CN111830120A - 应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，试剂盒包括如下组分：U9缓冲液、U1缓冲液和醋酸钠缓冲液；试剂盒的使用方法包括下述步骤：S1：金属蛋白芯片靶板进行活化；S2：对血清样本进行预处理；S3：利用金属蛋白芯片靶板提取血清样本中的蛋白；S4：利用MALDI‑TOF质谱系统进行谱图的采集、处理，并通过软件对读取的谱图进行分析。借此，本发明灵敏度高、准确性好，操作简便，耗时短，非常适合临床诊断用。

Description

应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒检测技术领域，尤其涉及一种应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)是一种严重威胁人民群众生命健康安全的病毒，如何更快、更准确的诊断该病毒，成为社会各界关注的热点。目前，检测新冠病毒的方法主要有两种：
一种是核酸检测方法，即实时荧光RT-PCR的方法，由于采样部位、采样量、运输和储存环节，以及实验室检测条件和人员操作等多种原因，使得荧光定量RT-PCR作为检测手段的新冠病毒检测的阳性率目前仅有30％-50％，导致奇高的假阴性率。目前最简单的采样方式是咽拭子，有研究表明，新冠病毒在人的上皮细胞复制非常慢，因此，在咽部，甚至痰液内，病毒的基数都非常低，加大了检测的难度，所以会造成漏检。除了采样，从样本运输到实验室检测的诸多环节中，每一个环节出错都可能造成检验结果的不准确。由于病毒的RNA很容易降解，敏感度很高，送样过程中必须采取冷链运输，维持在零下20度，一旦冻融超过四次以上，样本就会受到损伤。而且，利用试剂盒检测有很高的门槛，对实验室的条件也很苛刻。病毒基因扩增非常容易交叉污染，这对检测人员的操作规范提出了很高的要求，需要积累大量的经验。
另一种是免疫检测方法，即抗原或者抗体方法，这种方法需要病毒感染人体后，由人体的自身免疫功能产生相应的抗体后方可检测。新冠病毒基因编码多个结构蛋白，例如N蛋白、E蛋白和S蛋白，这些蛋白包括多个抗原表位，利用抗原和抗体特异性结合的原理，可通过抗体检测抗原的存在，从而直接证明样本中含有新型冠状病毒。抗体检测试剂：新型冠状病毒的抗原可以作为免疫原，在病毒感染人体后，刺激浆细胞产生特异性抗体，利用抗原与抗体特异性结合的原理，可通过抗原检测抗体的存在，从而间接证明人体已经感染新型冠状病毒。抗体检测试剂的适用样本类型一般为血液，包括血清、血浆和全血。检测的抗体主要分为IgM和IgG。通常情况下，IgM抗体产生早，一经感染，快速产生，但是维持时间短，消失快，容易发生漏诊。IgG抗体虽然持续时间长、消失慢，但是产生晚，需要人体感染病毒达到一定的时间后才会产生，不利于疾病的早期诊断。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF，Matrix Assisted LaserDesorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)，是近年发展起来的新型软电离生物质谱技术。这种技术具有高灵敏度和高质量检测范围，可检测的相对分子质量高达几十万，从而使生物大分子和聚合物分子的检测成为可能。MALDI-TOF-MS作为一种“软电离”质谱，具有样本不易碎裂、分子离子峰强的优点，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题，已被广泛应用于生物、化学、聚合物的表征和解释，显示出了强大的分析功能。
MALDI-TOF的原理是用激光照射样本与基质形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子使其解吸，并通过电离过程将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子带上电荷的过程。离子在电场作用下加速飞过高真空状态下的飞行管道，离子到达检测器的飞行时间的平方与离子的质荷比(m/z)成正比，通过飞行时间来测定离子的质量。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、样本前处理简便等特点，为生命科学等领域特别是临床检查应用提供了一种强有力的分析测试手段，已经广泛用于组织切片、细胞、微生物、蛋白、多肽、核酸等生物样本的分析。
蛋白指纹图谱技术(protein finger printing)指的是就像每个人的指纹不同于他人一样，每种疾病发生发展过程中都会产生一系列特异的蛋白质，所形成的特定蛋白质组或者其大写产物不一样，因此构成了该疾病特征性“蛋白指纹”模式，利用蛋白指纹图谱技术检测和分析人体蛋白变化，就可以特异性诊断出人体所患疾病。
MALDI-TOF结合蛋白芯片，是目前为止进行蛋白指纹图谱检测的最佳技术手段，但现有技术中，尚没有将其用来检测新冠病毒肺炎。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其可以精准检测、快速诊断、降低治疗成本，提高治愈率。
为了实现上述目的，本发明提供一种应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括如下组分：U9缓冲液、U1缓冲液和醋酸钠缓冲液。
所述试剂盒的使用方法包括下述步骤：
S1对金属蛋白芯片靶板进行活化
将所述金属蛋白芯片靶板插入蛋白芯片生物处理器中，加入缓冲液U9，然后将所述生物处理器震荡3～10min，甩掉所述缓冲液U9；再重复操作一次，得到活化金属蛋白芯片靶板；
S2对新型冠状病毒阳性和阴性血清样本进行预处理
a)取出血清样本，解冻后水浴灭活；将所述血清样本离心，使血清分层；
b)取上层血清，并加入缓冲液U9，充分混合后振荡孵育15～30min，得到中间产物一；
c)向所述中间产物一中加入缓冲液U1，充分混合后继续振荡孵育8～15min，得到中间产物二；
d)向所述中间产物二中加入醋酸钠缓冲液，得到预处理样本；
S3利用金属蛋白芯片靶板提取所述血清样本中的蛋白
a)将所述预处理样本加入所述活化金属蛋白芯片靶板中，然后置于所述生物处理器中；将所述生物处理器进行震荡，再将所述活化金属蛋白芯片靶板的所述预处理样本液体导入预设容器中；
b)向所述活化金属蛋白芯片靶板的孔中加入所述醋酸钠缓冲液，震荡后甩去所述孔中液体，然后重复操作一次；
c)取出所述活化金属蛋白芯片靶板，干燥后在所述活化金属蛋白芯片靶板的每个孔上加基质，干燥后重复加基质一次，再次干燥后待用；
S4利用Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统进行谱图的采集和处理，并对谱图进行分析。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述缓冲液U9的配制方法为：在0.01mol/L的PBS中加入尿素和CHAPS，搅拌溶解后得到缓冲液U9。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述尿素的摩尔浓度为7～10mol/L，所述CHAPS的质量浓度为8～12g/L。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述缓冲液U1的PH为7.5，所述缓冲液U1为缓冲液U9与45～60mmol/L Tris-HCl的混合液。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述S2步骤中，所述上层血清与缓冲液U9的体积比为1：2.5～3.5；所述上层血清与缓冲液U1的体积比为1：4.5～6。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述醋酸钠缓冲液的pH为4.0，所述醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为90～120mmol/L。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述金属蛋白芯片靶板上有经过阳离子、阴离子、共价金属螯合剂修饰的位点，所述位点的直径为1～2mm。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述EbioReader 3700飞行时间质谱系统为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF)。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述EbioReaderTM 3700飞行时间质谱系统采用线性正离子操作模式，离子源SP1电压为15～30KV，离子源SP2电压2～6KV，聚焦电压为3～10KV，延时提取时间为50～1000ns；检测器电压为-2kv～-5KV，激光频率为20～60Hz。
根据本发明的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，所述EbioReader3700飞行时间质谱系统，每次数据采集前均采用混合蛋白标准品进行仪器质量轴的校准；所述混合蛋白标准品为促肾上腺皮质激素片段、氧化的胰岛素B链、胰岛素、抑肽酶、肌红蛋白双电荷峰或者细胞色素c中的任意一种。
本发明的有益效果是：
1、利用该试剂盒检测新冠病毒肺炎迅速有效，检测精确；
2、利用该试剂盒检测新冠病毒肺炎只需采集血样，无需采集呼吸道标本，不仅有效保护医护人员的安全，而且避免了采集部位病毒量不足而导致的假阴性结果；
3、利用该试剂盒检测新冠病毒肺炎能够准确区分新型冠状病毒肺炎、普通肺炎以及恙虫病等疾病，从而更好的对病人进行正确的治疗，降低治疗成本，有效地提高病人的生存率以及生活质量。
附图说明
图1是本发明中新冠病毒肺炎患者与健康人群蛋白指纹图谱对比；
图2是本发明中新冠病毒肺炎患者与普通肺炎患者蛋白指纹图谱对比；
图3是本发明中新冠病毒肺炎患者与恙虫病患者蛋白指纹图谱对比。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，试剂盒包括如下组分：U9缓冲液、U1缓冲液和醋酸钠缓冲液。
使用上述试剂盒鉴定新冠病毒的方法包括下述步骤：
S1：对金属蛋白芯片靶板进行活化；
将金属蛋白芯片靶板插入蛋白芯片生物处理器中，加入缓冲液U9，然后将生物处理器放在振动摇床上震荡3～10min，甩掉缓冲液U9；再重复上述操作一次，得到活化金属蛋白芯片靶板。
生物处理器上的孔洞与金属蛋白芯片上的靶点要完全对应，以确保实验过程中加入的试剂能够充分与靶点接触。本发明中的金属蛋白芯片靶板为弱阳离子交换芯片靶板，金属蛋白芯片靶板上有经过阳离子、阴离子、共价金属螯合剂修饰的位点，所述位点的直径为1～2mm。
缓冲液U9的配制方法为：在0.01mol/L的PBS中加入尿素和CHAPS(表面活性剂)，搅拌使其充分溶解，溶解后得到缓冲液U9。尿素的摩尔浓度为7～10mol/L，CHAPS的质量浓度为8～12g/L。
S2：对新型冠状病毒阳性和阴性血清样本进行预处理，具体操作步骤如下：
a)于-80℃冰箱中取出血清样本，放入生物安全柜冰上解冻后，水浴灭活；
b)血清样本在8000～12000r/min，2～8℃的条件下离心1～5min，使血清分层；
c)用移液器吸取上层血清置于离心管中，加入缓冲液U9，充分混合后置于冰上振荡孵育15～30min，得到中间产物一；该步骤中，上层血清与缓冲液U9的体积比为1：2.5～3.5。
d)孵育完成后，向中间产物一中加入缓冲液U1，充分混合后继续放置在冰上振荡孵育8～15min，得到中间产物二；该步骤中，上层血清与缓冲液U1的体积比为1：4.5～6。
缓冲液U1的PH为7.5，缓冲液U1为缓冲液U9与45～60mmol/L Tris-HCl的混合液。
e)孵育结束后，向中间产物二中加入醋酸钠缓冲液，得到预处理样本。上层血清与醋酸钠缓冲液的体积比为1：25～35，醋酸钠缓冲液的pH为4.0，醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为100mmol/L。
血清样本进行预处理的全程于生物安全柜中操作。
S3：利用金属蛋白芯片靶板提取血清样本中的蛋白，具体操作步骤如下：
a)将预处理样本加入活化金属蛋白芯片靶板中，然后置于生物处理器中；
b)将上述生物处理器置于振荡器上，振荡器的转速为200～300r/min，温度为2～7℃，震荡时间为20～40min；
c)震荡结束后，将生物处理器中的预处理样本液体导入预设容器；预设容器中装有消毒剂；本发明中，预处理样本液体的导入方法为甩入或者移液器吸入，由于甩入方法不会破坏蛋白分子与金属靶点的相互作用，且不影响蛋白的提取效率，因此，作为一种优选的方案，预处理样本液体的导入方法为甩入。
d)活化金属蛋白芯片靶板的每个孔加入醋酸钠缓冲液，室温条件下置于振荡器进行震荡，甩去孔中液体，然后重复操作一次。醋酸钠缓冲液的加入体积与预处理样本的体积之比为1:1。振荡器的转速为200～300r/min，震荡时间为3～8min。
本发明中的醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为100mmol/L，醋酸钠缓冲液的pH为4.0。
e)拆开生物处理器，取出芯片，室温干燥后，在活化金属蛋白芯片靶板的每个孔上加MALDI-TOF质谱用基质，室温干燥后，重复加基质一次，室温干燥后，即可上机测定。本发明中的基质为芥子酸，基质的点加量为0.5～1ul。
提取血清样本中的蛋白的全程于生物安全柜中操作。
S4：利用Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统进行谱图的采集、处理，并通过软件对读取的谱图进行分析。
(1)谱图采集设备的确定：通过Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统进行图谱的采集，仪器参数设定如下：
a)样本离子化采用激光源，若为氮气激发，波长为337nm；若采用固态激光，波长为355nm，激光频率为20Hz；
b)样本图谱采集分子量范围是2000～20000Da之间；
c)采用线性正离子操作模式，离子源SP1电压为15～30KV，离子源SP2电压2～6KV，聚焦电压为3～10KV，延时提取时间为50～1000ns；检测器电压为-2kv～-5KV，激光频率为20～60Hz；
d)仪器校准：每次数据采集前采用混合蛋白标准品进行仪器质量轴的校准；其中校准的最大误差小于150ppm，校准方程可采用二次拟合(y＝ax2+bx+c)，或者三次拟合(y＝ax3+bx2+cx+d)，其中y代表质荷比m/z，x代表离子的飞行时间；混合蛋白标准品为促肾上腺皮质激素片段、氧化的胰岛素B链、胰岛素、抑肽酶、肌红蛋白双电荷峰或者细胞色素c中的任意一种。
(2)谱图采集和分析利用Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统采集谱图，并将采集到的蛋白指纹图谱进行比对分析；Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF)。
Ebio Reader 3700仪器由主机、计算机和打印机组成，主机由激光器、靶板、靶板传输机构、离子源、飞行管、检测器、信号线、数据采集卡、真空泵组等组成。
为了验证本发明的试剂盒鉴定新冠病毒的准确性，本发明设置如下若干实施例。
实施例1新冠病毒肺炎与健康人区分
试剂盒成分：
缓冲液U9的配制方法为：在0.01mol/L的PBS中加入尿素和CHAPS，搅拌溶解后得到缓冲液U9；尿素的摩尔浓度为7mol/L，CHAPS的质量浓度为8g/L。
缓冲液U1的PH为7.5，缓冲液U1为缓冲液U9与45mmol/L Tris-HCl的混合液。
醋酸钠缓冲液的pH为4.0，醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为90mmol/L。
实验步骤：
S1对金属蛋白芯片靶板进行活化
S2对新型冠状病毒阳性和阴性血清样本进行预处理
a)取出血清样本，解冻后水浴灭活；将所述血清样本离心，使血清分层；
b)取20μl上层血清，并加入30μl缓冲液U9，充分混合后振荡孵育20min，得到中间产物一；
c)向所述中间产物一中加入100μl缓冲液U1，充分混合后继续振荡孵育10min，得到中间产物二；
d)向所述中间产物二中加入600μl醋酸钠缓冲液，得到预处理样本；
S3利用金属蛋白芯片靶板提取所述血清样本中的蛋白
a)将所述预处理样本加入所述活化金属蛋白芯片靶板中，使蛋白分子与活化金属蛋白芯片结合；
b)向所述活化金属蛋白芯片靶板的孔中加入100μl醋酸钠缓冲液，震荡后甩去所述孔中液体，然后重复操作一次；
c)取出所述活化金属蛋白芯片靶板，干燥后在所述活化金属蛋白芯片靶板的每个孔上加基质，干燥后重复加基质一次，再次干燥后待用；
S4利用Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统进行谱图的采集和处理，并对谱图进行分析。
实验结果：
通过软件对所得数据进行比对，并进行统计分析，发现新冠病毒肺炎患者与健康人群的蛋白谱图有着明显的差异蛋白峰(参见图1)。其中，2866Da、5930Da、6645Da和8100Da四种蛋白峰可以用于区分新冠病毒肺炎患者与健康人群。
以上述得到的差异蛋白作为指标，对26例新冠病毒肺炎阳性和64例阴性样本进行盲测，结果显示，在90例样本中，27例鉴定为新冠肺炎阳性，其中25例为实际的阳性样本，2例为阴性样本；63例鉴定为阴性样本，其中62例为实际的阴性样本，1例为阳性样本。盲测结果见表一。
表一样本盲测结果
Figure BDA0002532555710000101
实施例2新冠病毒肺炎与普通肺炎区分
试剂盒成分：
缓冲液U9的配制方法为：在0.01mol/L的PBS中加入尿素和CHAPS，搅拌溶解后得到缓冲液U9；尿素的摩尔浓度为8mol/L，CHAPS的质量浓度为10g/L。
缓冲液U1的PH为7.5，缓冲液U1为缓冲液U9与50mmol/L Tris-HCl的混合液。
醋酸钠缓冲液的pH为4.0，醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为105mmol/L。
实验步骤：
S1对金属蛋白芯片靶板进行活化
S2对新型冠状病毒阳性和阴性血清样本进行预处理
a)取出血清样本，解冻后水浴灭活；将所述血清样本离心，使血清分层；
b)取40μl上层血清，并加入60μl缓冲液U9，充分混合后振荡孵育20min，得到中间产物一；
c)向所述中间产物一中加入150μl缓冲液U1，充分混合后继续振荡孵育10min，得到中间产物二；
d)向所述中间产物二中加入650μl醋酸钠缓冲液，得到预处理样本；
S3利用金属蛋白芯片靶板提取所述血清样本中的蛋白
a)将所述预处理样本加入所述活化金属蛋白芯片靶板中，使蛋白分子与活化金属蛋白芯片结合；
b)向所述活化金属蛋白芯片靶板的孔中加入100μl醋酸钠缓冲液，震荡后甩去所述孔中液体，然后重复操作一次；
c)取出所述活化金属蛋白芯片靶板，干燥后在所述活化金属蛋白芯片靶板的每个孔上加基质，干燥后重复加基质一次，再次干燥后待用；
S4利用Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统进行谱图的采集和处理，并对谱图进行分析。
实验结果：
通过软件对所得数据进行比对，并进行统计分析，发现新冠病毒肺炎患者与普通肺炎患者的蛋白谱图有着明显的差异蛋白峰(参见图2)。其中2866Da、4871Da、7463Da和8100Da四种蛋白峰可以用于区分新冠病毒肺炎患者与健康人群。
以上述得到的差异蛋白作为指标，对26例新冠病毒肺炎阳性和32例阴性样本进行盲测，结果显示，在58例样本中，26例鉴定为新冠肺炎阳性，其中26例均为实际的阳性样本，无阴性样本；32例鉴定为阴性样本，其中322例均为实际的阴性样本，无阳性样本。盲测结果见表二。
表二样本盲测结果
Figure BDA0002532555710000121
实施例3新冠病毒肺炎与恙虫病区分
试剂盒成分：
缓冲液U9的配制方法为：在0.01mol/L的PBS中加入尿素和CHAPS，搅拌溶解后得到缓冲液U9；尿素的摩尔浓度为10mol/L，CHAPS的质量浓度为12g/L。
缓冲液U1的PH为7.5，缓冲液U1为缓冲液U9与60mmol/L Tris-HCl的混合液。
醋酸钠缓冲液的pH为4.0，醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为120mmol/L。
实验步骤：
S1对金属蛋白芯片靶板进行活化
S2对新型冠状病毒阳性和阴性血清样本进行预处理
a)取出血清样本，解冻后水浴灭活；将所述血清样本离心，使血清分层；
b)取50μl上层血清，并加入100μl缓冲液U9，充分混合后振荡孵育20min，得到中间产物一；
c)向所述中间产物一中加入200μl缓冲液U1，充分混合后继续振荡孵育10min，得到中间产物二；
d)向所述中间产物二中加入700μl醋酸钠缓冲液，得到预处理样本；
S3利用金属蛋白芯片靶板提取所述血清样本中的蛋白
a)将所述预处理样本加入所述活化金属蛋白芯片靶板中，使蛋白分子与活化金属蛋白芯片结合；
b)向所述活化金属蛋白芯片靶板的孔中加入100μl醋酸钠缓冲液，震荡后甩去所述孔中液体，然后重复操作一次；
c)取出所述活化金属蛋白芯片靶板，干燥后在所述活化金属蛋白芯片靶板的每个孔上加基质，干燥后重复加基质一次，再次干燥后待用；
S4利用Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统进行谱图的采集和处理，并对谱图进行分析。
实验结果：
通过软件对所得数据进行比对，并进行统计分析，发现新冠病毒肺炎患者与普通肺炎患者的蛋白谱图有着明显的差异蛋白峰(参见图3)。其中4063Da、5016Da、7479Da和11690Da四种蛋白峰可以用于区分新冠病毒肺炎患者与健康人群。
以上述得到的差异蛋白作为指标，对26例新冠病毒肺炎阳性和24例阴性样本进行盲测，结果显示，在50例样本中，26例鉴定为新冠肺炎阳性，其中25例为实际的阳性样本，1例为恙虫病样本；24例鉴定为恙虫病样本，其中23例为实际的恙虫病样本，1例为新冠肺炎阳性样本。盲测结果见表三。
表三样本盲测结果
Figure BDA0002532555710000141
通过上述实施例可以看出，本发明鉴定新冠病毒肺炎的试剂盒以及该试剂盒的使用方法，可以进行新冠病毒肺炎患者的筛查鉴别，敏感度和特异性都可达到90％以上。本发明的试剂盒及其使用方法可以在医学研究、海关及疾控、医疗卫生等领域发挥作用，具有广泛的临床应用前景。
综上所述，本发明通过设置由U9缓冲液、U1缓冲液和醋酸钠缓冲液组成的试剂盒，并以该试剂盒检测新冠病毒肺炎，具有如下有益效果：
1、利用该试剂盒检测新冠病毒肺炎迅速有效，检测精确；
2、利用该试剂盒检测新冠病毒肺炎只需采集血样，无需采集呼吸道标本，不仅有效保护医护人员的安全，而且避免了采集部位病毒量不足而导致的假阴性结果；
3、利用该试剂盒检测新冠病毒肺炎能够准确区分新型冠状病毒肺炎、普通肺炎以及恙虫病等疾病，从而更好的对病人进行正确的治疗，降低治疗成本，有效地提高病人的生存率以及生活质量。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：U9缓冲液、U1缓冲液和醋酸钠缓冲液；
所述试剂盒的使用方法包括下述步骤：
S1对金属蛋白芯片靶板进行活化
将所述金属蛋白芯片靶板插入蛋白芯片生物处理器中，加入缓冲液U9，然后将所述生物处理器震荡3～10min，甩掉所述缓冲液U9；再重复操作一次，得到活化金属蛋白芯片靶板；
S2对新型冠状病毒阳性和阴性血清样本进行预处理
a)取出血清样本，解冻后水浴灭活；将所述血清样本离心，使血清分层；
b)取上层血清，并加入缓冲液U9，充分混合后振荡孵育15～30min，得到中间产物一；
c)向所述中间产物一中加入缓冲液U1，充分混合后继续振荡孵育8～15min，得到中间产物二；
d)向所述中间产物二中加入醋酸钠缓冲液，得到预处理样本；
S3利用金属蛋白芯片靶板提取所述血清样本中的蛋白
a)将所述预处理样本加入所述活化金属蛋白芯片靶板中，然后置于所述生物处理器中；将所述生物处理器进行震荡，再将所述活化金属蛋白芯片靶板的所述预处理样本液体导入预设容器中；
b)向所述活化金属蛋白芯片靶板的孔中加入所述醋酸钠缓冲液，震荡后甩去所述孔中液体，然后重复操作一次；
c)取出所述活化金属蛋白芯片靶板，干燥后在所述活化金属蛋白芯片靶板的每个孔上加基质，干燥后重复加基质一次，再次干燥后待用；
S4利用Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统进行谱图的采集和处理，并对谱图进行分析。
2.根据权利要求1所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述缓冲液U9的配制方法为：在0.01mol/L的PBS中加入尿素和CHAPS，搅拌溶解后得到缓冲液U9。
3.根据权利要求2所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述尿素的摩尔浓度为7～10mol/L，所述CHAPS的质量浓度为8～12g/L。
4.根据权利要求3所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述缓冲液U1的PH为7.5，所述缓冲液U1为缓冲液U9与45～60mmol/L Tris-HCl的混合液。
5.根据权利要求4所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述上层血清与缓冲液U9的体积比为1：2.5～3.5；所述上层血清与缓冲液U1的体积比为1：4.5～6。
6.根据权利要求1所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述醋酸钠缓冲液的pH为4.0，所述醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为90～120mmol/L。
7.根据权利要求1所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述金属蛋白芯片靶板上有经过阳离子、阴离子、共价金属螯合剂修饰的位点，所述位点的直径为1～2mm。
8.根据权利要求1所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统。
9.根据权利要求1所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统采用线性正离子操作模式，离子源SP1电压为15～30KV，离子源SP2电压2～6KV，聚焦电压为3～10KV，延时提取时间为50～1000ns；检测器电压为-2kv～-5KV，激光频率为20～60Hz。
10.根据权利要求1所述的应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统，每次数据采集前均采用混合蛋白标准品进行仪器质量轴的校准；所述混合蛋白标准品为促肾上腺皮质激素片段、氧化的胰岛素B链、胰岛素、抑肽酶、肌红蛋白双电荷峰或者细胞色素c中的任意一种。
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