CN104745604B - 猪细小病毒液相芯片检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪细小病毒液相芯片检测试剂盒，它是以重组蛋白VP2₃₁₂‑NS1₂₁₇‑VP2₃₁₂做为抗原标准品，工作浓度为2.5μg/mL，对猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪凝血性脊髓灰质炎病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性乙型脑炎病毒无交叉反应，对猪细小病病毒最低检出限为0.1TCID₅₀。

Description

猪细小病毒液相芯片检测试剂盒

技术领域

本发明提供属疫病检验检疫领域，具体涉及一种猪细小病毒液相芯片检测试剂盒。

背景技术

猪细小病毒病是猪的主要繁殖障碍性疾病之一，由猪细小病毒(porcineparvovirus，PPV)感染所引起。该病的主要特征是受感染的母猪，尤其是初产母猪、血清学阴性经产母猪发生流产、不晕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎以及弱仔等。公猪在PPV的传播中也起着重要作用，已有很多报道从自然感染的公猪精液中分离出PPV，精液也可能在体外受到污染，例如被含有病毒的粪便污染。Lucas(1974)等将病毒通过包皮注射给公猪，5d后在该受试公猪的睾丸中分离到了病毒。Thacher等(1985)应用HI对公猪的PPV血清抗体检测表明，随着公猪年龄的增加，其血清学阳性率显著增加。该病广泛分布、全世界流行，在很多感染猪场呈地方性流行，造成了长期、重大的经济损失，严重阻碍了世界养猪业的健康发展。

猪细小病毒感染可依据临床症状和流行病学做出初步诊断。一般认为,如果仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、胎儿发育异常, 同时有证据表明是传染性疾病时, 则应考虑到PPV感染的可能, 但进一步确诊必须进行实验室诊断。因此，开发一种特异性强、灵敏度高、简单易行、适合批量操作的新型检测方法将具有重要的现实意义。

液相芯片，也称微球体悬浮芯片（Suspension Array，liquid chip），是基于xMAP（flexible Multi-Analyte Profiling）技术的新型生物芯片技术平台。该技术是20世纪90年代中期发展起来的，被喻为后基因组时代的芯片技术，是集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的新型生物分子高通量检测技术，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光从而达到定性和定量检测之目的。该技术的优势在于检测通量大、速度快、灵敏度高、操作灵活、样本用量少、检测范围广、特异性强、准确性高、重复性好、费用低。

鉴于猪细小病毒的危害和现存检测该病毒方法尚存的一些弊端，本发明利用免疫学技术和液相芯片技术相结合，研制用于检测猪细小病毒的液相芯片检测试剂盒。简言之，采用单抗制备技术制备了猪细小病毒单克隆抗体，并与羧基化21号微球偶联，获得捕获单抗-微球；采用多抗制备技术制备了兔源猪细小病毒多克隆抗体，经生物素化获得了检测多抗；采用重组DNA技术制备了猪细小病毒结构蛋白截短体VP2₃₁₂与非结构蛋白截短体NS1₂₁₇的混合三联重组蛋白，即VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂，作为检测标准品。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪细小病毒液相芯片检测试剂盒。

一种重组蛋白基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

一种重组蛋白，它是如序列表SEQ ID NO.7所示的基因表达的蛋白。

一种质粒pET28a-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇- VP2₃₁₂，它是用下述的方法制得：

1）提取猪细小病毒总RNA，反转录成cDNA，以此为模板；

2）用引物：

上游：5' GGATCCATGAGTGAAAATGTGGAACAA 3'

下游：5' GAATTCTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT 3'

扩增基因VP2₃₁₂；

3）用引物：

上游：5' GAATTCATGGCAGCGGGAAACA 3'

下游：5' AAGCTTCTGTTGCCTGGTCCCAT 3'

扩增基因NS1₂₁₇；

4）上游：5' AAGCTTATGAGTGAAAATGTGGAAC 3'

下游：5' CTCGAGTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT 3'

扩增基因VP2₃₁₂；

5）步骤2）、3）、4）PCR产物，依次用BamHI和EcoRI、EcoRI和HindIII、HindIII和XhoI酶切，连接到同一pET28a载体上。

一种重组蛋白在制备猪细小病毒检测试剂盒中的应用。

本发明提供了猪细小病毒液相芯片检测试剂盒，它是以重组蛋白VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂做为抗原标准品，工作浓度为2.5μg/mL，对猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪凝血性脊髓灰质炎病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性乙型脑炎病毒无交叉反应，对猪细小病病毒最低检出限为0.1TCID₅₀。

附图表说明

附图1融合细胞染色体鉴定结果；

附图2 细胞融合；

附图3 猪细小病毒单克隆抗体亚型鉴定结果；

附图4纯化多克隆抗体的检测结果；

附图5单抗偶联微球的最佳工作浓度；

附图6试剂盒灵敏度检测结果；

附图7试剂盒特异性检测结果；

附图8试剂盒稳定性检测结果。

具体实施方式

实施例1猪细小病毒单克隆抗体的制备

（1）PPV的培养与免疫原的制备

PK-15细胞常规复苏培养，待细胞长至培养瓶底部的80%时采用吸附接毒法按10%量接种病毒，37℃吸附lh，倾去剩余病毒液，加入维持液，于37℃、5%CO₂培养箱内继续培养，在倒置显微镜下逐日观察细胞病变（CPE），出现约80%的拉网，空泡、聚缩等细胞病变后即可收获病毒。收毒时将细胞培养瓶快速置-70℃和37℃反复冻融三次，于4℃，5000r/min离心30min，收集上清液。

上清中缓慢加入PEG至上清的体积的10%，4℃搅拌过夜。然后4℃10000r/min，离心40min，沉淀以少量的TE缓冲液溶解。用TE缓冲液配成30%、40%、50%，60%四种浓度的蔗糖溶液，加入离心管中，制备蔗糖不连续梯度，将经PGE浓缩沉淀溶解在TE缓冲液的病毒液加入离心管的最上层，大约3mL/管，4℃，1000r/min离心4小时，分段收集样品，当30%-40%蔗糖浓度时出现的明显白色带即为目的病毒，

取纯化病毒经超声波粉碎仪裂解，稀释20倍后，用U2010紫外分光光度计于260nm与280nm下测定吸光度，计算其蛋白浓度，用PBS稀释至150µg/ml与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合制成乳剂，置4℃放置3d，若呈乳白色不分层，即可作为免疫原。

（2）小鼠免疫及血清效价检测

选择4-6周龄雌性Balb/c小鼠5只，用上述制备的弗氏完全佐剂疫苗进行首免，二免、三免均采用弗氏不完全佐剂制备的免疫原进行免疫注射，最后一次免疫于融合前3天进行加强，具体免疫程序见表1。

每次免疫前剪尾采血，分离血清并用间接ELISA方法检测小鼠的免疫抗体水平。经摸索，在间接ELISA方法中，PPV抗原包被浓度为8.8μg/mL、标准阳性血清稀释度为1:3200、封闭液为2%BSA、HRP标记的羊抗鼠Ig二抗稀释度为1:15000，具体操作步骤按已公开的常规间接ELISA法操作，每种试剂的体积为100μL/孔。第三次免疫后，小鼠血清抗体效价＞1:12800时用于细胞融合实验。

（3）细胞融合

按照已公开的常规SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠腹腔饲养细胞制备技术获得处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞和10⁶/mL的饲养细胞。

分别取小鼠血清抗体效价＞1:12800的脾细胞1.0×10⁷个和2.0×10⁶个骨髓瘤细胞的悬浮液，合并加入到一只50mL玻璃离心瓶中，轻轻混匀。1500r/min离心10min，弃上清液。用手指弹击离心瓶底部，使离心沉淀的细胞均匀松散，每隔10min一次，连续3次后，吸取1mL经37℃预温的45% PEG缓缓滴入离心管中，1min内滴完。轻摇离心管30s，使细胞充分与PEG作用，然后静置90-120s。静置完毕后，在第1min内加入1mL HAT培养液，在第2min内加入2mL HAT培养液，在第3min内加入3mL HAT培养液，再加入10mL HAT培养液，终止PEG的作用。终止反应后的融合细胞以1500r/min离心10min，弃上清。补加HAT培养液至40 mL，按100µL/孔的量加入到预先制备好的含10⁵个饲养细胞的96孔培养板中，置37℃，5% CO₂恒温培养箱中培养，5天内勿动，第5天换液并在倒置显微镜下观察细胞形态。

采用秋水仙素法测定融合细胞染色体数目约为105条，小鼠脾细胞染色体数目约为40条，SP2/0染色体数目为62-65条，见附图1，说明细胞融合成功。

（4）阳性融合细胞的筛选与扩增

融合后细胞生长良好，见附图2。细胞融合后8天起取细胞上清用前述间接ELISA法检测效价，每次亚克隆的阳性结果见表2。选取OD₄₅₀值最高的四个孔进行亚克隆。最终选择1孔进行扩大培养，命名为1-A₃H₄D₁₁G₁。

（5）高效价单克隆抗体的制备

采用常规体内诱生腹水法制备高效价单克隆抗体。用PEG浓缩纯化后的病毒稀释至最佳包被浓度包被96孔酶标板进行间接ELISA检测，测定腹水的抗体效价，以平行稀释的单抗OD₄₅₀值/对照OD₄₅₀值比值大于2的最高稀释倍数为单抗的效价。杂交瘤细胞系1-A₃H₄D₁₁G₁腹水效价为1:1024000，见附表3。

（6）单克隆抗体亚类鉴定

采用Sigma公司的单抗类型鉴定试剂盒，按照说明书操作对单抗亚类进行鉴定。结果表明，杂交瘤细胞系1-A₃H₄D₁₁G₁所分泌的单抗属于IgG₁亚类，见附图3。

（7）单克隆抗体特异性检测

常规间接ELISA方法检测结果发现所制备的单抗与猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒病、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪脑心肌炎病毒、猪血凝性脊髓炎病毒等未见交叉反应。表明该单抗为针对PPV病毒的特异性单抗，见表4。

实施例2 猪细小病毒生物素化多克隆抗体的制备

（1）PPV的培养与免疫原的制备

具体操作过程以及纯化病毒的浓度同实施例1（1）所述。

（2）新西兰大白兔免疫及血清效价检测

选择健康新西兰大白兔，雌性，体重（2±0.2）kg，用上述制备的弗氏完全佐剂疫苗进行首免，二免、三免均使用弗氏不完全佐剂制备的疫苗进行免疫注射，最后一次免疫于心脏采血前3天进行，具体免疫程序见表5。

每次免疫前耳缘静脉采血，分离血清并用间接ELISA方法检测小鼠的免疫抗体水平。经摸索，在间接ELISA方法中，PPV抗原包被浓度为17μg/mL、标准阳性血清稀释度为1:1600、封闭液为2%BSA、HRP标记的羊抗鼠Ig二抗稀释度为1:20000，具体操作步骤按已公开的常规间接ELISA法操作，每种试剂的体积为100μL/孔。第四次免疫后，兔血清抗体效价为1:25600，此时进行抗体的纯化。

（3）多克隆抗体的纯化

采用已公开的常规正辛酸—硫酸铵沉淀法粗提取，再采用蛋白纯化仪联合亲和纯化柱protein G蛋白纯化柱，按说明操作进一步纯化。纯化后的抗体经常规12% SDS-PAGE电泳检测，结果显示纯化后的抗体于46KD-58KD、17KD-25KD之间有两条较清晰的条带，分别为重链、轻链特异性条带，见附图4。

（4）生物素标记多克隆抗体

①生物素标记反应

取200μL多克隆抗体溶液（浓度50.58mg/mL），加入1mL PBS，混匀后加入浓度为4.4mg/mL的生物素溶液136μL，室温反应1h。

② 标记水平测试

试剂准备：100mM PBS、HABA/Avidin solution（1.94mL PBS中加入10mgAvidin 和100ul 10mM HABA）。

在96孔板微孔里加入180μL HABA/Avidin，测定A₅₀₀，记录为A_{500HABA/Avidin}；加入20μL生物素标记蛋白，混匀，读数平衡15秒后测定A₅₀₀，记录为 A_{500HABA/Avidin/biotin}。

③计算

生物素标记蛋白物质的量浓度=生物素标记蛋白混合液的浓度/蛋白分子量；

吸光度变化值△A₅₀₀=A_{500HABA/Avidin}- A_{500HABA/Avidin/biotin}

生物素标记样品中中生物素浓度Mm/ml=△A₅₀₀/34000/0.5；

生物素物质的量/蛋白物质的量=样品中生物素摩尔数/蛋白摩尔数=△A₅₀₀/34000/0.5/生物素标记蛋白物质的量浓度。

测试结果表明，A_{500HABA/Avidin}=0.5868，A_{500HABA/Avidin/Biotin-sample}=0.4313。根据上述计算公式可知生物素平均标记水平为每个多抗分子可标记3.5个生物素分子。

实施例3 液相芯片检测方法的建立

（1）单抗与微球的偶联及最佳工作浓度的确定；

①取微球室温平衡30min，然后用漩涡震荡器震荡微球悬液20s，使微球混合均匀；取微球原液50μL（1.25×10³个），转移到1.5ml离心管中，14000×g离心2min，沉淀羧基微球，弃去上清。

②加入80μL活化缓冲液（100mmol/L、pH6.2的磷酸二氢钠盐）清洗微球2次，用漩涡震荡器振荡20s，14000×g离心2min，沉淀羧基微球；弃去上清，再用80μL活化缓冲液重悬微球，漩涡震荡20s，超声清洗10min，直到看见均匀分布的微球。

③ 加入10μL、50mg/mL NHS（用活化缓冲液稀释），用漩涡震荡器轻轻地振荡混匀；加入10μL、50mg/mL EDC（用活化缓冲液稀释），用漩涡震荡器轻轻振荡；室温避光孵育20min，每隔10min用漩涡震荡器轻振，连续3-5次后，14000×g离心2min，沉淀活化的羧基微球。

④移走上清，加入500μL偶联缓冲液清洗微球两次，漩涡震荡器振荡20s，14000×g离心2min；弃去上清，重悬微球于100μL偶联缓冲液中，用震荡器震荡20s，使微球混合均匀。

⑤用偶联缓冲液将单克隆抗体稀释成浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL和250μg/mL的溶液；在上述活化好的微球中加入500μL单抗稀释液，漩涡震荡20s混匀；室温避光反应2h，每隔30min用漩涡震荡器轻振，连续3-5次后，14000×g离心2min，弃去上清；加入500μL洗液清洗微球2次，漩涡震荡20s，14000×g离心2min，弃去上清；使微球重新悬浮于125μL封闭终止液中，漩涡震荡混匀，即得到病毒捕获单抗与微球的偶联体。

⑥分别向含不同浓度单抗与微球偶联的离心管中加入50μLbiotin–羊抗鼠IgG（1:15000），取1μL（约1000个）偶联好的不同浓度的微球加入离心管中，漩涡震荡20s，37℃避光反应30min；加入100μL洗液洗涤，漩涡震荡20s，14000×g离心2min，弃去上清；加入20μL的SA-PE，漩涡震荡20s，37℃避光反应30min；加入100μL 洗液洗涤，漩涡震荡20s，14000×g离心2min，弃上清，再加入100μL洗液，漩涡震荡混匀，用Luminex-100检测。

结果表明，平均荧光值（MFI）随着单抗浓度的增加而增大，当单抗浓度为100μg/mL达到最大，MFI值逐渐趋于平衡，见附图5，说明当单抗浓度达到100μg/mL时，微球表面可结合位置达到饱和。

（2）生物素化多克隆抗体最佳工作浓度、SA-PE最佳工作浓度，及各组分反应最佳条件的确定；

根据反应体系的各影响因素，设计正交试验，确定最佳反应条件。

总体操作过程：取1μL（约1000个）偶联好的微球置于离心管中，加入病毒抗原液50μL（约280μg），漩涡震荡20s，37℃避光反应不同时间；加入100μLPBS洗涤，漩涡震荡20s，14000×g离心2min，弃去上清；将生物素标记的多克隆抗体用PBS缓冲液配成不同浓度的溶液，分别取50μL至于离心管中，漩涡震荡20s，37℃避光反应不同时间；重复上步洗涤，加入不同浓度的SA-PE 20μL，漩涡震荡20s，37℃避光反应不同时间；重复上步洗涤，弃上清，再加入100μL PBS，漩涡震荡混匀，用Luminex–100检测。

最终确定的反应体系及条件为：生物素标记多抗最佳工作浓度为0.76μg/μL，SA-PE的最佳工作浓度为0.5μg/mL，微球与抗原反应时间为30 min，生物素标记的多抗与SA-PE反应时间为30min。

实施例4 检测标准品的制备

（1）重组抗原蛋白作为检测标准品的设计

结合pET28a表达载体上的酶切位点，以及猪细小病毒结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1的基因序列，设计5种重组蛋白的排列方式：即NS1，VP2，NS1₂₁₇-VP2₃₁₂，NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇，VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂。由于NS1和VP2的全基因大小分别为1983bp、1740bp，不适合将二者进行重组融合表达。因此，采用DNAStar软件分析 NS1和VP2全蛋白抗原指数，选择抗原指数较高的氨基酸序列对应的碱基序列作为目标基因，即NS1选择1-217bp、VP2选择1-312bp。

（2）猪细小病毒NS1、VP2、NS1₂₁₇、VP2₃₁₂基因的克隆

根据GenBank登录的猪蓝耳病病毒M、N蛋白基因序列（D00623.1），自行设计引物，由上海生工合成。

鉴于pET28a表达载体中上述四个酶切位点由5’端到3’端的顺序依次为：BamH I、EcoR I、Hind III、Xho I。因此，根据重组蛋白的排列方式设计以下引物序列：

Trizol法提取猪细小病毒总RNA，反转录成cDNA，以此为模板，常规PCR技术分别扩增上述目的基因，并与pMD18T克隆载体链接，构建相应的重组克隆表达载体，转化E.coliJM109后进行筛选鉴定。

（2）pET28a-NS1、pET28a-VP2、pET28a-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂、pET28a- NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇、pET28a-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂表达载体的构建及表达产物纯化

pET28a-NS1、pET28a-VP2表达载体的构建：将上述构建的克隆载体pMD18T-NS1、pMD18T-VP2、大肠杆菌表达载体pET28a分别用相应的限制性内切酶酶切后，试剂盒回收目的基因NS1、VP2和pET28a载体大片段，采用T4DNA连接酶进行连接，分别获得了重组表达载体pET28a-NS1、pET28a-VP2。

pET28a-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂表达载体的构建：参照引物设计表中NS1₂₁₇-VP2₃₁₂组合型的引物上下游酶切位点，将上述构建的克隆载体pMD18T-NS1₂₁₇与大肠杆菌表达载体pET28a分别用相应的限制性内切酶酶切后，试剂盒回收目的基因NS1₂₁₇和pET28a载体大片段，采用T4DNA连接酶进行连接，获得了重组表达载体pET28a-NS1₂₁₇；再将pET28a-NS1₂₁₇与pMD18T-VP2₃₁₂分别用相应的限制性内切酶酶切后，试剂盒回收目的基因VP2₃₁₂与pET28a-NS1₂₁₇载体大片段，采用T4DNA连接酶进行连接，获得了重组表达载体pET28a-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂。

pET28a-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇和pET28a-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂表达载体的构建：参照引物设计表中NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇和VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂组合型的引物上下游酶切位点，操作过程同pET28a-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂表达载体构建相似，经酶切、连接等步骤，最终获得pET28a-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇和pET28a-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇- VP2₃₁₂表达载体。

将上述构建的5种表达载体分别转化E.coliBL21，经氨苄青霉素筛选阳性菌株后，采用常规SDS-PAGE和Western-blot进行检测，结果表明，成功获得了重组猪细小病毒重组蛋白NS1，VP2，NS1₂₁₇-VP2₃₁₂，NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇，VP2₃₁₂- NS1₂₁₇-VP2₃₁₂。其碱基序依次为序列表SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7。

由于pET28a载体上含有6X His标签，因此采用常规亲和纯化技术对重组蛋白NS1，VP2，NS1₂₁₇-VP2₃₁₂，NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇，VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂进行纯化。纯化后的重组蛋白即可作为试剂盒中检测猪细小病毒的标准品。

实施例5 标准品的组成及工作浓度的确定

将纯化的重组NS1蛋白、重组VP2蛋白、重组NS1₂₁₇-VP2₃₁₂蛋白、重组NS1₂₁₇-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇蛋白、重组VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂蛋白用PBS稀释不同浓度梯度的工作液（0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3.0μg/mL、3.5μg/mL、4.0μg/mL、4.5μg/mL、5.0μg/mL），以10¹TCID₅₀病毒液做阳性对照，按照实施例3所述的反应体系和反应条件，采用Luminex–100检测。结果表明，工作浓度为2.5μg/mL的重组VP2₃₁₂-NS1₂₁₇-VP2₃₁₂蛋白与0.1TCID₅₀病毒液的MFI值无显著差异，而相同浓度的其他重组蛋白未见明显的MFI。说明2.5μg/mL的重组VP2₃₁₂- NS1₂₁₇-VP2₃₁₂蛋白可作为该试剂盒的标准品，用于实际检测的阳性对照。

实施例6试剂盒性能检测

（1）灵敏度检测

将纯病毒溶液用PBS缓冲液配成浓度为10⁸TCID₅₀、10⁷ TCID₅₀、10⁶ TCID₅₀、10⁵TCID₅₀、10⁴ TCID₅₀、10³ TCID₅₀、10² TCID₅₀、10¹TCID₅₀、0.1TCID₅₀、0.01TCID₅₀分别取50μL置于离心管中；按照实施例3所述的反应体系和反应条件，经Luminex–100检测。将MFI_测定值/MFI_阴性对照＞3定位阳性，2＜MFI_测定值/ MFI_阴性对照≤3定位可疑阳性， MFI_测定值/ MFI_阴性对照≤2定位阴性，可得该方法对猪细小病病毒最低检出限为0.1TCID₅₀，见附图6。

（2）特异性检测

用建立的液相芯片检测方法对已知的猪细小病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪凝血性脊髓灰质炎病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性乙型脑炎病毒等进行特异性交叉试验，同时设阳性、空白对照。检测结果表明，猪细小病毒结果为阳性，而其他病毒检测结果皆为阴性，见附图7，说明本方法对猪蓝耳病病毒有较好的特异性，与其它病毒无交叉反应。

（3）重复性检测

用所建立的液相芯片检测方法，对10⁴ TCID₅₀、10³TCID₅₀、10² TCID₅₀ 3个浓度的猪细小毒溶液进行检测，每个样品设3个重复，分别于试验的1d、7d、15d进行重复检测，检测结果上下浮动无显著差异，见附图8，说明本方法重复性较好。

<110> 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局

<120> 猪细小病毒液相芯片检测试剂盒

<160> 1

<210> 1

<211> 1980

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

NS1基因序列：

atggcagcgg gaaacactta ctcggaagag gtactaaaag ctaccaactg gcttcaagat 60

aatgctcaaa aagaagcatt ctcttatgta tttaaaacac aaaaagtcaa tctaaatgga 120

aaagaaattg cttggaataa ctacaacaaa gatacaacag atgcggaaat gataaaccta 180

caaagaggag cagaaacatc atgggaccag gcaacagaca tggaatggga atcagaaatc 240

gacagcctca caaaaggcca agtactgatt tttgactctc ttgttaaaaa atgtctcttt 300

gaaggtatat tgcaaaagaa cctaagtcca agtgactgct actggttcat acagcatgaa 360

catggtcaag atactggcta tcactgccat gtactactag gtggaaaagg cttacaacaa 420

gcaatgggaa aatggttcag aaaacaatta aacaatttat ggagtagatg gttaataatg 480

caatgcaaag tacctctaac accagttgaa agaataaaat taagggaatt agcagaggat 540

ggtgagtggg tatcgctact aacctacact cacaaacaaa ctaaaaaaca atatacaaaa 600

atgactcatt ttggaaatat gattgcttac tacttcctaa ataaaaaaag aaagacaact 660

gaaagagagc atggatatta tctcagctca gattctggct tcatgacaaa tttcttaaaa 720

gaaggcgaga gacacttagt cagtcaccta tttactgaag caaataaacc tgaaactgtg 780

gaaacaacgg ttactacagc tcaggaagcc aaaagaggca aaatacaaac aaaaaaagaa 840

gtaagcataa aatgcacaat aagagacttg gttaataaaa gatgtactag catagaagac 900

tggatgatga cagatccaga cagttatata gaaatgatgg ctcaaaccgg aggagaaaat 960

ttaatcaaaa atacactaga aataacaact cttactctag caagaacaaa aacagcatat 1020

gacttaatac ttgaaaaggc aaaaccaagc atgctaccaa catttaatat tagcaataca 1080

agaacatgta aaatattcag catgcacaat tggaactaca ttaaatgctg ccatgctata 1140

acttgtgtac taaacagaca aggaggaaaa agaaatacaa ttctatttca tgggccagca 1200

tcaacaggaa aaagtataat tgctcaacac attgcaaact tagttggtaa tgttggttgc 1260

tacaatgcag ccaatgtgaa ctttccattt aatgactgta caaataaaaa cttaatatgg 1320

attgaagaag caggaaactt ctctaaccaa gtaaaccaat tcaaagccat atgttcaggt 1380

caaacaatta gaattgacca aaaaggtaaa ggaagcaaac aaattgaacc aactcctgta 1440

ataatgacta caaatgaaga cataactaaa gttagaatag gatgcgagga aagaccagaa 1500

catacacaac caataagaga cagaatgtta aacataaacc taaccagaaa actgccaggt 1560

gattttggac ttttagaaga aactgaatgg ccactaatat gtgcttggtt ggtaaagaaa 1620

ggttaccaag caacaatggc tagctatatg catcattggg gaaatgtacc tgattggtca 1680

gaaaaatggg aggagccaaa aatgcaaacc ccaataaata caccaacaga ctctcagatt 1740

tccacatcag tgaaaacttc gccagcggac aacaactacg cagcaactcc aatacaggag 1800

gacctggatt tagctttagc cttggagccg tggagcgagc caacaacacc aactttcaca 1860

actgcattaa ctcaacacgc cagattcagc aatacggaca caagtccaac ttggtcggaa 1920

atagaaaccg acataagagc ctgctttggt gaaaactgtg cacccacaac aaaccttgaa 1980

<210> 2

<211> 1737

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

VP2基因序列：

atgagtgaaa atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca 60

ggaaatgaat ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt 120

gtgtctacag gtagtttcaa taatcaaaca gaatttcaat acttggggga gggcttggtt 180

agaatcactg cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac 240

aaaagaatac atgtactaaa ttcagaatca gggtcggcgg gacaaatggt acaagacgat 300

gcacacacac aaatggtaac accttggtca ctaatagatg ctaacgcatg gggagtgtgg 360

ttcaatccag cggactggca gttaatatcc aacaacatga cagaaataaa cttagttagt 420

tttgaacaag caatattcaa tgtagtactt aaaacaatta cagaatcagc aacctcacca 480

ccaaccaaaa tatataataa tgatctaact gcaagcttaa tggtcgcact agacaccaat 540

aacacacttc catacacacc agcagcacct agaagtgaaa cacttggttt ttatccatgg 600

ttacctacaa aaccaactca atacagatat tacctatcat gcatcagaaa cctaaatcca 660

ccaacataca ctggacaatc acaacaaata acagactcaa tacaaacagg actacacagt 720

gacattatgt tctacacaat agaaaatgca gtaccaattc atcttctaag aacaggagat 780

gaattctcca caggaatata tcactttgac acaaaaccac taaaattaac tcactcatgg 840

caaacaaaca gatctctagg actgcctcca aaactactaa ctgaacctac cacagaagga 900

gaccaacacc caggaacact accagcagct aacacaagaa aaggttatca ccaaacaatt 960

aataatagct acacagaagc aacagcaatt aggccagctc aggtaggata taatacacca 1020

tacatgaatt ttgaatactc caatggtgga ccatttctaa ctcctatagt accaacagca 1080

gacacacaat ataatgatga tgaaccaaat ggtgctataa gatttacaat ggattaccaa 1140

catggacact taaccacatc ttcacaagag ctagaaagat acacattcaa tccacaaagt 1200

aaatgtggaa gagctccaaa gcaacaattt aatcaacagg caccactaaa cctagaaaat 1260

acaaataatg gaacactttt accttcagat ccaataggag ggaaatctaa catgcatttc 1320

atgaatacac tcaatacata tggaccatta acagcactaa acaatactgc acctgtattt 1380

ccaaatggtc aaatatggga taaagaactt gatacagatc taaaacctag actacatgtt 1440

acagctccat ttgtttgtaa aaacaatcca ccaggacaac tatttgtaaa aatagcacca 1500

aacctaacag atgatttcaa tgctgactct cctcaacaac ctagaataat aacttattca 1560

aacttttggt ggaaaggaac actaacattc acagcaaaaa tgagatccag taatatgtgg 1620

aaccctattc aacaacacac aacaacagca gaaaacattg gtaaatatat tcctacaaat 1680

attggtggca taaaaatgtt tccagaatat tcacaactta taccaagaaa attatac 1737

<210> 3

<211> 217

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

NS1217基因序列：

atggcagcgg gaaacactta ctcggaagag gtactaaaag ctaccaactg gcttcaagat 60

aatgctcaaa aagaagcatt ctcttatgta tttaaaacac aaaaagtcaa tctaaatgga 120

aaagaaattg cttggaataa ctacaacaaa gatacaacag atgcggaaat gataaaccta 180

caaagaggag cagaaacatc atgggaccag gcaacag 217

<210> 4

<211> 212

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

VP2312基因序列：

atgagtgaaa atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca 60

ggaaatgaat ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt 120

gtgtctacag gtagtttcaa taatcaaaca gaatttcaat acttggggga gggcttggtt 180

agaatcactg cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac 240

aaaagaatac atgtactaaa ttcagaatca gggtcggcgg gacaaatggt acaagacgat 300

gcacacacac aa 312

<210> 5

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

NS1217-VP2312基因序列：

atggcagcgg gaaacactta ctcggaagag gtactaaaag ctaccaactg gcttcaagat 60

aatgctcaaa aagaagcatt ctcttatgta tttaaaacac aaaaagtcaa tctaaatgga 120

aaagaaattg cttggaataa ctacaacaaa gatacaacag atgcggaaat gataaaccta 180

caaagaggag cagaaacatc atgggaccag gcaacaggaa ttcgagctcg tcgacaagcc 240

tatgagtgaa aatgtggaac aacacaaccc tattaatgca ggcactgaat tgtctgcaac 300

aggaaatgaa tctgggggtg ggggcggcgg tggcgggggt aggggtgctg ggggggttgg 360

tgtgtctaca ggtagtttca ataatcaaac agaatttcaa tacttggggg agggcttggt 420

tagaatcact gcacacgcat caagactcat acatctaaat atgccagaac acgaaacata 480

caaaagaata catgtactaa attcagaatc agggtcggcg ggacaaatgg tacaagacga 540

tgcacacaca caa 553

<210> 6

<211> 758

<212> DNA

<213> 人工

<400> 6

NS1217-VP2312- NS1217基因序列：

atggcagcgg gaaacactta ctcggaagag gtactaaaag ctaccaactg gcttcaagat 60

aatgctcaaa aagaagcatt ctcttatgta tttaaaacac aaaaagtcaa tctaaatgga 120

aaagaaattg cttggaataa ctacaacaaa gatacaacag atgcggaaat gataaaccta 180

caaagaggag cagaaacatc atgggaccag gcaacaggaa ttcatgagtg aaaatgtgga 240

acaacacaac cctattaatg caggcactga attgtctgca acaggaaatg aatctggggg 300

tgggggcggc ggtggcgggg gtaggggtgc tgggggggtt ggtgtgtcta caggtagttt 360

caataatcaa acagaatttc aatacttggg ggagggcttg gttagaatca ctgcacacgc 420

atcaagactc atacatctaa atatgccaga acacgaaaca tacaaaagaa tacatgtact 480

aaattcagaa tcagggtcgg cgggacaaat ggtacaagac gatgcacaca cacaaaagct 540

tatggcagcg ggaaacactt actcggaaga ggtactaaaa gctaccaact ggcttcaaga 600

taatgctcaa aaagaagcat tctcttatgt atttaaaaca caaaaagtca atctaaatgg 660

aaaagaaatt gcttggaata actacaacaa agatacaaca gatgcggaaa tgataaacct 720

acaaagagga gcagaaacat catgggacca ggcaacag 758

<210> 7

<211> 853

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

VP2312- NS1217-VP2312

atgagtgaaa atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca 60

ggaaatgaat ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt 120

gtgtctacag gtagtttcaa taatcaaaca gaatttcaat acttggggga gggcttggtt 180

agaatcactg cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac 240

aaaagaatac atgtactaaa ttcagaatca gggtcggcgg gacaaatggt acaagacgat 300

gcacacacac aagaattcat ggcagcggga aacacttact cggaagaggt actaaaagct 360

accaactggc ttcaagataa tgctcaaaaa gaagcattct cttatgtatt taaaacacaa 420

aaagtcaatc taaatggaaa agaaattgct tggaataact acaacaaaga tacaacagat 480

gcggaaatga taaacctaca aagaggagca gaaacatcat gggaccaggc aacagaagct 540

tatgagtgaa aatgtggaac aacacaaccc tattaatgca ggcactgaat tgtctgcaac 600

aggaaatgaa tctgggggtg ggggcggcgg tggcgggggt aggggtgctg ggggggttgg 660

tgtgtctaca ggtagtttca ataatcaaac agaatttcaa tacttggggg agggcttggt 720

tagaatcact gcacacgcat caagactcat acatctaaat atgccagaac acgaaacata 780

caaaagaata catgtactaa attcagaatc agggtcggcg ggacaaatgg tacaagacga 840

tgcacacaca caa 853

Claims (5)

1.一种重组蛋白基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

2.一种重组蛋白，它是如序列表SEQ ID NO.7所示的基因表达的蛋白。

3.一种质粒pET28a-VP2₃₁₂-NS1₂₁₇- VP2₃₁₂，它是用下述的方法制得；

1）提取猪细小病毒总RNA，反转录成cDNA，以此为模板；

2）用引物：

上游：5' GGATCCATGAGTGAAAATGTGGAACAA 3'

下游：5' GAATTCTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT 3'

扩增基因VP2₃₁₂；

3）用引物：

上游：5' GAATTCATGGCAGCGGGAAACA 3'

下游：5' AAGCTTCTGTTGCCTGGTCCCAT 3'

扩增基因NS1₂₁₇；

4）用引物：

上游：5' AAGCTTATGAGTGAAAATGTGGAAC 3'

下游：5' CTCGAGTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT 3'

扩增基因VP2₃₁₂；

5）步骤2）、3）、4）PCR产物，依次用BamHI和EcoRI、EcoRI和HindIII、HindIII和XhoI酶切，连接到同一pET28a载体上。

4.猪细小病毒液相芯片检测试剂盒，它的抗原标准品为序列表SEQ ID NO.7所示的基因表达的蛋白。

5.根据权利要求4所述的猪细小病毒液相芯片检测试剂盒，其特征在于：所述的抗原标准品的工作浓度为2.5μg/mL。