gp52蛋白C端片段基因序列，其中第570位碱基由g人工突变为c。<400>2atg ggc ggt gct aaa act ccg tct gac gct gtt cag aac atc ctg cag aaa atc gaa aaa 60Met Gly Gly Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu Gln Lys Ile Glu Lys
5 10 15 20atc aaa aac act gaa gaa gga tcc gaa cct ttc cag cgt ggc gat ccc ttc gac aaa aat 120Ile Lys Asn Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn
25 30 35 40tac gtc ggg aac agc ggc aag tcg cgt ggc ggc ggc ggt ggt ggc ggc agc ctc tct tcg 180Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ser
45 50 55 60ctg gcc aat gcc ggc ggt ctg cat gac gac ggc ccg ggt ctg gat aac gat ctc atg aac 240Leu Ala Asn Ala Gly Gly Leu His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn
65 70 75 80gag ccc atg ggt ctc ggc ggt ctg gga gga ggt ggc ggc ggt ggc ggc aag aag cac gac 300Glu Pro Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys His Asp
85 90 95 100cgc ggt ggc ggc ggt ggt tcc ggt acg cgg aaa atg agc agc ggt ggc ggc ggc ggt gat 360Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp
105 110 115 120cac gac cac ggt ctt tcc tcc aag gaa aaa tac gag cag cac aag atc acc agc tac ctg 420His Asp His Gly Leu Ser Ser Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr Leu
125 130 135 140acg tcc aaa ggt gga tcg ggc ggc ggc gga gga gga gga ggc ggc ggt ttg gat cgc aac 480Thr Ser Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg Asn
145 150 155 160tcc ggc aat tac ttc aac gac gcg aaa gag gag agc gac agc gag gat tct gta acg ttc 540Ser Gly Asn Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr Phe
165 170 175 180gag ttc gtc cct aac acc aag aag caa aag tgc ggc tagGlu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Asn Cys Gly
185 190atgggcggtg ctaaaactcc gtctgacgct gttcagaaca tcctgcagaa aatcgaaaaa 60atcaaaaaca ctgaagaagg atccgaacct ttccagcgtg gcgatccctt cgacaaaaat 120tacgtcggga acagcggcaa gtcgcgtggc ggcggcggtg gtggcggcag cctctcttcg 180ctggccaatg ccggcggtct gcatgacgac ggcccgggtc tggataacga tctcatgaac 240gagcccatgg gtctcggcgg tctgggagga ggtggcggcg gtggcggcaa gaagcacgac 300cgcggtggcg gcggtggttc cggtacgcgg aaaatgagca gcggtggcgg cggcggtgat 360cacgaccacg gtctttcctc caaggaaaaa tacgagcagc acaagatcac cagctacctg 420acgtccaaag gtggatcggg cggcggcgga ggaggaggag gcggcggttt ggatcgcaac 480tccggcaatt acttcaacga cgcgaaagag gagagcgaca gcgaggattc tgtaacgttc 540gagttcgtcc ctaacaccaa gaagcaaaag tgcggctag
Claims (3)
1.一种重组人巨细胞病毒融合蛋白，即人巨细胞病毒PP150蛋白C端从第1024个氨基酸到第1048个氨基酸的25个氨基酸和gp52蛋白C端从第270个氨基酸到第433个氨基酸的164个氨基酸串联形成的融合蛋白，PP150蛋白C端的25个氨基酸在融合蛋白N端，gp52蛋白C端的164个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，其中gp52蛋白C端164个氨基酸内的第162个氨基酸由赖氨酸(Lys)替换为天冬酰酸(Asn)，融合蛋白的N端增加了1个蛋基酸(Met)，全长192个氨基酸，其氨基酸序列为：
Met Gly Gly Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu Gln
5 10 15
Lys Ile Glu Lys Ile Lys Asn Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Phe Gln
20 25 30
Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser
35 40 45
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn Ala
50 55 60
Gly Gly Leu His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn
65 70 75 80
Glu Pro Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 0 95
Lys Lys His Asp Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser Lys
115 120 125
Glu Lys Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gly Asn Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp
165 170 175
Ser Val Thr Phe Glu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Asn Cys Gly
180 185 190
2.权利要求1所述的重组人巨细胞病毒融合蛋白的制备方法，该蛋白是利用基因工程技术制备，具体方法如下：HCMV PP150蛋白C端基因片段的合成及复性：
通过计算机分析HCMV PP150蛋白的氨基酸序列，发现HCMV PP150蛋白的C端的25个氨基酸可形成较强的抗原决定簇，25个氨基酸为：Gly Gly Ala Lys ThrPro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu Gln Lys Ile Glu Lys Ile Lys Asn Thr GluGlu；
选用这些氨基酸的细菌偏爱密码子，合成两条互补的DNA片段，正链为：5’-
CATGGGC GGT GCT AAA ACT CCG TCT GAC GCT GTT CAG AACATC CTG CAG AAAATC GAA AAA ATC AAA AAC ACT GAA GAA G-3’；负链为：5’-
GATCC TTC TTC AGT GTTTTT GAT TTT TTC GAT TTT CTG CAG GAT GTT CTG AAC AGC GTC AGA GGG AGT TTT AGCACC GCC-3’，两条链的5’端均进行了磷酸化，两条链退火和复性后形成上述25个氨基酸的基因片段，并且在5’端形成一个NcoI粘性末端，在3’端形成一个BamHI粘性末端，使该基因片段易于克隆至质粒pET28a(+)内的NcoI和BamHI酶切位点内；HCMV gp52蛋白C端抗原表位的筛选及基因片段的克隆：
1)抗原表位的筛选
通过计算机分析HCMV gp52蛋白的全部氨基酸序列，筛选出gp52蛋白内的强抗原表位，即从第270个氨基酸到第433个氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下：
筛选gp52内的抗原表位氨基酸序列(270aa～433aa)：
Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn SerGly Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn AlaGly Gly Leu His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn Glu Pro MetGly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys His Asp Arg GlyGly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp HisAsp His Gly Leu Ser Ser Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr LeuThr Ser Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp ArgAsn Ser Gly Asn Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp Ser ValThr Phe Glu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys Gly
筛选的蛋白抗原表位的DNA序列(808～1302bp)：GAA CCT TTC CAG CGT GGC GAT CCC TTC GAC AAA AAT TAC GTC GGG AAC AGC GGC AAGTCG CGT GGC GGC GGC GGT GGT GGC GGC AGC CTC TCT TCG CTG GCC AAT GCC GGC GGTCTG CAT GAC GAC GGC CCG GGT CTG GAT AAC GAT CTC ATG AAC GAG CCC ATG GGT CTCGGC GGT CTG GGA GGA GGT GGC GGC GGT GGC GGC AAG AAG CAC GAG CGC GGT GGC GGCGGT GGT TCC GGT ACG CGG AAA ATG AGC AGC GGT GGC GGC GGC GGT GAT CAC GAC CACGGT CTT TCC TCC AAG GAA AAA TAC GAG CAG CAC AAG ATC ACC AGC TAC CTG ACG TCCAAA GGT GGA TCG GGC GGC GGC GGA GGA GGA GGA GGC GGC GGT TTG GAT CGC AAC TCCGGC AAT TAC TTC AAC GAC GCG AAA GAG GAG AGC GAC AGC GAG GAT TCT GTA ACG TTCGAG TTC GTC CCT AAC ACC AAG AAG CAA AAG TGC GGC TAA
2)gp52蛋白C端抗原表位的基因克隆
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，设计的上游引物为P1(808-825bp)：5’-CGGGATCCGAACCTTTCCAGCGTGGC-3’；下游引物为P2(1285-1302bp)：5’-CGAATTCTTAGCCGCAGTTTTGCTTCTT-3’，在上游引物上增加了BamH I酶切位点，在下游引物上增加了EcoR I酶切位点及终子密码子，另外，合成引物时对下游引物的序列进行了定点突变，由原来的碱基C改为碱基G(斜体)，该密码子编码的氨基酸由Lys(K)变为Asn(N)；
取HCMV(AD169株，由中国药品生物制品所提供)细胞培养上清200μl，加100μl蛋白酶K(10mg/ml)，置56℃水浴4小时，用酚/氯仿法纯化HCMV DNA，将获得的HCMV DNA溶于20μl去离子水内，置-20℃冻存备用；
以上述提纯的HCMV DNA为模板，用引物P1、P2 PCR扩增gp52蛋白C端抗原表位的基因片段，扩增条件为：94℃30秒、65℃30秒、72℃60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟，电泳回收、纯化扩增的基因片段，溶于去离子水内，置-20℃冻存备用；表达融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用NcoI和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。将合成的PP150C端多肽的基因片段正、负链分别溶于缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH7.4、50mmol/L NaCl)内，溶解后两条链的终浓度相同，取等量正、负链溶液置于同一离心管内混匀，置100℃水溶内变性5min，取出后置室温自然冷却，使两条链复性为双链基因片段，其5’形成NcoI粘性末端，3’端形成BamH I粘性末端；
用用EcoRI和BamHI双酶切纯化的gp52基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内；
取等摩尔浓度的上述三种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使PP150蛋白C端基因片段与gp52基因片段串联插入到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白；重组质粒的筛选与鉴定：
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg/ml)LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和个对照菌(质粒pET28a转化菌)，分别提取质粒，首先用Nde I酶切分析，在质粒pET28a(+)内存一个Nde I酶切位点(位于Nco I和BamH I位点之间)，当外源基因插入Nco I和BamH I位点之间后，两位点之间的NdeI酶切位点被去掉，因此重组后的质粒不能被Nde I酶切开，而非重组的质粒则会被Nde I切开，将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有串联的PP150蛋白C端基因片段与gp52基因片段，序列完全正确：
ATG GGC GGT GCT AAA ACT CCG TCT GAC GCT GTT CAG AAC ATC CTG CAG AAAATC GAA AAA ATC AAA AAC ACT GAA GAA
GGA TCC GAA CCT TTC CAG CGT GGC GAT CCCTTC GAC AAA AAT TAC GTC GGG AAC AGC GGC AAG TCG CGT GGC GGC GGC GGT GGT GGCGGC AGC CTC TCT TCG CTG GCC AAT GCC GGC GGT CTG CAT GAC GAC GGC CCG GGT CTGGAT AAC GAT CTC ATG AAC GAG CCC ATG GGT CTC GGC GGT CTG GGA GGA GGT GGC GGCGGT GGC GGC AAG AAG CAC GAC CGC GGT GGC GGC GGT GGT TCC GGT ACG CGG AAA ATGAGC AGC GGT GGC GGC GGC GGT GAT CAC GAC CAC GGT CTT TCC TCC AAG GAA AAA TACGAG CAG CAC AAG ATC ACC AGC TAC CTG ACG TCC AAA GGT GGA TCG GGC GGC GGC GGAGGA GGA GGA GGC GGC GGT TTG GAT CGC AAC TCC GGC AAT TAC TTC AAC GAC GCG AAAGAG GAG AGC GAC AGC GAG GAT TCT GTA ACG TTC GAG TTC GTC CCT AAC ACC AAG AAGCAA AA
C TGC GGC TAA
构建的重组质粒表达PP150蛋白C端(25个氨基酸)与gp52蛋白C端(164个氨基酸)的融合蛋白，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，其中gp52蛋白C端164个氨基酸内的第162个氨基酸由赖氨酸(Lys)替换为天冬酰酸(Asn)，融合蛋白的N端增加了一个蛋基酸(Met)，全长192个氨基酸，其氨基酸序列即权利要求1内所示的序列；表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为22000的融合蛋白，表达量约为35％，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；表达融合蛋白的纯化：
1)表达融合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.15、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT)内，冰浴超声破菌10min，离心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，弃沉淀，收集的上清用于下一步的离子交换纯化；
2)DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化
将DEAE-Sepharose FF阴离子柱连接至常压层析系统，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.15、1mmol/L EDTA、0.1mMmol/L DTT)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min，上样后用平衡液冲洗，然后依次用含50、100、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl洗脱峰蛋白，该峰含表达的融合蛋白；
3)S-Sepearse FF阳离子柱纯化
将上步DEAE-Sepharose FF阴离子纯化获得的含融合蛋白的洗脱峰(100mmol/L NaCl峰)，装入透析袋内，对透析液(20mmol/L PB(pH7.4)、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)搅拌透析4h，用上述透析液冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将透析后的融合蛋白直接上样，上样流速1.5ml/min，上样结束后用透析液充分洗柱，再依次用含50、100、1000 mmol/L NaCl的透析液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl洗脱峰蛋白，即为纯化的融合蛋白；
3.权利要求1或2所述的重组人巨细胞病毒融合蛋白，在检测人巨细胞病毒抗体或抗原及在制备抗人巨细胞病毒单抗和多抗中的应用。
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