CN114470183A - 一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用 - Google Patents

一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子的制备，步骤如下：S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因；S2、构建真核表达重组质粒；S3、真核表达质粒转染MDBK细胞；S5、真核表达蛋白纯；S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子制备。本发明采用上述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子的制备与应用，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV‑1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。

Description

一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其是涉及一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用。
背景技术
Ⅰ型牛疱疹病毒(BoHV-1)主要通过呼吸道、生殖道等粘膜系统感染、在体内躲过机体免疫系统，进入宿主细胞内复制增殖，进而在体内扩散，最终到达三叉神经节处定植。在机体免疫力低下时，再次反复感染，而引起发病和疾病传播。由此，开发通过呼吸道或者生殖道免疫的疫苗的同时，还需要开发通过粘膜系统进入体内引起体液和细胞免疫的疫苗，才能从根本上预防病毒。
目前，灭活疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗、亚单位疫苗均不能达到以上目的。近年来，纳米材料为药物和疫苗递送研究提供了全新的设计思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用，选定BoHV-1gB、gC和gD蛋白作为亚单位疫苗抗原，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV-1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。
为实现上述目的，本发明提供了一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，步骤如下：
S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因
按照GeneBank公布的BoHV-1gB、gC、gD基因序列，合成各个基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位点，其下游加入AgeⅠ酶切位点，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位点，其下游加入BSTBⅠ酶切位点；
S2、构建真核表达重组质粒
合成基因与pcDNA4-Myc-his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4-gB-his/pcDNA4-gC-his/pcDNA4-gD-his真核表达质粒，真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biological tool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒；
S3、真核表达质粒转染MDBK细胞
用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系；
S4、构建真核表达细胞系
转染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培养基37℃5％CO2培养48h将未转染成功的细胞杀死；
S5、真核表达蛋白纯
收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000*g离心30分钟沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化；
S6、真核表达蛋白鉴定；
S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备。
优选的，步骤S3中，转染细胞系的操作如下：
A、贴壁转染
1)细胞按照传代步骤操作，105个/mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染；
2)DNA与PEI磁珠无菌混合后用无菌ddH2O稀释5倍后备用；
3)消化后细胞弃去原培养基，无菌PBS清洗2遍；
4)将2)步磁珠加入到3)步细胞中，37℃CO2培养箱中培养20-30min；
5)加入正常的培养基继续培养，按正常传代操作进行；
B、悬浮转染
1)贴壁细胞消化后，300×g/min离心5min沉淀细胞弃掉培养基PBS清洗2遍在离心管中备用；
2)将DNA和磁珠按附表比例混合后，用无菌ddH2O稀释5倍后备用；
3)将上步混合物加入细胞中吹打悬浮细胞；
4)上步混合物放入培养箱培养20-30min；
5)加入新鲜培养基转移到培养瓶或者培养皿中继续培养传代。
优选的，步骤S5中，用镍磁珠对his标签蛋白进行纯化步骤如下：
1)磁珠洗涤：将磁珠用磁铁吸附后加入适当体积2×binding&wash buffer洗涤2次，洗去磁珠保存液；
2)待纯化样品加入等体积的lysis buffer之后颠倒混匀；
3)磁珠颠倒混匀后取适量体积磁珠加入上一步样品中，颠倒混匀3min；
4)磁铁吸附磁珠，待磁珠吸附完全样品澄清后弃掉样品保留磁珠；
5)加入5mL 2×binding&wash buffer摇晃混匀后，磁铁再次吸附磁珠，重复3次弃液体；
6)将上一步残余液体用移液器吸干后加入his elution buffer 1mL浸泡磁珠2分钟后，磁铁吸附磁珠，收集液体放入另一个新的离心管中；
7)重复步骤5)两次后，5mL水保存磁珠。
优选的，步骤S6中，真核表达蛋白鉴定中操作如下：
a、真核表达蛋白纯度鉴定：将纯化后的蛋白跑SDS-page电泳并转膜用小鼠抗his标签单抗做Western blotting鉴定表达蛋白纯度；
b、真核表达蛋白抗原性鉴定：将转染成功MDBK细胞0.25％胰酶消化后，转入24孔板培养贴壁后用4％多聚甲醛固定30min，1％BSA室温封闭2h加入兔抗BoHV-1多克隆抗体室温孵育30min，PBST清洗5次，每次5min，加入FITC标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育30min后再清洗5次，荧光显微镜观察并记录蛋白表达情况。
优选的，步骤S7中，右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备过程如下：
A、磁珠最大偶联蛋白量确定
取1mL 50纳米羧基右旋糖酐磁珠磁珠梯度加入1:1:1混合的gB、gC、gD蛋白，分别以40μg、50μg、60μg、70μg、80μg加入1mg/mL的EDC活化剂室温孵育1h，10000×g离心20分钟沉淀磁珠，取上清测定上清中蛋白浓度，确定饱和偶联最佳偶联量；
B、PEG600最佳包裹量确定
将上步偶联好蛋白的磁珠离心用PBS清洗2次，梯度加入双羧基PEG60010μL、20μL、30μL、40μL，并加入1mg/mL EDC室温反应30min，离心酸碱滴定测定上清中羧基含量。
因此，本发明采用上述一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用，纳米材料作为BoHV-1疫苗设计载体，既可以进行粘膜免疫又可以通过体内生理屏障到达全身各个组织，引起全面免疫反应的疫苗。利用纳米材料的小粒径特点，根据亚单位疫苗研究结果，选定BoHV-1gB、gC和gD蛋白作为亚单位疫苗抗原，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV-1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是MDBK细胞表达gB、gC、gD囊膜蛋白纯度鉴定图；
图2是MDBK细胞表达gB、gC、gD囊膜蛋白免疫原性鉴定图；
图3是二免后第一周和二免后第8周小鼠心、肝、脾、肺、肾组织切片进行HE染色检测小鼠有无组织病变图示；
图4是二免后第八周小鼠肝、脾、肺、肾制备组织切片并用M-CSF和MP1单抗检测小鼠各个组织表达水平相较PBS组有无升高图示；
图5是一免后连续检测免疫后小鼠体温图；
图6是二免后连续4周检测小鼠血清中生化指标(PHOS、AST、CK、UREA、ALKPU)变化图示；
图7是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中免疫小鼠血清中总IgG检测图示；
图8是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中中和抗体检测结果图示；
图9是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中肺部总IgA检测图示；
图10是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中细胞免疫CD4/CD8检测图示；
图11是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中IL2检测结果图示；
图12是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中IL4检测图示；
图13是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中IL10检测图示；
图14是右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果中IFN-γ检测图示。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例一
制备模拟牛疱疹病毒Ⅰ型病毒粒子及小鼠体内安全性测试
(1)材料
质粒：pcDNA4-Myc-His购自上海淼灵生物
BoHV-1gB、gC、gD基因
酶、抗体：his tag单克隆抗体购自美国abcam公司，兔抗BoHV-1多克隆抗体由本实验室免疫并用protein A纯化，FITC标记的羊抗兔二抗购自北京义翘神州生物科技有限公司。MP1和M-CSF多克隆抗体购自美国abcam公司，增强型DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。苏木素伊红染色试剂盒购自北京索莱宝生化有限公司。
DH5α、BL21感受态细胞购自美国Thermo Fisher公司
BSTBⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、AgeⅠ限制性内切酶购自美国Thermo Fisher公司。
(2)试剂耗材
10×PBS、TMB显色液和增强型ECL显色液购自北京索莱宝公司。PEI磁珠购自上海英芮诚生化科技有限公司、无内毒素质粒大提试剂盒购自英国biological tool公司。DMEM培养基和胎牛血清购自以色列BI公司。博来霉素(zeocine)购自美国thermo Fisher公司。细胞培养瓶及培养皿购自nest公司。青链霉素双抗、0.25％胰酶均购自美国hyclone公司。ELISA板购自美国Corning公司。硫酸购自化学试剂公司。IL2、IL4、IL10以及IFN-γ检测试剂盒购自美国R&D system公司。血浆生化检测试剂购自美国爱德士(IDEXX)公司。
(3)操作方法
a、牛疱疹病毒gB gC gD蛋白基因合成
按照GeneBank公布的BoHV-1gB gC gD基因序列，全序列送北京擎科生物做全基因合成并在gB上游加入HindⅢ、下游加入AgeⅠ酶切位点；gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位点，下游加入BSTBⅠ酶切位点。
b、构建真核表达重组质粒
合成基因与pcDNA4-Myc-his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4-gB-his/pcDNA4-gC-his/pcDNA4-gD-his真核表达质粒。真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biological tool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒。
c、真核表达质粒转染MDBK细胞
用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系，具体操作如下：
贴壁转染
1)细胞按照传代步骤操作，105个/mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染。
2)DNA(ddH2O溶解)与PEI磁珠按下表体积比无菌混合后用无菌ddH2O稀释5倍后备用(注：如混合后出现沉淀则增加磁珠用量，重新配置，沉淀会影响转染效率)
3)消化后细胞弃去原培养基，无菌PBS清洗2遍。
4)将2)步磁珠加入到3)步细胞中，37℃二氧化碳培养箱中培养20-30min。
5)加入正常的培养基继续培养，按正常传代操作进行(传代时发现离心细胞沉淀出现黄色为磁珠进入细胞，随着传代进行会自行消失)。
悬浮转染(适用于Vero、MDBK等贴壁紧密难于转染成功的细胞系)：
1)贴壁细胞消化后，300×g/min离心5min沉淀细胞弃掉培养基PBS清洗2遍在离心管中备用(悬浮细胞直接离心即可)。
2)将DNA(ddH2O溶解)和磁珠按附表比例混合后，用无菌ddH2O稀释5倍后备用，(注：如混合后出现沉淀则增加磁珠用量，沉淀会影响转染效率)。
3)将上步混合物加入细胞中吹打悬浮细胞。
4)上步混合物放入培养箱培养20-30min。
5)加入新鲜培养基转移到培养瓶或者培养皿中继续培养传代，细胞呈现黄色为正常现象。
d、真核表达细胞系构建
转染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培养基37℃5％CO2培养48h将未转染成功的细胞杀死。
e、真核表达蛋白纯
同时收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000ⅹg离心30分钟沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化。
用镍磁珠对his标签蛋白进行快速纯化防止降解具体步骤如下：
1)磁珠洗涤：将磁珠用磁铁吸附后加入适当体积2×binding&wash buffer洗涤2次，洗去磁珠保存液；
2)待纯化样品加入等体积的lysis buffer之后颠倒混匀；
3)磁珠颠倒混匀后取适量体积磁珠加入上一步样品中，颠倒混匀3分钟；
4)磁铁吸附磁珠，待磁珠吸附完全样品澄清后弃掉样品保留磁珠；
5)加入5mL 2×binding&wash buffer摇晃混匀后，后磁铁再次吸附磁珠，重复3次弃液体。
6)将上一步残余液体用移液器吸干后加入his elution buffer 1mL浸泡磁珠2分钟后，磁铁吸附磁珠。收集液体放入另一个新的1.5或者2mL离心管中。
7)重复步骤5两次后，5mL水保存磁珠。
f、真核表达蛋白鉴定
1)真核表达蛋白纯度鉴定：将纯化后的蛋白跑SDS-page电泳并转膜用小鼠抗his标签单抗做Western blotting鉴定表达蛋白纯度。
如图1，在鉴定MDBK细胞表达gB、gC、gD囊膜蛋白纯度中，1、2跑道是gB，3、4跑道是gC，5、6跑道是gD。
2)真核表达蛋白抗原性鉴定：将转染成功MDBK细胞0.25％胰酶消化后，转入24孔板培养贴壁后用4％多聚甲醛固定30分钟，1％BSA室温封闭2h加入兔抗BoHV-1多克隆抗体(蛋白A纯化1:500倍稀释)室温孵育30min，PBST清洗5次，每次5分钟，加入FITC标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育30min后再清洗5次，荧光显微镜观察并记录蛋白表达情况。
如图2，以兔抗BoHV-1多克隆抗体为一抗，以羊抗兔FITC抗体为二抗检测MDBK细胞表达gB、gC、gD蛋白抗原性示意图中，A、B、C、D分别代表gB、gC、gD、阴性。以上结果证明构建的pcDNA-gB-his、pcDNA-gC-his、pcDNA-gD-his真核表达质粒成功在MDBK细胞中表达，且分泌到细胞外，其抗原性与天然BoHV-1相同，纯化后蛋白纯度较高。
g、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备
1)确定磁珠最大偶联蛋白量
50纳米羧基右旋糖酐磁珠购自上海英芮诚生化有限公司，取1mL磁珠梯度加入1:1:1混合的gB、gC、gD蛋白，分别以40μg、50μg、60μg、70μg、80μg加入1mg/mL的EDC活化剂室温孵育1h，10000×g离心20分钟沉淀磁珠，取上清测定上清中蛋白浓度，确定饱和偶联最佳偶联量。最终确定最佳偶联量为50μg/mL磁珠。
2)确定PEG600最佳包裹量：
将上步偶联好蛋白的磁珠离心用PBS清洗2次，梯度加入双羧基PEG60010μL、20μL、30μL、40μL，加入1mg/mL EDC室温反应30min，离心酸碱滴定测定上清中羧基含量，最终确定PEG600最佳偶联量为30μL/mL。
由于磁性材料很难找到合适电镜进行拍摄，固本发明采用动态激光粒度仪(DLS)测定所制备的模拟BoHV-1病毒粒子粒径，其大小为94纳米。
h、组织学和血液学检测方法
1)实验动物
昆明小鼠、氯化锂抗凝采血管、爱德士(IDEXX)小鼠血液生化检测卡(干化学法)CK、ALKPU、AST、UREA、PHOS(美国，爱德士)。石蜡、M-CSF兔多抗、MP1兔多抗均购自abcam公司。免疫组化显色试剂盒，购自北京中杉金桥。苏木素一红染色液购自北京索莱宝公司。
2)组织切片制备
取第1周和第8周小鼠心、肝、脾、肺、肾器官4％多聚甲醛固定后，按照标准组织切片制备方法，制备组织切片，并进行HE染色和免疫组化染色。具体操作步骤如下：
a)组织块体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm；
b)4％多聚甲醛固定72小时；
c)脱水：80％、90％、95％、100％乙醇各2小时；
d)组织在石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ三个溶液中各浸泡2小时；
e)将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称蜡块；
f)修整蜡块：可视其组织的大小，在组织边缘约0.1-0.2cm处，切去余蜡部分。
g)切片：调整切片机切6um后切片在48℃温水中粘贴到载玻片上，65℃烘干备用。
(2)HE染色
①脱蜡：将切片放入二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)中，各置5-10分钟，溶去切片上的石蜡。
②将脱蜡的切片经各级浓度乙醇(由高到低)下行至水：将从二甲苯(Ⅱ)中取出的切片依次经过：二甲苯与无水乙醇混合液(1:1)→无水乙醇(Ⅰ)→无水乙醇(Ⅱ)→95％乙醇→85％乙醇→70％乙醇各3-5分钟，最后在蒸馏水中浸5分钟，即可进行染色。
③切片由蒸馏水中转入苏木精染液染色5-10分钟，使细胞内的嗜碱性物质着色。
④用自来水洗去切片上残余的染液。
⑤0.5-1％盐酸溶液分色数十秒钟。
⑥放入自来水中15-20分钟、蓝化。
⑦置入70％、85％乙醇中各3-5分钟。
⑧置入伊红染液中染色1-2分钟，使细胞中嗜酸性物质着色。
⑨依次进入95％乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)→100％乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)，各5分钟，以除去切片上水份。
⑩透明：切片入无水乙醇与二甲苯混合液(1:1)→二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)(Ⅲ)，各5分钟。中性树胶封片长期保存。
(3)免疫组化染色
根据上步HE染色结果，二免后第8周小鼠各个组织脏器均可恢复正常，故采用二免后第8周小鼠肝、脾、肺、肾作为IHC染色对象，如果第8周不出现M-CSF和MP1抗原显著增加，则证明右旋糖酐模拟BoHV-1对小鼠是安全的。
将上步②中组织片用0.25％胰酶室温消化30min中做抗原修复，然后Triton X-100室温透膜20min，1％BSA室温封闭1小时加入MP1和M-CSF多克隆抗体，室温孵育1小时，清洗后加入HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育1小时，清洗后加入增强型DAB显色液显色，切片转入苏木精染液染色1分钟，使细胞内的嗜碱性物质着色。依次进入95％乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)→100％乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)，各5分钟，以除去切片上水份。透明：切片入无水乙醇与二甲苯混合液(1:1)→二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)(Ⅲ)，各1分钟。中性树胶封片长期保存。显微镜下观察并拍照。
如图4，M-CSF对破骨细胞祖细胞的存活和增殖是必需的，M-CSF可以促进和增强巨噬细胞对肿瘤细胞和微生物的杀伤，调节巨噬细胞释放细胞因子和其他炎症调节因子，并刺激细胞吞噬作用。怀孕期间M-CSF增加，以支持蜕膜、胎盘的植入和生长。M-CSF的来源包括成纤维细胞，活化的巨噬细胞，子宫内膜分泌上皮，骨髓基质细胞和活化的内皮细胞。
M-CSF检测结果表明未加PEG保护组小鼠肺脏有明显表达，但加入PEG保护表达不明显。
基质金属蛋白酶(matrix metalloprotinase，MMP1)是一类依赖金属锌离子的蛋白水解酶，对细胞外基质(ECM)的降解、组织重建以及细胞内多种可溶性因子的调控起重要作用，是一类与肿瘤发生、侵袭和转移密切相关的蛋白水解酶，与许多恶性肿瘤的发生密切相关。MMP还参与许多生理过程如胚胎发育、血管生成及伤口愈合等。在正常生理状态下，MMP与组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)共同调控ECM的更新，维持细胞的稳定性。MMP失调可加速基质屏障的降解，或间接通过释放与基质相关的生长因子来促进肿瘤的生长、侵袭和转移，因此，MMP已成为肿瘤研究和开发抗肿瘤药物的有吸引力的靶点。
大多数MMP酶都作为非活性蛋白被分泌，可以被细胞外的其他蛋白酶裂解后激活。MMP1可降解细胞外基质中的胶原纤维和明胶及改变细胞的微环境，从而有利于肿瘤的侵袭和转移，作用与肿瘤发生的初始阶段利于肿瘤的形成。
MP1检测结果表明二免后皮下注射组合商品疫苗组在肺部和肾脏有较高的MP1表达，而其它组织均正常。
(4)体温监测
雌性昆明小鼠360只随机分成4组，右旋糖酐磁珠+蛋白+PEG组、右旋糖酐+蛋白组、右旋糖酐磁珠组和PBS组，每组90只。
将制备的模拟BoHV-1滴鼻免疫小鼠，每天每组随机抽取3只测量体温并记录。每周安乐死小鼠3只，收集肝素锂抗凝血500μL，400×g离心10分钟收取血浆，用爱德士(IDEXX)血液生化检测试剂盒检测血液中与毒理相关生化指标(AST、CK、ALKPU、PHOS、UREA)，解剖小鼠观察其心、肝、脾、肺、肾、肠、胃、子宫、脑组织有无损伤并拍照记录。
通过20天不间断体温检测发现，滴鼻免疫后的小鼠体温并未发生明显差异，证明小鼠体内并未发生严重炎症反应，右旋糖酐磁珠对小鼠相对安全。
(5)血液生化指标检测
取上步小鼠，每周安乐死小鼠3只，收集肝素锂抗凝血500μL，400×g离心10分钟收取血浆，用爱德士(IDEXX)血液生化检测试剂盒检测血液中与毒理相关生化指标(AST、CK、ALKPU、PHOS、UREA)，解剖小鼠观察其心、肝、脾、肺、肾、肠、胃、子宫、脑组织有无损伤并拍照记录。
以上生化指标AST(谷草转氨酶)与ALT(谷丙转氨酶)是与肝脏损伤相关的因子。ALKPU(碱性磷酸酶)是与肝脏、肾脏以及肌肉损伤的因子；UREA(尿酸)和PHOS(无机磷)为提示肾功能障碍的因子。生化检测结果显示，除CK(肌酐激酶)以外其它4个生化指标均是一过性升高然后在第4周达到基本正常水平。其中CK为与神经损伤有关的生化因子，其水平在4周一直处于较高水平未见明显下降，这与活体成像结果相吻合，活体成像结果表明荧光微球模拟BoHV-1可以在大脑中存在超过72小时，证明其对大脑造成损伤的机会较大。而本研究证明右旋糖酐磁珠模拟的BoHV-1也对神经造成损伤。
本发明使用牛源细胞系MDBK成功表达BoHV-1囊膜蛋白gB、gC、gD、gE，并且使用化学偶联方法将gB、gC、gD、gE囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠上形成粒径与天然BoHV-1接近的纳米亚单位颗粒。其中，染色证明模拟BoHV-1滴鼻免疫组二免后第一周会在肺部造成肺泡壁增厚，但第8周基本恢复正常。皮下注射组则无任何病理表现。集落刺激因子(M-CSF)和MP1检测表明，模拟BoHV-1滴鼻免疫组肺部和肾脏会有表达升高现象；加入PEG600作为保护层后，无表达升高现象。血液生化因子监测表明，模拟BoHV-1滴鼻免疫会造成，CK持续升高4周以上，其它生化因子均为一过性升高，4周恢复正常。
实施例二
检测右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1体内免疫效果
(1)材料方法
动物分组及免疫：SPF昆明小鼠(8周龄，体重20克)购自北京斯贝福生物有限公司，随机分组如下表
表1免疫分组
Figure BDA0003508984800000141
(2)免程序及评价方法
小鼠免疫两次间隔四周，二免后每周随机抽取3只小鼠摘眼球采血200μL，另外取3只小鼠断尾采血100μL，采血后酒精棉消毒。抗凝血用2倍体积的红细胞裂解液裂解2次400×g离心5分钟沉淀淋巴细胞，再用PBS重悬，清洗2遍，最后每只小鼠。非抗凝血，在37℃孵育1小时4℃孵育2小时3000×g离心20分钟收集上清-80℃保存备用。
a、CD4、CD8淋巴细胞检测：每只小鼠淋巴细胞加入1μL FITC标记的CD4单克隆抗体和2μL PE标记的CD8单克隆抗体，室温孵育30分钟后300×g离心5分钟沉淀细胞，PBS重悬后再离心2次，将未结合的抗体清洗干净，最后用100μL无菌PBS重悬细胞，用于流式细胞仪检测。
CD4代表体液免疫状态，CD8代表细胞免疫状态；CD4相对较多，是处于体液免疫阶段。本研究结果表明无论是滴鼻免疫组(Dex+Pro+PEG n)还是皮下注射组(Dex+Pro+PEG)CD4/CD8值均高于商品灭活疫苗组(Inactivation c)。由此证明模拟BoHV-1要比完整病毒能更好的引起体液免疫反应。
b、血清中BoHV-1总抗体检测
将本实验室培养且经过超速离心纯化的BoHV-1按照OD280浓度，0.05MPB以5μg/mL浓度稀释每孔加入100μL包被ELISA板，1％BSA 4℃封闭过夜，加入100μL PBS，1μL血清样品室温孵育1小鼠，PBST清洗3次，再加入100μL HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育30分钟，重复上述清洗步骤3遍，每孔加入100μL TMB显色液，37℃孵育20分钟，每孔加入50μL 0.2M硫酸终止反应，用biotek酶标仪读值。
抗体水平是机体免疫后体液免疫的重要表现，其中总抗体水平可以在一定程度上反映血清中中和抗体水平以及与体液免疫相关的其它免疫反应。二免后采血18周，包被超速离心纯化的BoHV-1病毒，其中滴鼻免疫(Dex+Pro+PEG n)组效果优于灭活商品疫苗(Inactivation c)组和皮下注射组(Dex+Pro+PEG)。整体看皮下注射免疫抗体效果远优于滴鼻免疫；其中皮下注射无PEG保护组优于有PEG保护组，分析其原因有可能是PEG保护阻碍了免疫细胞对蛋白的识别。虽然皮下注射组(Dex+Pro+PEG)个别周总抗体水平明显高于Dex+Pro组，但是其整体持续性并不如Dex+Pro(出现双峰现象，且抗体下降过快)，由此认为PEG保护后不适用与皮下注射方式。
c、血清中BoHV-1中和抗体检测
1)将待检血清56℃灭活30min；
2)稀释血清
取已灭活血清，在96孔微量细胞板上，用无血清细胞培养液稀释血清，从1:4开始作一系列倍比稀释，每孔含量50μL，每个稀释度2-4孔。
3)稀释病毒
取-70℃冰箱保存的病毒液，按测定的毒价作200TCID50稀释，(与等量血清混合后，其毒价为100TCID50)。
4)中和
每孔加入50μL已稀释好的200TCID50病毒液，置5％培养箱37℃中和1h。
5)加细胞悬液
血清与病毒中和1h后，取出细胞板，每孔加入50μL细胞悬液(24h长满单层为宜，一般每毫升100万-150万个细胞)，置5％培养箱培养，72h判定。
6)对照
阴性和阳性血清对照各设2-4孔。阴阳性对照抗体滴度应成立。
7)病毒回归试验
将200TCID50病毒液作0.1、1、10、100TCID50稀释，每个稀释度2-4孔，每孔50μL；补加50μL细胞悬液。0.1TCID50不病变，100TCID50全病变，否则该实验不成立。
8)细胞对照
设立2-4孔无病毒和血清的正常细胞对照，该对照细胞应保持良好的形态和特征。
9)结果判定和计算
当病毒回归试验、阳性、阴性、细胞对照全部成立时，才能进行判定。被检血清孔出现100％CPE判阴性，50％以上细胞出现保护者为阳性；用Karber法计算结果。
中和抗体是机体产生的可以中和病毒毒力的抗体，中和抗体是疫苗评价中的重要指标之一，对于BoHV-1感染有报道证明其中和抗体达到2的2次方即可产生免疫保护。从总IgG结果中，选取二免后第13周作为评价中和抗体对象，经对比发现滴鼻免疫组(Dex+Pro+PEG n)中和抗体水平与灭活疫苗组(Inactivation c)和皮下注射组(Dex+Pro+PEG)持平。因为第13周并不是滴鼻免疫组(Dex+Pro+PEG n)总抗体水平最高值，由此推测当滴鼻免疫组(Dex+Pro+PEG n)总抗体水平最高值时，其中和抗体水平会由于灭活商品疫苗组(Inactivation c)和皮下注射组(Dex+Pro+PEG)。
d、检测小鼠肺和气管总IgA
安乐死小鼠，放干血后间隔一周采集小鼠气管和肺放入2mL离心管中，加入2粒钢珠进行组织匀浆破碎，加入200μL无菌PBS反复吹打混匀后，10000×g离心10分钟使组织匀浆沉淀，收集上清上清中含有肺和气管总IgA。
包被BoHV-1，肺组织匀浆上清与PBS各50μL混合均匀后加入ELISA孔中，37℃孵育1小时，PBST清洗3遍，再加入HRP标记的羊抗鼠IgA二抗(1:10000)100μL，37℃孵育1小时，PBST清洗3遍后，加入TMB孵育以及硫酸终止反应，并测定其OD值。统计分析其总IgA变化。
可用于评价滴鼻免疫与皮下注射免疫与商品化灭活疫苗对粘膜免疫的激活差异，应该采用冲肺操作，以获得呼吸道粘膜sIgA并用BoHV-1包被检测特异sIgA。实际操作发现，小鼠数量较多，肺脏太小冲肺操作容易发生肺脏破裂现象，无法保证获得都是肺粘膜sIgA，肺部血清中IgA对后期检测影响较大，故本研究采用每2周采集小鼠气管和肺并将其破碎完全释放肺部所有IgA检测其总的BoHV-1特异性IgA代表sIgA。结果表明滴鼻免疫组(Dex+Pro+PEG n)IgA水平高于灭活疫苗组(Inactivation c)和皮下注射组(Dex+Pro+PEG)。由于皮下注射灭活疫苗对粘膜IgA激活作用极其微弱，那么灭活疫苗组(Inactivation c)和皮下注射组(Dex+Pro+PEG)总IgA总应该大多数为血清IgA，而非sIgA，而滴鼻免疫组(Dex+Pro+PEG n)总IgA中sIgA所占比例高于灭活疫苗组合皮下注射组。
e、小鼠血清中细胞因子检测
小鼠IL2、IL4、IL10和IFN-γ检测试剂盒购自R&D system公司。取血清50μl加入50μl样品稀释液37℃孵育1小时。Wash buffer清洗5次，加入100μl biotin标记检测抗体37℃孵育1小时，再清洗5次，之后加入50μlHRP标记的SA，37℃孵育15分钟，最后显色酶标仪读值。
①白介素2(IL2)
滴鼻免疫组(Dex+Pro+PEG n)和灭活商品疫苗组(Inactivation c)IL2水平相当，由于皮下注射组(Dex+Pro+PEG)。PEG保护后影响了蛋白与免疫细胞的识别，而Dex+Pro组中蛋白由于在体内降解速度过快导致识别不充分，导致其IL2水平较低。
②白介素4(IL4)
白细胞介素-4(白介素-4,Interleukin-4，IL-4)是II型辅助T细胞(Th2细胞)分泌的细胞因子。诱导B细胞抗体类别转换向IgE，上调第二型主要组织兼容性复合体的产生。
③白介素10(IL10)
IL-10影响单核巨噬细胞主要功能：释放免疫介质，抗原呈递。简单来说，它抑制单核巨噬细胞促进天然和特异性免疫的功能，同时增强这些细胞抑制，免疫耐受诱导和清道夫功能。
④干扰素γ(IFN-γ)：
干扰素(interferon,IFN)是最早发现的细胞因子，是病毒和干扰素诱生剂作用于宿主细胞产生的低分子多功能糖蛋白，因其具有干扰病毒的感染和复制而得名。
本发明中肺部总IgA结果证明，模拟BoHV-1小鼠滴鼻免疫小鼠使其肺及气管产生了BoHV-1特异性IgA。通过对总抗体、中和抗体检测结果证明模拟BoHV-1可以引起体液免疫反应，相较于传统商品化灭活疫苗，其体液免疫效果并不差。CD4/CD8结果证明模拟BoHV-1可以激活体内T细胞，产生免疫反应。细胞因子结果证明模拟BoHV-1充分激活了小鼠细胞免疫系统。
因此，本发明采用上述一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用，选定BoHV-1gB、gC和gD蛋白作为亚单位疫苗抗原，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV-1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤如下：
S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因
按照GeneBank公布的BoHV-1gB、gC、gD基因序列，合成各个基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位点，其下游加入AgeⅠ酶切位点，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位点，其下游加入BSTBⅠ酶切位点；
S2、构建真核表达重组质粒
合成基因与pcDNA4-Myc-his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4-gB-his/pcDNA4-gC-his/pcDNA4-gD-his真核表达质粒，真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biological tool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒；
S3、真核表达质粒转染MDBK细胞
用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系；
S4、构建真核表达细胞系
转染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培养基37℃5％CO2培养48h将未转染成功的细胞杀死；
S5、真核表达蛋白纯
收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000×g离心30分钟沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化；
S6、真核表达蛋白鉴定；
S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备。
2.根据权利要求1所述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤S3中，转染细胞系的操作如下：
A、贴壁转染
1)细胞按照传代步骤操作，105个/mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染；
2)DNA与PEI磁珠无菌混合后用无菌ddH2O稀释5倍后备用；
3)消化后细胞弃去原培养基，无菌PBS清洗2遍；
4)将2)步磁珠加入到3)步细胞中，37℃CO2培养箱中培养20-30min；
5)加入正常的培养基继续培养，按正常传代操作进行；
B、悬浮转染
1)贴壁细胞消化后，300×g/min离心5min沉淀细胞弃掉培养基PBS清洗2遍在离心管中备用；
2)将DNA和磁珠按附表比例混合后，用无菌ddH2O稀释5倍后备用；
3)将上步混合物加入细胞中吹打悬浮细胞；
4)上步混合物放入培养箱培养20-30min；
5)加入新鲜培养基转移到培养瓶或者培养皿中继续培养传代。
3.根据权利要求1所述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤S5中，用镍磁珠对his标签蛋白进行纯化步骤如下：
1)磁珠洗涤：将磁珠用磁铁吸附后加入适当体积2×binding&wash buffer洗涤2次，洗去磁珠保存液；
2)待纯化样品加入等体积的lysis buffer之后颠倒混匀；
3)磁珠颠倒混匀后取适量体积磁珠加入上一步样品中，颠倒混匀3min；
4)磁铁吸附磁珠，待磁珠吸附完全样品澄清后弃掉样品保留磁珠；
5)加入5mL 2×binding&wash buffer摇晃混匀后，磁铁再次吸附磁珠，重复3次弃液体；
6)将上一步残余液体用移液器吸干后加入his elution buffer 1mL浸泡磁珠2分钟后，磁铁吸附磁珠，收集液体放入另一个新的离心管中；
7)重复步骤5)两次后，5mL水保存磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤S6中，真核表达蛋白鉴定中操作如下：
a、真核表达蛋白纯度鉴定：将纯化后的蛋白跑SDS-page电泳并转膜用小鼠抗his标签单抗做Western blotting鉴定表达蛋白纯度；
b、真核表达蛋白抗原性鉴定：将转染成功MDBK细胞0.25％胰酶消化后，转入24孔板培养贴壁后用4％多聚甲醛固定30min，1％BSA室温封闭2h加入兔抗BoHV-1多克隆抗体室温孵育30min，PBST清洗5次，每次5min，加入FITC标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育30min后再清洗5次，荧光显微镜观察并记录蛋白表达情况。
5.根据权利要求1所述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤S7中，右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备过程如下：
A、磁珠最大偶联蛋白量确定
取1mL 50纳米羧基右旋糖酐磁珠磁珠梯度加入1:1:1混合的gB、gC、gD蛋白，分别以40μg、50μg、60μg、70μg、80μg加入1mg/mL的EDC活化剂室温孵育1h，10000×g离心20分钟沉淀磁珠，取上清测定上清中蛋白浓度，确定饱和偶联最佳偶联量；
B、PEG600最佳包裹量确定
将上步偶联好蛋白的磁珠离心用PBS清洗2次，梯度加入双羧基PEG60010μL、20μL、30μL、40μL，并加入1mg/mL EDC室温反应30min，离心酸碱滴定测定上清中羧基含量。
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