CN110376371A - 一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于实验动物病毒检测领域，具体涉及一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒及检测方法，包括病毒抗原的制备，抗原磁珠偶联，xMAP实验，计算MFI比值，MFI比值的计算方法为每种病原抗原的MFI读值与其相应的对照抗原的MFI读值的比值，使用阴性样本的MFI比值的平均值加3倍标准偏差作为检测相应的界限值，检测结果高于界限值定义为阳性。本发明是一种全面的、抗原敏感性和特异性高的检测方法。

Description

一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明属于实验动物病毒检测领域，具体涉及一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒及检测方法。
背景技术
非人灵长类动物是人类的近亲，与人的遗传相似性极高，具有许多与人类类似的生物学和行为学特征，在组织结构、生殖生理学、解剖学上与人类高度相似。近年来，随着生命科学的快速发展，对非人灵长类动物的需求一直在持续增加，扩大非人灵长类动物种群数量，获得高质量、标准化的非人灵长类实验动物已成为我国科学研究进一步发展的迫切需求。对SPF(specific pathogen free)级猕猴，一般是指未感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、猴B病毒(cercopithecine herpesvirus type I，BV)、猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)、猴T细胞趋向性病毒I型(simian Tlymphotropic virus type I，STLV-1)、猴D型逆转录病毒(simian retrovirus，SRV)的猕猴需求增大。但是根据检测经验及文献报道，麻疹病毒(Measles virus，MV)和猴水痘病毒(Simian varicella virus，SVV)在我国实验猴中也屡有爆发。《猴麻疹病毒抗体免疫检测方法的建立及应用》中提出麻疹是由麻疹病毒(measles virus，MV)引起的急性呼吸道传染病，能够感染人和灵长类动物。该病主要通过呼吸道传播，患猴在咳嗽、打喷嚏时，MV会随飞沫排出，到达易感猴的呼吸道或眼结膜，从而引发感染。该病毒传染性强，易感猴直接接触后90％以上可发病，是猴场必须严格控制的疾病之一。实验猴一旦感染MV，该病毒蔓延速度很快，并且很难控制。MV是一种稳定的单型病毒，难以彻底清除，从而干扰试验研究。因此，对MV血清抗体的常规监测意义重大。《猴水痘带状孢疹病毒病的诊治》中提到，猴水痘(simian varicella,SV)是一种传染病,猴感染后以发烧和皮疹为特征，并可能进一步发展成肺炎和肝炎，饲养管理不当以及气候突变都可以导致本病的发生和流行，且为隐性感染。另外，美国Charles River Laboratories(CRL)曾提出了获得全球众多实验动物使用者认可的无病毒抗体(virus antibody free，VAF)的概念，该标准满足实验动物繁育的要求也符合科研使用的实际需要。目前实验猴病毒的检测方法中，常用的是使用重组蛋白作为抗原，但是根据大量实验数据验证，发现SRV的P27和p24的重组蛋白容易出现非特异性反应，SIV的p26重组蛋白在阴性样本中也常有非特异性条带，综合大量文献报道，证明常用的重组蛋白在猴病毒检测中的应用效果不佳。
CN108490173A公开了针对猴B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴T细胞趋向性病毒I型和猴D型逆转录病毒的多重液相芯片检测方法及应用，提供了一种以HSV-1病毒培养物及BV-gD、SIV-p27、SRV-p27和HTLV-1envelope重组蛋白分别作为BV、SIV、SRV和STLV的抗原进行不同编号磁珠的包被，以包被了不同重组蛋白抗原的磁珠为载体，在BV、SIV、SRV和STLV抗体单一液相芯片检测方法的基础上，建立同时检测猴BV、SIV、SRV和STLV病毒抗体的多重液相芯片检测方法，实施列二中使用50μL已处理的待检测样品，消耗了大量样本。
CN208795748U公开了一种新型板式多项病毒抗体斑点免疫检测试剂盒，其检测病毒抗原为实验猴易感的B病毒、猴T细胞趋向性病毒Ⅰ型、猴逆转录D型病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40、猴水痘病毒、猴泡沫病毒、实验小鼠SPF级必检病毒、实验大鼠SPF必检病毒以及重组蛋白抗原的至少一种抗原，将其预点在抗原板的硝酸纤维素膜上，将待检样本在深孔板中进行稀释，然后用多孔道移液枪成排加入到抗原板对应的反应孔中，样本中相关的病毒抗体和硝酸纤维膜上相应的抗原发生特异性结合，孵育后洗涤加入酶标二抗，形成抗原-抗体-酶复合物，洗涤除去非结合物，最后加入显色剂显色，一定时间后终止反应，通过所述一系列的反应使得相应的抗原点呈现肉眼可见的斑点，达到定性检测病毒的目的。但是由于DIA实验的本身性质，导致的实验结果判读依赖人工，不易自动化。
目前，实验猴的病原体筛查以DIA、ELISA为主，复检常用WB和IFA。ELISA、IFA、WB在检测多个项目时，都会消耗大量血清样本，且耗时较长；IFA和WB操作繁琐，不能用于大量样本的初筛；DIA结果判读一般依赖于人工判读，不易自动化。
本发明中将对实验猴影响最大的6种常检病毒的病原体抗原及其对照照抗原均经化学偶联至多色微球上，通过液相芯片与血清样本反应后，在MAGPIX仪上读取微球和对应包被抗原的荧光信号强度值，在一个反应中同时检测猴血清样本的6个病毒项，是一种检测全面、特异性高，敏感性好的高通量、低消耗、低成本的检测方法，提高了检测效率。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的实验猴病毒检测过程中使用的抗原检测效果不佳或实验结果依赖主观因素的问题，本发明提供了一种检测全面、抗原敏感性高、特异性好，高通量、低消耗、低成本、效率高的多色微球液相芯片试剂盒，该试剂盒包含抗原偶联磁珠和检测试剂。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测猴六种病毒多色微球液相芯片试剂盒的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测猴六种病毒的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所述病毒抗原偶联磁珠为HVP2-MC10014、SRV-1/2/3/4/5/8-MC10022、SIVmac251-MC10028、HTLV-1-MC10046、MV-MC10053和SVV-MC10056以及对照抗原偶联磁珠Vero细胞参照抗原-MC10066、Raji细胞参照抗原-MC10076和BSA-MC10086抗原偶联磁珠。
其中，所述抗原分别为HVP2病毒抗原、SRV-1/2/3/4/5/8混合病毒抗原、SIVmac251全病毒抗原、HTLV-1全病毒抗原、MV全病毒抗原、SVV全病毒抗原。
优选的，所述六种抗原均在DIA和ELISA实验中验证效果良好。
其中，对照抗原分别为Vero细胞参照抗原、Raji细胞参照抗原或BSA。
需要说明的是，本发明所用病毒均为我国《人间传染的病原微生物名录》《动物病原微生物分类名录》生物危险分类第三类的病原体，且不在《人畜共患传染病名录》所列举的范围内；其次，HTLV-1和SIV抗原为购买的商业抗原，经过Triton X-100裂解；其他自制病毒抗原，在制备后均已经过常用的β-丙内酯灭活或Triton X-100裂解处理，可确保对环境和人员无害。
进一步的，本发明将HVP2、MV和SVV毒种转染Vero细胞，收集培养物提取病原体后灭活，得到相应抗原。
优选的，Vero细胞贴壁培养，在细胞汇合度达到90％时经胰蛋白酶消化传代，逐级放大至10级细胞工厂，且汇合度≥80％时接种病毒HVP2、MV或SVV，接种比例为1:100，当CPE比例≥80％时使用胰蛋白酶消化后收获培养物，提取病原体，灭活得到抗原。
优选的，Vero细胞的培养条件为10％FBS/MEM，在37℃和5％CO2的培养箱中。
优选的，Vero细胞培养物中病原体的提取方法为：
(1)培养物经反复冻融后离心去除细胞碎片，上清中加入终浓度8％PEG8000和0.5M NaCl，混匀后4℃过夜；
(2)4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀用1/100培养体积的PBS重悬；
(3)使用20％～60％蔗糖，4℃，100000g梯度离心18h；
(4)将蓝灰色病毒区带用PBS稀释5倍；
(5)经50kD超滤管4℃，3000g离心3次后置换PBS。
进一步的，本发明将SRV1/2/3/4/5/8转染Raji细胞，收集培养物提取病原体后灭活，得到相应抗原。
优选的，将Raji细胞悬浮培养，当细胞浓度达到3×105细胞/mL时1:6逐级放大至10级细胞工厂，且浓度达到1×105细胞/ml时，接种病毒SRV，接种比例为1:10，当CPE比例≥80％时收获培养上清，提取病原体，灭活得到抗原。
优选的，Raji细胞的培养方法为10％FBS/RPMI-1640，37℃和5％CO2悬浮培养。
优选的，Raji细胞培养物中病原体的提取方法为：
(1)4℃，4000g离心20min去除细胞碎片；
(2)将上清20000g离心3h，弃去上清，沉淀用1/50培养体积的PBS重悬。
优选的，本发明所述病原体的灭活方法为，加入1/4000体积的β-丙内酯混匀后在4℃放置24h。
优选的，Vero和Raji对照抗原的制备方法与相应的病毒抗原相同；而SIV和STLV抗原用BSA作为对照抗原。
进一步的，本发明使用的HTLV-1和SIV病毒抗原为直接购买得到，均购自Zeptometrix公司，货号分别为0801033和0810011。
本发明所用磁珠为Luminex公司的MC10014、MC10022、MC10028、MC10046、MC10053、MC10056、MC10066、MC10076和MC10086。在室温平衡后进行活化，用偶联缓冲液进行预洗后重悬磁珠，加入抗原混匀，室温避光旋转混合2h，磁性分离磁珠后加入封闭液，室温避光旋转混合30min，封闭液重复洗涤2min，使用封闭液重悬，计数并避光低温保存。
优选的，空白磁珠的活化步骤如下：
(1)取如本发明所述1-9种磁珠平衡至室温；
(2)将平衡后的磁珠使用一定体积的活化缓冲液重悬，涡旋20s，水浴超声20s，磁性分离磁珠2min；
(3)加入等体积的去离子水，涡旋20s，水浴超声20s，磁性分离2min；
(4)加入1/10体积的S-NHS，涡旋20s，加入1/10体积的EDC，涡旋20s；
(5)避光孵育20min，每10min取下涡旋一次；
(6)2.5体积的偶联缓冲液重悬，涡旋20s，水浴超声20s，磁性分离；
(7)加入等体积的偶联缓冲液，涡旋20s，水浴超声20s，得到活化的磁珠。
优选的，偶联磁珠的步骤如下：加入适量体积的抗原，使所用抗原偶联浓度为300μg/mL，并用偶联缓冲液补加至5倍体积，涡旋均匀，室温避光旋转孵育2h。
优选的，偶联磁珠的封闭步骤如下：
(1)加入五倍体积封闭液，涡旋混匀，水浴超声20s，室温避光旋转孵育30min，磁性分离；
(2)加入10倍体积封闭液重悬，涡旋20s，磁性分离2min，重复一次；
(3)加入10倍体积封闭液重悬，2-8℃避光保存备用。
优选的，血清的检测步骤如下：
(1)将偶联磁珠涡旋20s，水浴超声20s，用反应缓冲液配制成400磁珠/μL的工作液；
(2)向反应体系中加入50μL/well的偶联磁珠工作液；
(3)加入50μL/well血清稀释液，反应体系中具有每种偶联磁珠各2000个；
(4)封上封板膜，800rmp室温孵育1h；
(5)磁性分离微球2min，加入100μL/well的洗液，震荡2min，磁性分离2min，重复洗涤3次；
(6)加入100μL/well的1μg/mL的PE标记的羊抗人二抗，800rpm室温孵育30min；
(7)反应缓冲液洗涤3次后，加入100μL/well反应缓冲液，震荡重悬。
(8)计算MFI比值，每种病原体抗原的MFI比值为每种病原抗原的MFI读值与其相应的细胞对照抗原的MFI读值的比值。
进一步的，对6项病毒的xMAP单项分别进行血清样本稀释比例的滴定，选择在6项病毒中通用的血清稀释比例，具体稀释比例为1:200。
进一步的，分析六重检测与单重检测特异性与敏感性的一致性。
进一步的，对于6种病原体的检测，分别选择经ELISA和Western Blot确认的阴性样本30个，用本发明所述方法检测其MFI比值，将每种病原体阴性样本MFI比值的平均值加3倍标准偏差作为各项检测相应的界限值，检测结果高于界限值则判定为阳性。
本发明所述方法可在一个反应中同时检测猴血清样本中的6个病毒项，是一种检测全面、特异性高，敏感性好的高通量、低消耗、低成本的检测方法，提高了检测效率。
附图说明
图1 HVP2的单重xMAP检测血清梯度滴定
图2 SRV的单重xMAP检测血清梯度滴定
图3 SIV的单重xMAP检测血清梯度滴定
图4 STLV的单重xMAP检测血清梯度滴定
图5 SVV的单重xMAP检测血清梯度滴定
图6 MV的单重xMAP检测血清梯度滴定
图7 HVP2的单重与六重xMAP分析敏感性比较
图8 SRV的单重与六重xMAP分析敏感性比较
图9 SIV的单重与六重xMAP分析敏感性比较
图10 STLV的单重与六重xMAP分析敏感性比较
图11 SVV的单重与六重xMAP分析敏感性比较
图12 MV的单重与六重xMAP分析敏感性比较
图13 HVP2的六重xMAP与ELISA分析敏感性比较
图14 SRV的六重xMAP与ELISA分析敏感性比较
图15 SIV的六重xMAP与ELISA分析敏感性比较
图16 STLV的六重xMAP与ELISA分析敏感性比较
图17 SVV的六重xMAP与ELISA分析敏感性比较
图18 MV的六重xMAP与ELISA分析敏感性比较
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得；若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议条件。
实施例1
1.Vero细胞用10％FBS/MEM培养基在37℃和5％CO2培养箱中贴壁培养；当汇合度达到90％左右时经胰蛋白酶消化传代，逐级放大至10层细胞工厂，汇合度达80％时分别接种HVP2、MV和SVV病毒，毒种稀释比例为1:100；当CPE比例达到80％以上时胰酶消化收获培养物；HVP2、MV和SVV毒种由美国VRL实验室提供；培养物经冻融3次后，4℃，10000g离心20min去除细胞碎片，上清加入终浓度8％PEG8000和0.5M NaCl，混匀后4℃过夜，4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀用1/100培养体积的PBS重悬后，经20％～60％蔗糖梯度离心，4℃，100000g离心18h；小心移取蓝灰色病毒区带，用缓冲液PBS稀释约5倍后经50kD超滤管4℃，3000g离心3次后置换PBS；加入1/4000体积的β-丙内酯混匀后在4℃放置24h灭活。
2.Raji细胞用10％FBS/RPMI-1640培养液在37℃和5％CO2中悬浮培养；当浓度达到3×105细胞/mL时1:6传代逐级放大至10层细胞工厂，浓度达到1×105cells/mL分别接种SRV-1/2/3/4/5/8，毒种稀释比例为1:10；当CPE比例达到80％以上时收获培养上清。4℃4000g离心20min去除细胞碎片，将离心上清再经20000g离心3h，弃去上清，沉淀用1/50培养体积的PBS重悬；加入1/4000体积的β-丙内酯混匀后在4℃放置24h灭活。
3.Vero和Raji参照抗原的制备方法与相应的病毒抗原相同。
实施例2
依照Luminex公司xMAP Cookbook说明配置活化缓冲液(0.1M NaH2PO4,pH 6.2)、偶联缓冲液(PBS)和封闭液(PBS，1％BSA，0.05％叠氮钠)。将本发明所述磁珠平衡至室温，加入活化缓冲液磁珠涡旋20s，水浴超声20s分散后，吸取100μL磁珠至EP管中在磁性分离2min，弃上清；加100μL去离子水，涡旋20s，水浴超声20s，磁性分离2min，吸掉上清；加入80μL体积的活化缓冲液，涡旋20s，水浴超声20s；加入10μL S-NHS，涡旋20s，加入10μL EDC，涡旋20s，避光旋转混合室温孵育20min，每10min取下涡旋一次；磁性分离磁珠后加入250μL偶联缓冲液,涡旋20s混匀，水浴超声20s，磁性分离磁珠后重复再用偶联缓冲液洗一次；加100μL偶联缓冲液重悬磁珠，涡旋20s，水浴超声20s，加入适量体积的抗原，使抗原偶联浓度为300μg/mL，用偶联缓冲液补加体积至500μL，涡旋混匀，室温避光旋转混合2h，简单离心10s，磁性分离磁珠；加入500μL封闭液重悬磁珠，涡旋混匀，水浴超声20s，室温避光旋转混合30min，离心10s，磁性分离磁珠后加入1mL的封闭液重悬，涡旋20s，磁性分离2min，用1mL封闭液重复洗1次磁珠，加入1000μL的封闭液重悬；用血球计数板对磁珠进行计数，于2-8℃避光保存备用。
实施例3
使用实施例2所述偶联磁珠建立的一种猴六种病毒多色微球液相芯片抗体检测方法。
将偶联磁珠涡旋20s，水浴超声20s，用反应缓冲液(1％BSA/PBS)配制400beads/μL的工作液，在微孔板中加入每种磁珠工作液50μL/well，共计2000beads/well；加入用封闭液稀释200倍的血清稀释液50μL/well，封上铝箔微孔板封板膜，在微孔板摇床上800rpm室温孵育1h；磁力分离微球2min，吸尽上清，加入洗液(0.05％Tween-20/PBS)100μL/well，震荡2min，分离2min，重复洗涤共3次；用反应缓冲液将PE标记的羊抗人二抗稀释500倍至浓度为1μg/mL，加100μL/well至微孔板，800rpm室温孵育30min；反应缓冲液洗涤3次后，加入反应缓冲液100μL/well，摇床上震荡5min使磁珠完全重悬；使用 MAGPIXTMMultiplex Reader读取MFI值，每种病原体抗原的MFI读值与其相应的细胞对照抗原MFI读值的比值作为该检测项目的最终结果；对于6种病原体的检测，分别选择经ELISA和WesternBlot确认阴性样本30个，用六重xMAP检测，其MFI比值的平均值加3倍标准偏差作为各项检测相应的界限值，其中，各项病原磁珠的cutoff值分别为：HVP2为10.5，STLV-1为11.3，SIV为12.7，SRV为6.5，SVV为45.6，MV为10.7。检测结果高于界限值则判定为阳性，否则判定为阴性。
血清样品稀释比例实验
使用1％BSA/PBS缓冲液稀释血清样本，从1:50开始进行2倍比稀释至1:204800。采用本发明所述步骤建立HVP2、SRV、SIV、STLV、SVV和MV的单重液相芯片检测方法检测，根据图1-6图确定在检测时血清样本的稀释比例最佳为1:200。
特异性实验
采用本发明建立的方法与本公司已经商品化的猴六种病毒的ELISA试剂盒进行比较，分别测试六种病毒的猴血清阳性对照，比较分析特异性；检测来源不同的恒河猴或食蟹猴血清样本188份，对于采用本发明所述方法和ELISA结果不一致的样本使用Western Blot复检，比较本发明所述方法和ELISA方法的检测特异性。
其中，ELISA实验步骤如下，纯化的病毒抗原稀释于CBS缓冲液，100μL/孔包被微孔板，4℃过夜后吸尽液体，用5％的脱脂奶粉/PBS溶液以350μL/孔在室温封闭30min。猴血清样本用0.05％Tween-20/PBS缓冲液1:50稀释，100μL/孔加入到微孔板中，37℃孵育45分钟；用350μL/孔PBS洗涤3次，拍干；加入100μL/孔，1:3000比例稀释的HRP标记山羊抗人IgG(H+L)，37℃孵育45min，重复洗涤3次；加入ABTS显色液，室温孵育30min；在酶标仪上读OD405和OD490，将△OD＝OD405-OD490的值作为ELISA最终结果，△OD≥0.3判定为阳性。
本发明建立的方法与本公司的猴六种病毒的ELISA试剂盒特异性相当或略高，具体结果如表1-6所示：
表1 HVP2的六重xMAP与ELISA检测敏感性和特异性比较
表2 SRV的六重xMAP与ELISA检测敏感性和特异性比较
表3 SIV的六重xMAP与ELISA检测敏感性和特异性比较
表4 STLV的六重xMAP与ELISA检测敏感性和特异性比较
表5 SVV的六重xMAP与ELISA检测敏感性和特异性比较
表6 MV的六重xMAP与ELISA检测敏感性和特异性比较
敏感性实验
1.使用1％BSA/PBS缓冲液稀释血清样本，从1:50开始进行2倍比稀释至1:204800。采用本发明所述步骤建立HVP2、SRV、SIV、STLV、SVV和MV的单重液相芯片检测以及六重液相芯片检测。根据图7-12的检测结果显示，对于HVP2单重检测最低效价为1:6400，六重检测最低效价与单重检测最低效价基本一致；对于SRV单重检测最低效价为1:1600，六重检测最低效价与单重检测最低效价基本一致；对于SIV单重检测最低效价为1:3200，六重检测最低效价与单重检测最低效价基本一致；对于STLV-1单重检测最低效价为1:25600，六重检测最低效价与单重检测最低效价基本一致；对于SVV单重检测效价最低为1:6400，六重检测最低效价与单重检测最低效价基本一致；对于MV单重检测效价最低为1:6400，多重最低检测效价为1:3200。
2.用本发明建立的液相芯片技术与猴六种病毒Elisa试剂盒对188份来源不同的恒河猴或食蟹猴血清样本进行测试，根据图13-18所示：HVP2、SRV、SIV、STLV、SVV、MV的六重检测本发明所述方法比ELISA方法分析敏感性分别高6、3、6、8、7和5个梯度，经Westernblot复检确认后xMAP六重检测的检测敏感性和特异性均与ELISA相同或略高。
由于以上技术方案的应用，本发明与现有技术相比，具有以下优点：可在一个反应中同时检测猴血清样本的6个病毒项，是一种检测全面、特异性高，敏感性好的高通量、低消耗、低成本的检测方法，提高了检测效率。
本发明的技术方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同时检测猴六种病毒抗体的多色微球液相芯片试剂盒，其特征在于，包含六种病毒抗原偶联磁珠和三种对照抗原偶联磁珠，分别为HVP2-MC10014、SRV-1/2/3/4/5/8-MC10022、SIVmac251-MC10028、HTLV-1-MC10046、MV-MC10053、SVV-MC10056、Vero细胞对照抗原-MC10066、Raji细胞对照抗原-MC10076和BSA-MC10086抗原偶联磁珠，
其中，所述病毒抗原分别为HVP2病毒抗原、SRV-1/2/3/4/5/8混合病毒抗原、SIVmac251全病毒抗原、HTLV-1全病毒抗原、MV全病毒抗原、SVV全病毒抗原。
2.一种同时检测猴六种病毒抗体的多色微球液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于，其中抗原偶联磁珠的制备步骤如下：
C1.病毒抗原制备，将病毒转染细胞进行培养后，分离细胞培养物中的病毒，灭活；
C2.进行抗原磁珠偶联，将所述抗原分别与不同类型的磁珠偶联，获得偶联磁珠。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，C1中HVP2病毒、MV病毒和SVV病毒使用Vero细胞培养，SRV-1/2/3/4/5/8病毒使用Raji细胞培养。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，C2中抗原磁珠的偶联方法为：将磁珠平衡后活化，使用偶联缓冲液重悬，与抗原混合孵育，封闭后获得偶联磁珠。
5.根据权利要求4所述方法，抗原偶联浓度为300μg/mL。
6.一种同时检测猴六种病毒抗体的检测方法，其特征在于，采用权利要求1～5任一所述的液相芯片试剂盒进行检测。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，检测步骤具体如下：
S1.向抗原偶联磁珠中加入血清；
S2.加入PE标记的羊抗人二抗；
S3.加入反应缓冲液重悬抗原偶联磁珠，使用液相芯片系统读取MFI，计算MFI比值，分析结果。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，S1反应体系中具有每种抗原偶联磁珠各2000个，所使用的血清样本为1:200的稀释样本。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，S2中二抗浓度为1μg/mL，每个反应体系加入100μL。
10.根据权利求7所述方法，其特征在于，S3所述MFI比值计算方法为为每种病原抗原的MFI读值与其相应的对照抗原的MFI读值的比值，其中以阴性样本的MFI比值的平均值加3倍标准偏差作为界限值，检测结果高于界限值判定为阳性。
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