CN108490173A - 一种多重液相芯片检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种多重液相芯片检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多重液相芯片检测方法及试剂盒，以HSV‑1病毒培养物及BV gD、SIV p27、SRV p27、HTLV‑1envelope重组蛋白分别作为BV、SIV、SRV、STLV的抗原进行不同编号磁珠的包被，以包被了不同抗原的磁珠为载体，在BV、SIV、SRV和STLV抗体单一液相芯片检测方法的基础上，建立同时检测猴BV和其他三种逆转录病毒共4种抗体的多重液相芯片检测方法，为BV、SIV、SRV和STLV抗体监测提供一种快速、有效、高通量的检测方法。

Description

一种多重液相芯片检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及实验动物病毒病检测领域，更具体地说，涉及一种快速、准确、高通量检测猴疱疹病毒、猴免疫缺陷病毒、猴D型逆转录病毒和猴嗜T淋巴细胞白血病病毒的多重液相芯片检测方法及试剂盒。
背景技术
非人灵长类动物因其与人类相似的生理生化、免疫、遗传等特征，俨然成为探索、解决人类健康和疾病问题的理想动物模型。随着国际市场对实验猴需求量的增加，对实验猴的质量也提出了更为严格的要求，实验猴从普通级向无特定病原体级(specificpathogen free,SPF)发展是必然趋势。国际上对SPF级猴的定义主要指体内不含猴疱疹病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆转录病毒、猴嗜T淋巴细胞白血病病毒等特定病毒的猴。另外，美国Charles River Laboratories(CRL)曾提出了获得全球众多实验动物使用者认可的无病毒抗体(virus antibody free，VAF)的概念，该标准满足实验动物繁育的要求也符合科研使用的实际需要。
BV(Monkey B virus,Cercopithecine herpesvirus 1)在分类上属疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科纯疱疹病毒属。猴是B病毒的自然宿主，感染率可达10～60％，多数情况下呈良性经过，但人类感染主要表现为脑脊髓炎症状，常导致病人死亡。迄今为止，猴B病毒的基因组序列并未完全测序，但已获得的序列与HSV的序列有较高的同源性。感染动物研究发现，猴病毒感染后，囊膜糖蛋白gB、gC和gD的抗体出现时间最早(感染后7d产生)、滴度最高，在体内维持时间也最长(2年以上)，表明囊膜蛋白具有较好的免疫原性和反应原性，是病毒诊断和防治研究的主要靶点。Perelygina等人表达了从猴B病毒gD表位库中筛选出的一个免疫优势表位(gD362-370)，该表位位于猴B病毒的C端，高度保守，不存在于HSV-1或HSV-2中，在临床猴B病毒血清的检测中表明95％的阳性血清能够和该表位反应，而HSV-1和HSV-2抗血清并不与该表位反应，故研究中选取HSV-1病毒培养物及gD重组蛋白作为B病毒单一液相芯片检测技术的抗原进行微球包被。
SIV(simian immunodeficiency virus)属逆转录病毒科慢病毒属，是RNA病毒，猴艾滋病(AIDS)的致病因子之一。其在天然宿主中不致病，只有跨种族感染才会出现类似人AIDS的免疫缺陷症状。衣壳蛋白p27构成SIV病毒粒子双层壳的内壳，其氨基酸序列较为保守，含有诱导机体体液免疫和细胞免疫的主要抗原决定簇，而且同属病毒的衣壳蛋白具有相同或相似的抗原性，即具有群抗原牲，因此被认为是SIV抗原检测的标志物。
SRV(Simian type D retrovirus)属于逆转录病毒科正逆转录病毒亚科β逆转录病毒属，是单链RNA病毒，猴艾滋病(AIDS)的又一致病因子。其可分为内源性病毒(SERV)和外源性病毒(SRV)，比较SERV与SRV核酸序列的进化，表明SERV是SRV的祖先。目前已发现SRV有7个血清型，SRV-1、3、5主要流行在亚洲和印度恒河猴中，SRV-2主要流行在东南亚食蟹猴和豚尾猴中，SRV-4很少流行，主要从日本食蟹猴分离到，SRV-6从印度长尾叶猴分离到，SRV-7从野生印度恒河猴分离到。其中，SRV-1～3已测序完成，核衣壳蛋白p27的氨基酸序列高度保守。
STLV-1(simian T-cell lymphotropicvirus)属于RNA肿瘤病毒亚科，δ逆转录病毒属，主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的病变或免疫机能紊乱，从而干扰试验研究。HTLV-1和STLV-1(人T淋巴细胞白血病毒1型)在进化系统树上是无法分开，在核酸序列上有90％～95％的同源性且有完全的血清学交叉反应，用HTLV-1抗原检测实验猴STLV-1型的抗体已经被国家标准肯定。
液相芯片技术同时也称为xMAP技术(flexible multiple-analyte profiling)，国际上，CRL率先使用luminex的xMAP技术进行实验动物的质量监测。Luminex技术是以流式细胞技术、ELISA技术、化学发光技术、快速信号处理技术等技术为基础所研发的一种新型的高通量大分子检测平台，是最早通过FDA认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
在进出口贸易检疫中，一般采用血清学检测法：一种方法是采用细胞系对分离到的病毒进行培养，然后收集其分泌液作为抗原来检测猴群中血清相应抗体的含量，这种方法不但成本较高而且对工作人员的安全有较高的威胁；另一种方法是使用商品化的ELISA试剂盒来检测病毒抗体，这也是病毒检测的“金标准”，但当检测项目较多时，则存在费时、费力、成本高等问题。因此，将luminex xMAP检测技术平台灵活应用于实验动物质量的监测和诊断可实现高通量、快速、同步检测的目的，克服以上两大难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述不足，提供一种能够同时检测猴BV、SIV、SRV和STLV抗体的多重液相芯片检测方法及试剂盒，满足快速、准确、高通量的动物疫病监测要求。
本发明的目的通过以下技术方案给予实现：
一种同时检测猴疱疹病毒、猴免疫缺陷病毒、猴D型逆转录病毒和猴嗜T淋巴细胞白血病病毒抗体的液相芯片试剂盒，该试剂盒含有偶联的磁珠组及检测抗体。
所述的偶联磁珠组为4种分别偶联有HSV-1病毒培养物及BV-gD重组蛋白、SIV-p27重组蛋白、SRV-p27重组蛋白、HTLV-1envelope重组蛋白的偶联磁珠。
本研究使用的HSV-1病毒培养物为广州莱姆生物科技有限公司赠送。本研究应用生物学软件SignalP 4.1Server对BV gD基因进行信号肽分析，去除gD的信号肽，选择抗原表位较多的区域26aa～394aa。由于gD基因的核酸序列GC含量超过75％，且B病毒核酸难以获得，故将序列送至上海生工进行优化合成并构建BV-gD-28a表达质粒，以获得gD包涵体蛋白。对gD包涵体蛋白进行透析复性，去除影响重组蛋白与微球偶联的化学因素。载体中自带的His标签有利于重组蛋白的纯化操作。表达条件为：TPTG终浓度为1mM，温度为20℃，诱导时间为24h。
选取SIV p27基因进行原核表达，成功表达了具有免疫原性的SIV-p27-32a重组蛋白，以建立猴免疫缺陷病毒检测方法，pET-32a载体中的Trx标签有助于目的蛋白形成可溶性折叠蛋白。表达条件为：TPTG终浓度为1mM，温度为37℃，诱导时间为5h。
SRV为单链RNA病毒，不同的血清型之间呈现交叉反应，主要发生在核衣壳蛋白p27和跨膜蛋白gp20～gp22区域，在D型逆转录病基因组中他们是高度保守的一段序列。研究以p27基因为目的序列，构建了原核表达载体SRV-p27-4T，成功表达了具有免疫原性的SRV-p27-4T重组蛋白，以建立猴D型逆转录病毒检测方法。pGEX-4T-1载体的GST标签具有增加蛋白的可溶性，减少包涵体的形成的作用，使得SRV-p27-4T重组蛋白以上清的形式表达。表达条件为：TPTG终浓度为1mM，温度为20℃，诱导时间为24h。
STLV Env基因编码产物为糖基化蛋白前体，可裂解为膜蛋白gp46和跨膜蛋白gp21，这两种包膜糖蛋白决定着病毒感染的宿主范围，并能诱导机体产生免疫应答。用HTLV-1抗原检测实验猴STLV-1型的抗体已经被国家标准肯定。研究以HTLV-1Enveloprecombinant作为STLV-1检测方法的与微球偶联的抗原，该蛋白纯度高达95％，且实验证明其STLV阳性血清具有很强的免疫反应。
进一步地，所述的检测抗体为藻红蛋白标记的山羊抗猴IgG抗体(Goat anti-Rhesus monkey IgG H&L antibody)。
进一步地，所述的偶联磁珠的制备方法为：将4种不同编号(28#、35#、43#和63#)的空白磁珠活化后，用偶联缓冲液重悬并分散磁珠，分别加入HTLV-1envelope重组蛋白溶液、SRV-p27重组蛋白溶液、HSV-1病毒培养物及BV-gD重组蛋白混合物溶液、SIV-p27重组蛋白溶液，混匀后室温避光下进行偶联反应2～4小时，离心去上清，获得4种包被不同抗原的磁珠，即偶联磁珠。其中，偶联缓冲液为50～100mM乙磺酸(MES)，pH 5.0～6.0。
进一步地，空白磁珠活化步骤如下：
(1)磁珠预处理：取4种不同编号(28#、35#、43#和63#)的空白磁珠，离心弃上清，用活化缓冲液重悬磁珠，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，离心后弃上清，重复才做2～3次；
(2)磁珠的活化：将预处理的磁珠分别用活化缓冲液重悬，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，再依次加入氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐溶液(Sulo-NHS)和碳二亚胺溶液(EDC)，混匀后，室温避光作用20min，以得到活化磁珠。
(3)所述活化缓冲液为100mM NaH2PO4，pH 6.2；Sulo-NHS浓度为50mg/mL；EDC浓度为50mg/mL。
进一步地，研究中所使用的蛋白溶液的浓度1～20μg/mL。
进一步地，一种同时检测猴疱疹病毒及其他三种逆转录病毒抗体的方法，其特征在于，采用上述任一液相芯片进行检测，包括步骤如下：
(1)偶联磁珠与样品中的抗体结合：将偶联磁珠与预处理的样品于室温、避光、震荡孵育1～2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；
(2)加入检测抗体及反应：将PE标记的抗猴IgG抗体加入至上一步反应体系中，于室温、避光、震荡孵育30～60min，用洗涤缓冲液洗涤3次；
(3)结果检测：往反应体系中加入洗涤缓冲液，室温、避光、震荡60s，置于Luminex200液相芯片系统读取荧光强度。
(4)结果分析：先计算阴性对照血清的平均荧光强度值和标准差，以阴性血清的平均荧光强度值与3倍标准差的和作为临界值，高于临界值视为阳性。
研究中洗涤缓冲液为PBS-TBN(PBS，0.1％BSA，0.02％Tween-20，0.05％叠氮钠)，pH 7.4。
本发明所述的检测方法能够同时检测BV、SIV、SRV和STLV抗体，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以荧光微球免疫分析技术为基础，分别以HSV-1病毒培养物及猴疱疹病毒囊膜蛋白gD、猴免疫缺陷病毒核衣壳蛋白p27、猴D型逆转录病毒核衣壳蛋白p27、HTLV-1Env重组蛋白偶联的不同微球为载体，在BV、SIV、SRV和STLV抗体单一液相芯片检测方法的基础上，建立既可以单独检测某一种病原的抗体，还可以同时检测4种抗体的多重液相芯片检测方法，不仅为BV、SIV、SRV和STLV抗体检测提供一种更有效、快速的检测方法，还节约了样本量及人力资源。同时，针对我国养猴业快速发展、对猴子质量要求的不断提高、猴病混合感染现象较为普遍及兼顾养殖人员的人身安全等现实情况，非常有必要进一步加强猪群疫病情况进行准确、有效、快速、高通量地诊断和检测。
附图说明
图1为BV-gD-28a重组目的蛋白纯化结，其中M：Thermo预染蛋白Maker(10～180kDa)；1：BV-gD-28a包涵体蛋白；2：流穿液；3-6：蛋白洗涤液1-4；7-14：蛋白洗脱液1-8。
图2为HTLV-1envelope、HSV-1和BV-g-28混合物、SIV-p27-32a和SRV-p27-4T四种蛋白SDS-PAGE检测结果，其中M：Thermo预染蛋白Maker(10～180kDa)；1：HTLV-1envelope蛋白；2：HSV-1和BV-g-28重组蛋白混合物；3：SIV-p27-32a重组蛋白；4：SRV-p27-4T重组蛋白。
图3为SIV-p27-32a重组蛋白纯化SDS-PAGE检测结果，其中M：TAKARA低分子量蛋白标准；1：流穿液；2～8：洗脱液1～7。
图4为SRV-p27-4T重组蛋白纯化结果，其中M：Thermo预染蛋白Maker(10～180kDa)；1：SRV-p27-4T上清蛋白；2：流穿液；3-5：蛋白洗涤液1-3；6-12：蛋白洗脱液1-7。
图5为抗原最佳包被浓度摸索试验结果图，其中A：BV抗原最佳包被浓度摸索结果；B：SIV抗原最佳包被浓度摸索结果；C：SRV抗原最佳包被浓度摸索结果；D：HTLV抗原最佳包被浓度摸索结果(注：Positive：阳性血清组；Negative：阴性血清；SRV PC：SRV阳性对照)。
图6为二抗最佳浓度摸索试验结果图，其中A：BV二抗最佳浓度摸索结果；B：SIV二抗最佳浓度摸索结果；C：SRV二抗最佳浓度摸索结果；D：STLV二抗最佳浓度摸索结果(注：Positive：阳性血清组；Negative：阴性血清；SRV PC：SRV阳性对照)。
图7为BV、SIV、SRV和STLV液相芯片检测方法特异性检测试验结果，其中A：BV液相芯片检测方法特异性检测试验结果；B：SIV液相芯片检测方法特异性检测试验结果；C：SRV液相芯片检测方法特异性检测试验结果；D：STLV液相芯片检测方法特异性检测试验结果(注：PC：阳性对照；NC：阴性对照；BC：空白对照)。
图8为BV、SIV、SRV和STLV液相芯片检测方法灵敏性检测试验结果，其中A：BV液相芯片检测方法灵敏性检测试验结果；B：SIV液相芯片检测方法灵敏性检测试验结果；C：SRV液相芯片检测方法灵敏性检测试验结果；D：STLV液相芯片检测方法灵敏性检测试验结果(注：Cut-off值＝阴性血清的均数与3倍标准差的和)。
图9为BV、SIV、SRV和STLV液相蛋白芯片检测方法与ELISA检测方法比较试验结果，其中A：BV液相蛋白芯片检测方法与ELISA检测方法比较试验结果；B：SIV液相蛋白芯片检测方法与ELISA检测方法比较试验结果；C：SRV液相蛋白芯片检测方法与ELISA检测方法比较试验结果；D：STLV液相蛋白芯片检测方法与ELISA检测方法比较试验结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、或者条件所做的简单修改或者替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
一、BV-gD-28a重组蛋白的制备
1.BV-gD-28a重组质粒的获得
根据GeneBank登录号AAP41483.1的基因序列，剔除BV gD中的信号肽序列等，选取择抗原表位较集中的区域26aa～394aa对应的基因序列，并将序列送至上海生工进行优化合成并构建BV-gD-28a表达质粒。
2.BV-gD-28a重组蛋白的表达
将BV-gD-28a重组质粒转化入Transetta(DE3)感受态细胞(购自北京全式金)中，获得含有BV-gD-28a重组质粒的Transetta(DE3)大肠杆菌。将该菌种接种至含有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)液体培养基中，培养物OD值达到0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃培养4h后，离心收集菌体，冰浴超声破碎，再次离心后，沉淀物和上清液分别进行SDS-PAGE检测，分析表达产物的溶解性。检测结果表明，BV-gD-28a蛋白主要以包涵体的形式存在。
3.BV-gD-28a重组蛋白的纯化
往超声破碎后的沉淀中加入适量的Buffer B(含有8M尿素)溶液，将沉淀重悬后，震荡混匀2h，4℃，12000rpm离心20min，收集上清，即为溶解后的包涵体蛋白。溶解后的包涵体蛋白经滤器(0.45μm)过滤，用GE填料填充的Ni2+亲和层析柱(Qiagen)过柱纯化。主要操作步骤如下：放掉纯化柱中20％乙醇溶液，用6倍柱体积的去离子水冲洗层析柱；用6～10倍柱体积的Buffer B平衡层析柱；将BV-gD-28a包涵体蛋白加入至层析柱中，与His-tag Resin混合孵育作用1～3h；将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集流穿液；用6～10倍柱体积的蛋白洗涤液(含有8M尿素，20mM咪唑)洗柱；最后用蛋白洗脱液(含有8M尿素，250mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集蛋白洗脱液。
用分光光度计测定分段收集的目的蛋白的浓度，并进行SDS-PAGE纯度检测。SDS-PAGE纯度检测结果如图1所示。
4.BV-gD-28a重组蛋白的透析复性
由于包涵体蛋白中的尿素会影响磁珠的包被效率，因此复性缓冲液的介质定为PBS，根据实验需要加入适当浓度的尿素进行透析复性。复性过程为：6M尿素浓度的复性液，4℃，透析6～8h；5M尿素浓度的复性液，4，透析6～8h；3M尿素浓度的复性液，4℃，透析6～8h；2M尿素浓度的复性液，4℃，透析6～8h；1M尿素浓度的复性液，4℃，透析6～8h h；0.5M尿素浓度的复性液，4℃，透析6～8h；PBS溶液，4℃，透析6～8h。收集透析复性后的蛋白。将HSV-1病毒培养物与BV-gD-28a重组蛋白进行混合，混合后的蛋白液用分光光度计测定混合目的蛋白的浓度，并进行SDS-PAGE纯度检测，SDS-PAGE纯度检测结果如图2所示。
二、SIV-p27-32a重组蛋白的制备
1、SIV-p27-32a重组质粒的获得
根据Genebank登录号KF051800.1中SIV病毒基因组序列设计一对引物扩增SIV-P27基因片段，扩增约701bp基因片段，引入限制性酶切位点EcoRI和XbaI，分别插入表达质粒pET-32a(+)的相应多克隆酶切位点。引物由上海生工合成，序列如下：
SIV-p27-F:5’-GAATTCCCAGTACAACAAATAGGTG-3；
SIV-p27-R:5’-CTCGAGTCATTAATCTAGCCTTCTGT-3。
PCR反应体系参照TAKARA公司试剂Ex-tag酶使用说明配制，反应程序如下：94℃3min，1个循环；94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec，30个循环；72℃后延伸10min。PCR产物及质粒pET-32a(+)分别经EcoRI和XbaI限制性内切酶酶切后用DNA回收试剂盒回收。经T4连接酶16℃连接过夜，转化感受态DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行PCR鉴定。获得的阳性转化菌SIV-p27-32a-DH5α，接种含有氨苄抗生素的LB培养液培养，抽提重组质粒SIV-p27-32a，用EcoRI和XbaI内切酶进行了双酶切鉴定。最终获得经PCR和酶切鉴定为阳性及上海英骏公司进行测序正确的SIV-p27-32a重组质粒。
2.SIV-p27-32a重组蛋白的表达
将SIV-p27-32a重组质粒转化入Transetta(DE3)感受态细胞中，获得含有SIV-p27-32a重组质粒的Transetta(DE3)大肠杆菌。将该菌种接种至含有氨苄LB液体培养基中，培养物OD值达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃培养4h后，离心收集菌体，冰浴超声破碎，再次离心后，沉淀物和上清液分别进行SDS-PAGE检测，分析表达产物的溶解性。检测结果表明，SIV-p27-32a蛋白主要以包涵体的形式存在。
3.SIV-p27-32a重组蛋白的纯化
操作步骤同BV-gD-28a重组蛋白的纯化一致。
用分光光度计测定分段收集的目的蛋白的浓度，并进行SDS-PAGE纯度检测。SDS-PAGE纯度检测结果如图3所示。
4.SIV-p27-32a重组蛋白的透析复性
操作步骤同BV-gD-28a重组蛋白的透析复性一致。用分光光度计测定目的蛋白的浓度，并进行SDS-PAGE纯度检测，SDS-PAGE纯度检测结果如图2所示。
三、SRV-p27-4T重组蛋白的制备
1、SRV-p27-4T重组质粒的获得
利用美基生物公司的病毒总RNA柱式提取试剂盒提取SRV1病毒RNA，并采用随机引物进行反转录成cDNA。逆转录体系为：dNTP(each 10uM)1uL，Radom 6mers(20uM)1uL，病毒RNA 8uL，总体积10uL；反应程序为：65℃5min，4℃for ever。
根据Genebank登录号M11841.1中SRV病毒基因组序列设计一对引物扩增SRV-P27基因片段，扩增约650bp基因片段，引入限制性酶切位点EcoRI和Xho I，分别插入表达质粒pGEX-4T-1的相应多克隆酶切位点。引物由上海生工合成，序列如下：
SRV-p27-F：5’-GAATTCCCAGTAACTGAAACTGTCGA-3’
SRV-p27-R：5’-CTCGAGCATGGCTAAGCCCTGTTGAT-3’
PCR反应体系参照TAKARA公司试剂Ex-tag酶使用说明配制，反应程序如下：94℃3min，1个循环；94℃40sec，58℃40sec，72℃60sec，35个循环；72℃后延伸10min。PCR产物及质粒pGEX-4T-1分别经EcoRI和Xho I限制性内切酶酶切后用DNA回收试剂盒回收。经T4连接酶16℃连接过夜，转化感受态DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行PCR鉴定。获得的阳性转化菌SRV-p27-4T-DH5α，接种含有氨苄抗生素的LB培养液培养，抽提重组质粒SRV-p27-4T，用EcoRI和Xho I内切酶进行了双酶切鉴定。最终获得经PCR和酶切鉴定为阳性及上海英骏公司进行测序正确的SRV-p27-4T重组质粒。
2.SRV-p27-4T重组蛋白的表达
将SRV-p27-4T重组质粒转化入Transetta(DE3)感受态细胞中，获得含有SRV-p27-4T重组质粒的Transetta(DE3)大肠杆菌。将该菌种接种至含有氨苄LB液体培养基中，培养物OD值达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，20℃培养24h后，离心收集菌体，冰浴超声破碎，再次离心后，沉淀物和上清液分别进行SDS-PAGE检测，分析表达产物的溶解性。检测结果表明，SRV-p27-4T蛋白主要以上清可溶蛋白的形式存在。
3.SRV-p27-4T重组蛋白的纯化
将超声破碎后的上清溶液用滤器(0.45μm)过滤，用Qiagen的GST标签纯化树脂进行蛋白的纯化。主要操作步骤如下：放掉纯化柱中20％乙醇溶液，用6倍柱体积的去离子水冲洗层析柱；用6～10倍柱体积的PBS-EW溶液平衡层析柱；将上清蛋白加入至层析柱中，与GST-tag Resin混合孵育作用1～3h；将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集流穿液；用6～10倍柱体积的PBS-EW溶液洗柱；最后用TNGT溶液洗脱目的蛋白，收集蛋白洗脱液。用分光光度计测定分段收集的目的蛋白的浓度，并进行SDS-PAGE纯度检测(如图4所示)。由于蛋白洗脱液中的化学成成分将影响下一步的磁珠包被效率，故收集纯化后的蛋白，用PBS透析数次，以更换缓冲液。对透析后的目的蛋白进行收集，用分光光度计测定目的蛋白的浓度，并进行SDS-PAGE纯度检测(如图2所示)。
实施例1一种同时检测猴BV、SIV、SRV和STLV抗体的多重液相芯片中的偶联磁珠的制备方法
一、重组蛋白
本研究中采用的HSV-1病毒培养物为广州莱姆有限公司馈赠，HTLV-1Enveloprecombinant从RayBiotech购买。BV-gD为上海生工构建的重组质粒，SIV-p27和SRV-P27本实验室自主构建重组质粒，以上三者重组质粒利用大肠杆菌表达系统表达获得。各包被用抗原信息如表1所示。
表1试验用包被抗原相关信息表
二、抗原与磁珠的偶联
参照Luminex公司的技术大全，通过两步酰胺反应达到活化磁珠的目的：首先磁珠经Na2HPO4缓冲液、Sulfo-NHS和EDC溶液成为活化状态，其次BV抗原(HSV-1培养物与BV-gD重组蛋白混合物)、SIV-p27重组蛋白、SRV-p27重组蛋白和HTLV-1Env蛋白作为抗原分别与磁珠形成共价酰胺键，与抗原偶联的磁珠用PBS-TBN溶液重悬于4℃避光保存。具体操作步骤如下：
(1)漩涡仪振荡磁珠悬液1min，使微球均匀散开，根据实验目的取适量的磁珠于低吸附离心管中，8000g，离心3min，并放于磁力架上，轻轻吸弃上清(不要吸走微球)；
(2)加入100μL ddH2O，涡旋1min，再8000g，离心3min，并放于磁力架上，轻轻吸弃上清；
(3)加入80μL 100mM pH6.2的Na2HPO4溶液，涡旋1min，重悬微球；
(4)加入10μL 50mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-Hydroxysulfosuccinimiesodium salt,N-Sulfo-NHS)，和10μL 50mg/mL 1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺[1-thyl-3-(3-Dimethylaminoproy)carbodimideHydrochloride，EDC]，涡旋1min，室温避光孵育20min；
(5)8000g，离心3min，并放于磁力架上，轻轻移走上清；
(6)加入250μL 50-100mM pH 5.0-6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(2-(N-Moropholino)ethanesulfonicacid，MES)，涡旋1min，并放于磁力架上，轻轻移走上清；
(7)重复步骤(6)一次。
(8)往上述活化后的微球中加入100μL 50-100mM pH 5.0-6.0的MES，涡旋1min，分别在混匀的磁珠中加入1～20μg的蛋白抗原(加入的抗原量视不同抗原而定)，再用MES溶液定容至500μL，涡旋1min；
(9)室温、避光条件下缓慢震荡孵育2h，8000g，离心3min离，并放于磁力架上，轻轻移走上清；
(10)再加入500-1000μL PBS-TBN，涡旋混匀后，8000g，离心3min，并放于磁力架上，轻轻移走上清；
(11)重复操作步骤(10)一次；
(12)加入适量PBS-TBN重悬磁珠，即得偶联抗原的磁珠：BV-43、SIV-63、SRV-35，STLV-28，4℃避光保存。
实施例2利用实施例1建立一种同时检测猴BV、SIV、SRV和STLV抗体的多重液相芯片检测方法
一、单重液相蛋白芯片检测技术
参照Luminex公司的技术大全，具体步骤如下：
(1)每孔加入50μL(约2500个)偶联有抗原的磁珠和50μL已处理的待检测样品(血清)，室温震荡(500r/min)避光孵育1～2h，用PBS-TBN溶液洗涤3次，200μL/孔。
(2)加入已经稀释好的PE标记的抗猴IgG抗体，100μL/孔，室温震荡(500r/min)避光孵育30～60min，用PBS-TBN溶液洗涤3次，200μL/孔。
(3)每孔加入100μL PBS-TBN溶液重悬，于Luminex 200液相芯片检测系统进行读取中位数荧光强度(MFI)。
(4)结果分析：以液相芯片检测系统对阴性对照血清进行3次重复检测，计算每份血清的平均荧光强度(Median Fluorescent Intensity,MFI)，计算阴性血清的均值(平均荧光强度)和标准差，以阴性血清的均数与3倍标准差的和(cut-off值)作为检测指标的临界值，高于临界值就视为该样品阳性。
二、抗原最佳包被浓度的确定
利用BCA(Thermo)蛋白浓度测定方法分别测定BV抗原、SIV-p27重组蛋白、SRVp27重组蛋白和HLTV-1env蛋白的浓度，进行磁珠包被。在本发明前期的大量研究筛选过程中，发现为使实验结果更为理想，不同抗原种类使用的浓度不尽相同，最终确定BV抗原的摸索浓度分别为：5μg、10μg、15μg和20μg；SIV-p27重组蛋白的摸索浓度分别为：1μg、2.5μg和5μg；SRV-p27重组蛋白的摸索浓度分别为：5μg、10μg、15μg和20μg；HTLV-1env蛋白的摸索浓度分别为：5μg、10μg和15μg。每个浓度3个重复，进行最佳浓度摸索检测。根据检测结果(如图5所示)，结合阳性对照MFI值与阴性对照MFI值的比值(P/N值)大小以及遵循降低阴性血清的背景值的原则，确定BV抗原、SIV-p27、SRV-p27和HTLV-1env的最佳包被浓度分别为：20μg、1μg、10μg和10μg。其中，研究中使用的SRV阳性对照(SRV PC)是从西山生物购买，货号：RPC1701，因购买的SRV PC已经稀释，故试验中不再进行稀释，直接使用。
三、二抗最佳浓度的确定
基于不同抗原所含的有效浓度不同可导致其检测灵敏度不同，BV、SIV和STLV阳性血清从1:50开始倍比稀释至1:400；SRV PC直接使用。在本发明前期的大量研究筛选过程中，发现PE标记的羊抗猴IgG二抗的检测浓度为1μg时即可达到试验的检测目的，过多则造成浪费，故试验摸索二抗的浓度分别为：2μg、1μg和0.5μg。试验以PBS-TBN溶液作为稀释缓冲液，每个稀释度3个重复，进行最佳二抗浓度检测。根据检测结果(如图6所示)，并综合考虑P/N值大小以及遵循降低阴性血清的背景值等因素，确定PE标记的羊抗猴IgG二抗的使用浓度为1μg。
四、特异性试验
利用本发明建立的液相芯片检测方法对猴常见疾病BV、SIV、SRV和STLV阳性对照进行检测，以验证该检测方法的特异性。在试验研究过程中未能收集到SIV、SRV和STLV单阳血清，故SIV、SRV和STLV阳性对照实为多种病原抗体阳性的血清，具体信息见表2。
表2BV、SIV、SRV和STLV阳性血清信息表
备注：(1)ELISA检测所采用的试剂盒为西山生物技术有限公司(VRL China)公司的BV、SIV、SRV和STLV抗体ELISA检测试剂盒，检测方法参照检测说明书进行操作；(2)结果以OD405≧0.3为阳性。
检测结果显示：应用BV液相芯片检测方法时，BV、SIV、SRV和STLV阳性对照检测结果均为阳性(图7A)，与ELISA检测结果完全一致；应用SIV液相芯片检测方法时，SIV阳性对照检测结果为阳性，BV、SRV阳性对照为弱阳性(图7B)，BV阳性对照检测结果与ELISA检测结果存在些许出入；应用SRV液相芯片检测方法时，仅有SRV阳性对照检测结果为阳性(图7C)，与ELISA检测结果完全一致；应用STLV液相芯片检测方法时，STLV阳性对照检测结果为阳性，SRV阳性对照检测值在临界值附近(图7D)，与ELISA检测结果基本一致。说明本研究建立的4个液相蛋白芯片检测方法特异性较好，与其它病毒阳性血清几乎无交叉反应。
五、灵敏性试验
用PBS-TBN溶液稀释阳性对照，BV PC、SIV PC和STLV PC从1:50开始进行2倍倍比稀释至1:102400，SRV PC进行2倍倍比稀释至1:128。采用上述步骤一至三建立的液相芯片检测方法和ELISA试剂盒对4种阳性对照稀释液检测、阴性血清对照及PBS-TBN溶液空白对照，每个稀释度重复检测3次，记录MFI值和OD值，计算平均值。
检测结果显示，对于BV PC，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:3200，与ELISA试剂盒检测的抗体效价一致；对于SIV PC，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:3200，ELISA试剂盒检测到的抗体效价最低为1:51200；对于SRV PC，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:8，与ELISA试剂盒检测的抗体效价一致；对于STLV PC，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:25600，而ELISA试剂盒检测到的抗体效价最低为1:1600。上述结果表明，本发明研制备的特定液相芯片与现有商品ELISA试剂盒的敏感性相当。
六、重复性试验
批内重复：根据现有的阳性对照情况，实验研究分别取BV阳性对照8份、SIV阳性对照4份、SRV阳性对照1份、STLV阳性对照2份及阴性对照15份，共30份。每份血清重复检测3次，记录MFI值，计算批内变异系数(CV)以评价该方法的批内精密度。
批间重复：样品与批内重复检测试验一致，每份血清3个重复，不同时间做3次，通过计算变异系数以评价该方法的批间精密度。
检测结果如表3和表4，结果显示，本发明方法BV、SIV、SRV和STLV液相蛋白芯片检测方法的批内变异系数(CV)分别为：0.30％～5.51％，平均CV为3.06％；0.79％～7.95％，平均CV为2.87％；0.72％～8.06％，平均CV为2.75％；0.43％～12.03％，平均CV为4.77％(表3)。批间变异系数(CV)分别为：0.48％～18.55％，平均CV为6.23％；3.75％～13.88％，平均CV为8.69％；4.01％～11.03％，平均CV为6.84％；2.49％～113.60％，平均CV为7.15％(如表4)。符合Luminex精密度的要求：批内CV为不大于10％，批间CV不大于20％，说明本研究建立的该检测方法具有良好的重复性。
表3批内重复性检测结果
表4批间重复性检测结果
实施例3利用实施例2建立的液相蛋白芯片检测方法与ELISA检测方法比较检测猴场样品
利用本研究建立的液相蛋白芯片检测方法与ELISA检测方法同时检测猴临床血清195份(包含BV、SIV、SRV和STLV阳性对照)，研究以ELISA检测结果为标准，通过MedCalc软件进行ROC分析，确定研究建立的液相蛋白芯片检测方法的灵敏度、特异性及诊断效果。
BV液相蛋白芯片检测方法检测195份临床血清样品，与ELISA检测方法比较，通过MedCalc软件进行ROC分析，结果显示，该检测方法的灵敏度为97.4％，特异性为94.9％，曲线下面积(Area under the ROC curve,AUC)为99.0％；SIV液相蛋白芯片检测方法检测195份临床血清样品，与ELISA检测方法比较，通过MedCalc软件进行ROC分析，结果显示，该检测方法的灵敏度为70.0％，特异性为53.5％，AUC为60.1％；SRV液相蛋白芯片检测方法检测195份临床血清样品，与ELISA检测方法比较，通过MedCalc软件进行ROC分析，结果显示，该检测方法的灵敏度为80％，特异性为89.5％，AUC为85.6％；STLV液相蛋白芯片检测方法检测195份临床血清样品，与ELISA检测方法比较，通过MedCalc软件进行ROC分析，结果显示，该检测方法的灵敏度为85.7％，特异性为97％，AUC为93.8％(如表5和图9所示)。BV、SIV、SRV和STLV四重液相蛋白芯片检测方法的检测结果表明，该方法具有诊断意义，其中BV、STLV和SRV具有较高的诊断准确性(AUC均大于85％)；与SIV ELISA检测结果相比，SIV液相蛋白芯片检测方法的诊断准确性较差，其原因可能是两种检测方法使用的检测抗原存在区别导致，但检测结果不一定说明研究建立的SIV液相蛋白检测方法不适用。
表5液相蛋白芯片检测方法ROC分析结果
检测方法 Sensitivity(％) Specificity(％) AUC(％)
BV 97.4 94.9 99.0
SIV 70.0 53.5 60.1
SRV 80.0 89.5 85.6
STLV 85.7 97 93.8

Claims (12)

1.一种多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有偶联的磁珠组及检测抗体。
2.根据权利要求1所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，所述的磁珠组分别由用于检测猴疱疹病毒的磁珠BV-43、检测猴免疫缺陷病毒的磁珠SIV-63、检测猴D型逆转录病毒的磁珠SRV-35和检测猴嗜T淋巴细胞白血病病毒的磁珠STLV-28组成；所述的磁珠BV-43是HSV-1病毒培养物及BV-gD重组蛋白与第43号羧基化磁珠偶联获得；所述的磁珠SIV-63是SIV-p27重组蛋白与第63号羧基化磁珠偶联获得；所述的磁珠SRV-35是SRV-p27重组蛋白与第35号羧基化磁珠偶联获得；所述的磁珠STLV-28是HTLV-1 envelope重组蛋白与第28号羧基化磁珠偶联获得；
其中，BV-gD重组蛋白的制备方法包括以下步骤：
S11.去除信号肽获得表达gD蛋白的基因序列，选取第26个氨基酸至394个氨基酸位置对应的核酸序列，送至上海生工进行优化合成并将gD基因连接至pET-28a(+)载体，获得BV-gD-28a重组质粒；
S12.将BV-gD-28a重组质粒转入原核表达菌株诱导表达即可。
其中，SIV-p27重组蛋白的制备方法包括以下步骤：
S21.根据GeneBank中SIV病毒基因组序列设计一对特异性引物SIV-p27-F/SIV-p27-R扩增SIV-p27基因片段。SIV-p27-F/SIV-p27-R引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
S22.p27基因连接pET-32a(+)载体，获得SIV-p27-32a重组质粒，转入原核表达菌株诱导表达即可。
其中，SRV-p27重组蛋白的制备方法包括以下步骤：
S31.根据GeneBank中SRV病毒基因组序列设计一对特异性引物SRV-p27-F/SRV-p27-R扩增SRV-p27基因片段。SRV-p27-F/SRV-p27-R引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
S32.p27基因连接pGEX-4T载体，获得SRV-p27-4T重组质粒，转入原核表达菌株诱导表达即可。
3.根据权利要求2所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，S12所述表达条件为：IPTG终浓度为1mM，温度为20℃，诱导时间为24h；S22所述表达条件为：IPTG终浓度为1mM，温度为37℃，诱导时间为5h；S32所述表达条件为：IPTG终浓度为1mM，温度为20℃，诱导时间为24h。
4.根据权利要求1所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，所述的检测抗体为藻红蛋白标记的山羊抗猴IgG抗体(Goat anti-Rhesus monkey IgG H&L antibody)。
5.根据权利要求1所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，所述的偶联磁珠的制备方法为：将4种不同编号的空白磁珠活化后，用偶联缓冲液重悬并分散磁珠，分别加入HTLV-1 envelope重组蛋白溶液、SRV-p27重组蛋白溶液、HSV-1病毒培养物及BV-gD重组蛋白混合物溶液、SIV-p27重组蛋白溶液，混匀后室温避光条件下进行偶联反应2～4小时，离心去上清，获得4种包被不同抗原的磁珠，即偶联磁珠。
6.根据权利要求5所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，偶联缓冲液为50～100mM乙磺酸(MES)，pH 5.0～6.0。
7.根据权利要求5所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，空白磁珠活化步骤如下：
(1)磁珠预处理：取4种不同编号的空白磁珠，离心弃上清，用活化缓冲液重悬磁珠，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，离心后弃上清，重复操作2～3次；
(2)磁珠的活化：将预处理的磁珠分别用活化缓冲液重悬，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，再依次加入氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐溶液(Sulo-NHS)和碳二亚胺溶液(EDC)，混匀后，室温避光作用20min，以得到活化的磁珠。
8.根据权利要求7所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，所述活化缓冲液为100mM NaH2PO4，pH 6.2；Sulo-NHS浓度为50mg/mL；EDC浓度为50mg/mL。
9.根据权利要求5所述的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，所使用的蛋白溶液的浓度为1～20μg/mL。
10.一种多重液相芯片检测方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一所述的液相芯片进行检测，包括步骤如下：
(1)偶联磁珠与样品中的抗体结合：将偶联磁珠与预处理的样品于室温、避光条件下震荡孵育1～2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；
(2)加入检测抗体及反应：将PE标记的抗猴IgG抗体加入至上一步反应体系中，于室温、避光条件下震荡孵育30～60min，用洗涤缓冲液洗涤3次；
(3)结果检测：往反应体系中加入洗涤缓冲液，室温、避光条件下震荡60s，置于Luminex200液相芯片系统读取荧光强度。
(4)结果分析：先计算阴性对照血清的平均荧光强度值和标准差，以阴性血清的平均荧光强度值与3倍标准差的和作为临界值，高于临界值视为阳性。
11.根据权利要求10所述的多重液相芯片检测方法，其特征在于，洗涤缓冲液为PBS-TBN(PBS，0.1％BSA，0.02％Tween-20，0.05％叠氮钠)，pH7.4。
12.一种多重液相芯片检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物SIV-p27-F:5’-GAATTCCCAGTACAACAAATAGGTG-3’(SEQ ID NO：1)；
引物SIV-p27-R:5’-CTCGAGTCATTAATCTAGCCTTCTGT-3’(SEQ ID NO：2)；
引物SRV-p27-F：5’-GAATTCCCAGTAACTGAAACTGTCGA-3’(SEQ ID NO：3)；
引物SRV-p27-R：5’-CTCGAGCATGGCTAAGCCCTGTTGAT-3’(SEQ ID NO：4)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110376371A (zh) * 2019-07-18 2019-10-25 苏州西山生物技术有限公司 一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒及检测方法
CN111830120A (zh) * 2020-06-10 2020-10-27 北京东西分析仪器有限公司 应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法
CN113025753A (zh) * 2021-03-26 2021-06-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110687280A (zh) * 2019-10-14 2020-01-14 河南省商业科学研究所有限责任公司 一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠
CN114470183A (zh) * 2022-02-17 2022-05-13 青岛农业大学 一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5164293A (en) * 1990-09-25 1992-11-17 Coulter Corporation Monoclonal antibody for detecting HTLV-I, HTLV-II and STLV-I viruses
US20120288849A1 (en) * 2011-03-15 2012-11-15 The Board of Trustees of the Leland Stanford, Junior, University Method and system for robust and sensitive analysis of bead-based assays
CN103376313A (zh) * 2012-04-12 2013-10-30 梁春 一种基于血清外来体检测急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法
CN105624332A (zh) * 2016-02-17 2016-06-01 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量pcr检测方法
CN106290867A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片及方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7763460B2 (en) * 2005-06-24 2010-07-27 Focus Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting herpes simplex virus type 2
CN106086240B (zh) * 2016-07-08 2019-12-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于检测小反刍兽疫病毒抗原的免疫磁珠试剂盒及其用途
CN106365207A (zh) * 2016-08-12 2017-02-01 北京国际旅行卫生保健中心 丙型肝炎病毒超灵敏磁性纳米检测技术

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5164293A (en) * 1990-09-25 1992-11-17 Coulter Corporation Monoclonal antibody for detecting HTLV-I, HTLV-II and STLV-I viruses
US20120288849A1 (en) * 2011-03-15 2012-11-15 The Board of Trustees of the Leland Stanford, Junior, University Method and system for robust and sensitive analysis of bead-based assays
CN103376313A (zh) * 2012-04-12 2013-10-30 梁春 一种基于血清外来体检测急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法
CN105624332A (zh) * 2016-02-17 2016-06-01 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量pcr检测方法
CN106290867A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片及方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PERELYGINA L ET AL.,: "Production of herpes B virus recombinant glycoproteins and evaluation of their diagnostic potential", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主编: "《动物传染病学》", 31 July 2008, 北京：中国农业出版社 *
季芳等: "猴T 淋巴细胞趋向性病毒1型双抗原夹心ELISA检测试剂盒的研制", 《中国比较医学杂志》 *
杨燕飞: "MBV、SRV、SIV血清抗体调查及间接ELISA检测方法的初步建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库-农业科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110376371A (zh) * 2019-07-18 2019-10-25 苏州西山生物技术有限公司 一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒及检测方法
CN111830120A (zh) * 2020-06-10 2020-10-27 北京东西分析仪器有限公司 应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法
CN111830120B (zh) * 2020-06-10 2023-06-09 北京东西分析仪器有限公司 应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法
CN113025753A (zh) * 2021-03-26 2021-06-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法

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