CN113984872A - 末梢血中10种元素电感耦合等离子体质谱检测 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种末梢血中10种元素的ICPMS检测方法，包括以下步骤：样本采集、样本制备、样本存储、上机检测；其中，采集样本时采用触压式末梢采血器，采血量(40μL，60μL，80μL，100μL)经过对比实验验证；样本制备采用稀释法，稀释液含有硝酸，曲拉通和异丙醇；稀释后的样本存储时间(0小时，24小时，48小时，72小时)经过对比实验验证；通过电感耦合等离子体质谱法对镁，钙，锰，铁，铜，锌，砷，硒，镉和铅10种元素进行检测。该末梢血中10种元素电感耦合等离子体质谱检测方法具有采血量小，存储时间长，样品制备方法简单可靠重复性高，仪器检测限低，精度高的优点，且适合于不同品牌的ICPMS仪器，适用于全血中的微量元素批量检测。

Description

末梢血中10种元素电感耦合等离子体质谱检测

技术领域

本发明涉及无机微量元素检测领域，为一种全新的检测方法，用于人末梢血中多种元素的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测方法。

背景技术

微量元素在人体内的含量极少，通常指低于人体总重量0.01％，每人每日需要量在100mg以下的元素。医学研究表明，虽然人体或动物中元素的含量不多，但其对人体健康有着至关重要的作用。分子生物学的研究揭示，元素通过与蛋白质和其他有机基团结合，形成了酶、激素、维生素等生物大分子，发挥着重要的生理生化功能。微量元素在人体内具有二重性，当摄入不足时，可导致相应的疾病；而摄入过量时，同样会对人体产生损害。随着微量元素与疾病关系的日益明确以及人们对健康问题的密切关注，准确、快速、方便的测定人体内微量元素的含量，成为微量元素检测领域亟需解决的问题。另外，血液的微量元素分析也经常作为食品生产、环境污染、农业生产、职业健康研究的生物监测手段，在相关领域发挥监测作用。

对于有益元素，钙、镁、铁、锌、硒等，若人血清中的含量低于标准范围，提示该进行相应的补充，或提示与相应疾病如缺铁性贫血、儿童生长发育迟缓、骨质疏松、克山病的相关性。对于有害元素，铅、镉、汞、砷、铊等，若血清中含量超限则提示中毒，必须进行相应的解毒措施。对于与特异性疾病相关的一些微量元素，其含量的变化提示疾病的发展阶段及预后情况。

人体元素分析涉及的生物检材有血液、尿液、头发、骨头和指甲等，其中最常用的是血液。研究表明，机体内含铁Fe、铜Cu、锌Zn总量减少时，均可减弱免疫能力，助长细菌感染，而且感染后的死亡率亦较高等；当部分微量元素(重金属元素)超过一定浓度时，可引起急性中毒或在人体内畜积产生长久的毒害作用。尤其随现今工业的发展，金属污染涉及到了人类活动的各个领域，当各金属元素浓度超过一定生物接触限值时即可引起中毒。研究表明，人体毒物或毒物代谢物的含量测定，是临床上证实毒物中毒的最关键的客观依据，生物材料中有毒物质的增高能说明毒物在体内的过度吸收。

此外，在扫毒禁毒中，对于各类新型毒品的微量元素的检测已经成为扫毒禁毒工作中的重点，而对于司法实践工作中，以无机元素毒物投毒和自杀等案件也时有发生，例如在法医学鉴定中，需要准确、快速对中毒原因和中毒程度作出判断，但无机元素目标物的不确定性以及毒物种类的广泛性，导致元素检测存在一定的复杂性，且不同元素的急性中毒可能会出现相似的症状。另外，在体内兴奋剂的检测工作中，由于各种新型兴奋剂具有的代谢快、残留低、难检测的特点，对于超时的代谢后的兴奋剂的微量成分的检测，也一直成为体育界反兴奋剂工作的研究热点。因此，除了疾病诊断和环境、职业病等健康监测工作中，在司法、执法工作以及其他领域中(如反兴奋剂工作)中进行准确、快速的无机元素分析及检测结果，对了解事实真相具有重要意义。

由于全血中微量元素镁元素、钙元素、锰元素、铁元素、铜元素、锌元素、砷元素、硒元素、铅元素的含量可以反映元素在人体内的浓度，可以作为健康保健、辅助诊断、中毒症状和观察疗效的可靠依据，因此准确、快速的微量元素分析及检测结果的医学评价，对人体疾病诊断和环境、职业健康研究以及扫毒禁毒的生物监测提供有力依据。

目前对于元素的检测方法有：原子吸收光谱法(AtomicAbsorptionSpectrometry：AAS)、原子发射光谱法(Atomic Emission Spectrometry:AES)、原子荧光光谱法(Atomic Florescence Spectrometry:AFS)、紫外可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry:UVS)、电感耦合等离子体质谱(inductively coupledplasma-mass spectrometry:ICP-MS)。

血中微量元素的测定常采用原子吸收法(AAS),根据原子化的方式不同，原子吸收光谱法又可以被分为石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)、流动注射-冷蒸汽发生原子吸收光谱法(FI-VGAAS)以及火焰原子吸收光谱法(FAAS)。GF-AAS具有取样量少、前处理简单、灵敏度高、能直接分析固体和高粘度液体试样等优点，适用于生物样品的分析，在实际元素检验工作中被广泛应用，较为严重的基体干扰是其主要缺点，此外，一次只能对一种元素进行检测，耗时较长。FAAS是一种经典的分析技术，具有信号稳定、干扰相对较小、分析速度快、操作简单等优点，在痕量元素检测中多被采用。该方法的主要缺点是不适合测定分解不完全的耐高温元素、碱土金属元素以及共振吸收谱线在远紫外区的元素。FI-VGAAS可用于氢化物或冷蒸汽形成的元素检测，如砷、硒、铋、汞等。

晏晟等[晏晟，李伟新，解原,原子吸收光谱法与ICP-MS法测铊的对比研究,[J]，广东化工,2016,9:232-236],原子吸收光谱法与ICP-MS法测定铊，两者准确度和精密度均较高，均能满足地质样品的检测要求。两者比较而言，原子吸收光谱法操作过程较为繁琐，检出限与线性范围均不如ICP-MS，AAS的检出限5ug/L，ICP-MS的检出限为0.024ug/L。原子吸收光谱法的线性范围在0～10mg/L，ICP-MS法的线性范围在0～100ug/L，相关系数r＝0.9998。抗干扰能力较ICP-MS更强。ICP-MS的优点在于能够实现多元素的同时测定，操作更为方便快速，适合大批量样品。

电感耦合等离子体原子发射光谱法(Inductively Coupled plasmaAtomicEmission Spectroscopy：ICP-AES)，是一种采用电感耦合等离子体作为激发光源以及原子化装置的原子发射光谱的分析检测方法。ICP-AES具有以下优点：1、可以同时测定样品中的多种元素，具有多元素同时检测的能力；2、分析速度快，可在短时间内定量分析多达几十种元素；3、检出限较低，一般为1-10ug/L；4、分析准确度和精密度高，是各种分析方法中所受干扰较小的一种，一般情况下其相对标准偏差≤10％，当分析物浓度超过100倍检出限时，相对标准偏差≤1％。

ICP-AES在实际元素分析检测工作中应用较为广泛，如申治国等[申治国,徐新云,张顺祥,张仁利,何雅青，ICP-AES和ICP-MS法测定血中微量元素[J]，现代预防医学,2003,30(5)：644-645]，用ICP-MS检测学生血中砷、铅、硒、钡、锑、锗，其值在0.004-1.08mg/kg，用ICP-AES检测学生血中铝、钙、铁、钾、镁、锰、铜、锌含量，其值在0.03-1409mg/kg。徐军等[徐军等，ICP-MS/ICP-AES法分析成年男性血清中18种元素含量参照值，广东微量元素科学，2006,13(4):17-23]，对于K、Mg、Ca、Na、Fe采用ICP-AES检测，其检出限为0.02-0.60ug/mL,对于As、Cd、Co、Cr采用ICP-MS检测，其检出限为0.005-0.1ng/mL。对于常量元素可以用ICP-AES进行检测，而对于痕量元素，其检测限达不到痕量元素的要求，需用ICP-MS检测。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法使用ICP焰炬作为仪器的原子化和离子化装置，将质谱作为检测手段，可对元素周期表中大部分元素进行测定，同时可以满足对测定灵敏度的要求。该方法谱图简单，试样制备和进样技术简单，质量扫描快速，分析速度快，运行周期短，且选择性好，线性范围宽，检出限低，能进行多种元素检测和同位素比测定，是一种前景广阔的痕量(超痕量)无机多元素分析技术，目前已广泛应用于冶金、环境、医学、生物等领域，成为最强有力的元素分析技术，是一种适合检测人体体液样品的分析方法。ICP-MS对大多数金属元素具有ng/L级的检出限,无需富集处理,从而减少了环境对样品的污染,提高了分析方法的可靠性和准确性。

血液的微量元素分析经常作为疾病诊断和环境、职业健康研究的生物监测手段。但是由于微量元素的含量很低，多数元素在ng/L-ug/L级别，而人体血液的基质复杂，给检测过程带来了很多不确定影响因素，因此，在临床上建立一套准确检测血液微量元素的方法具有重要意义。ICP-MS检测人体中微量元素，需要首先对样品进行前处理，由于血清成分复杂，含有蛋白质、无机盐、胆固醇等成分，复杂的基质给测量带来干扰，样品前处理有助于减少基体干扰，并且适当的样品前处理方法可以提高测量准确度。主要前处理方法有灰化和熔融，湿法消解，微波消解以及直接稀释法。样品的处理，既要防止待测痕量组分因挥发逸出或生成难溶化合物或吸附于器壁不易洗脱等原因造成的损失，又要防止前处理过程中引入的污染，还要使最终得到的样品溶液能满足测定条件的要求，如尽可能减少或消除基体干扰等。因此选择适当的样品处理方法对分析工作是十分重要的。

熔融技术多用于含硅较多的样品，由于其采用试剂空白较高，而血清中微量元素含量很低(ug/L～ng/L量级)，进而会对微量元素检测造成很大影响，且熔融过程会造成元素的挥发，影响微量元素检测的准确性和可靠性，而灰化法由于器皿在处理过程中会引入较大的干扰，因此血清样品前处理不采用熔融和灰化方法。

湿法消化是在生物样品的痕量元素分析中一种可以使用的方法，虽然痕量元素在消解过程中挥发损失比灰化小，由于血清中微量元素含量很低，其同样会干扰微量元素测定结果，故在血清微量元素检测中同样不宜采用。

微波消解是近年来在生物样品消化方面应用较多，它能够使样品基质中有机物分子破裂，使其转化为澄清透明液体，将大分子转化为无机元素形式存在，有利于ICP-MS进行检测。微波消解的过程中，由于要重复使用石英管或者特氟龙试管，两次消解之间容易引入污染，使微量元素的检测结果偏高。而且在消解过程中，需高温加热，血清样本存在元素损失的可能性。同时应用微波消解对血清样品进行处理，过程繁琐，虽然消解时间短，但消解完成后，冷却时间较长，不利于对大样本量的样品检测。

直接稀释法是通过向样品中加入稀释剂，对稀释后的样品进行直接检测的方法。通过直接稀释法对样品进行前处理，能够很好的避免消解过程中引入的干扰，同时我们采用了较高的稀释倍数，能够一定程度的抑制基体效应，而且，直接稀释法操作简便，能够尽量减少由于前处理过程引起的元素损失，处理样本效率高，能够在短时间内对大量样品进行前处理。

在化学分析中，精密度是指使用特定的分析程序，在受控条件下重复分析测定均一样品所获得测定值之间的一致性程度。精密度决定于偶然误差(过失除外)，表示测量结果的重现性。例如，日内精密度和日间精密度的测定：取一定浓度的对照品，重复进样3次，连续三天，测定日内和日间精密度。检出限则表示该检测方法在给定的置信水平上可以检出被测物质的最小浓度或最小量，其中以浓度表示的称为相对检出限，以质量表示的称为绝对检出限。由此可见，精密度越好，代表检出限的数值真实可信，因此在检测微量元素的现有技术中，如何获得更高的精密度RSD(即相对标准偏差)，进而最终获得更高灵敏的检出限，称为衡量检测方法准确性的重要指标。

中国发明专利申请201610100493.5、发明名称“末梢血中微量元素的检测方法”公开了一种检测末梢血的微量元素的方法，其中所用的稀释液包含体积浓度相等的HNO₃和曲拉通，并由体积浓度为5％～15％的储备液稀释100倍制成。虽然该发明公开了可检测微量元素镁、铁、铜、锌、铅、钙，但该发明并未公开能够证明其检测效果的各元素的精密度值和检出限，因此在缺少试验数据的情况下结果缺乏可信，最终没有授权。

中国发明专利申请201910486480.X、发明名称“一种测定人全血中铅、镉含量的方法”公开了一种测定人全血中铅、镉含量的方法。该发明采用ICP-MS(电感耦合等离子体质谱)法测定人全血中铅、镉含量，包括血液样本的前处理和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的分析步骤。通过内标法对待测血液样本中铅、镉含量进行定量。其中，使用1％HNO₃溶液配制标准工作液、内标工作液、调谐工作液，并先后用5％HNO₃、1％HNO₃溶液处理和稀释全血样品，然后完成测定。虽然该方法将内标法与电感耦合等离子体质谱法相结合，一定程度上提高了定量结果的准确性，但该浓度下的HNO₃溶液仍然存在未能充分消化血红细胞而充分释放微量元素，同时得到的样品均质性较差，在试剂管壁上存在一定残留，影响全部微量元素的检测，例如待测铅、镉元素的精密度RSD(即相对标准偏差)为3.10％～4.07％、3.78％～4.52％，虽然符合<5％的要求，铅定量限为0.0625ug/L，但仍然需要进一步改进的可能。

中国发明授权专利201810107419.5公开了一种全血中元素的电感耦合等离子体质谱法检测试剂盒及应用，检测包括本发明9种元素在内的32种微量元素。该发明意外地发现，现有的0.1％的HNO₃和0.1％曲拉通组合的稀释液，检测结果不太理想，不适合大量临床样本的检测(参见实施例2)。同时，更低浓度的使用0.01％的曲那通和0.06％HNO₃组合的稀释液时，全血稀释液会产生沉淀，检测结果的稳定性也不太理想，不适合大量临床样本的检测(参见实施例3)。然而，在特定的低浓度0.016-0.033％的HNO₃和0.02-0.04％曲拉通组合的稀释液，其RSD和检出限均取得较好的数值。基于该发现，该发明最终获得授权。

另外，作为最接近的现有技术，中国发明专利申请201610197111.5、发明名称“电感耦合等离子体质谱法测定人体全血中微量元素的方法”公开了一种测定人体全血中7种微量元素的方法，其中使用0.1％的硝酸和曲拉通的混合液作为稀释液，并以按1:30的比例对全血进行稀释。其中，稀释液含有低浓度的硝酸，可对血液中的血细胞进行分解，使血细胞中含有的元素释放入稀释液中；同时稀释液中的曲拉通可保证充分混匀后的溶液的均匀性。此外，该发明还通过将内标储备液用体积浓度为0.2％的硝酸溶液配置成质量浓度为100μg/L的内标工作液备用，内标元素为钪、锗、钇、铑、铟、铽和铋。虽然该发明取得了较好批内精密度(即日内精密度)、批间精密度，重复性高，然而其检测结果准确度不佳，检出限多为0.1％数量级，其中铁元素、铜元素的检出限分别为2.491mg/L、1.908μg/L，远远高于授权专利201810107419.5所报道的检出限数值，这进一步验证了使用0.1％的硝酸和曲拉通的混合液作为稀释液，会严重影响微量元素检测的准确性。

此外，现有的人体全血检测手段通常取静脉血，存在取样量大，前处理方法复杂，样品存储难度高，以及给病人造成较大的痛苦的缺点。同时人体中元素检测还存在部分元素的浓度很低，甚至达到痕量级别，而且基体复杂，给检测带来干扰，因此如何准确快速高效的进行多元素同时测定，是亟待解决的问题。

基于以上的研究，目前需要一种能进一步提高精密度和检出限的多种微量元素(如，镁、钙、锰、铁、铜、锌、砷、硒、铅、镉，以及更多)检测技术，该技术相对于现有技术，在保证精密度的情况下，具有更好的检出限且技术方案不同的优点，同时满足相比于静脉采血而不同的微量采血的检测需要。

发明内容

本发明所要解决的问题是：拟通过采集末梢血检测10种微量元素，解决静脉采血操作繁琐、采血量多，对于儿童的依从性差等问题；克服现有检测技术检测限无法满足微量末梢血检测的要求，以及现有样本前处理方法过程复杂、容易引入干扰的不足。提出一种取血量少、减轻病人痛苦、样本制备简单、样本保存时间长，所使用仪器检测能力高的末梢血中多种(10种及以上)电感耦合等离子体质谱检测方法。

为了解决上述问题，本发明从以下三个发明原理进行改进：

本发明第一原理在于：在本领域公知的稀释液中低浓度的硝酸有利于促使血细胞释放微量元素，曲拉通保证充分混匀后的溶液的均匀性的情况下，不再摸索稀释液的特定浓度，而是重点消除影响精密度和检出限的非质谱干扰。因此，本发明与以往的前处理试剂不同点在于：在前处理试剂中加入特定含量的异丙醇克服基体效应的不利影响，增强了待测微量元素检测信号的强度。同时，本研究未选用稀硝酸稀释进行标准曲线定容，而是选用特定比例的元素提取液来稀释内标物和外标物，从而校正基体效应和物理效应的干扰，有效地提高了反应的特异性。

本发明第二原理在于：在上述原理的基础上，引入含有特定含量范围的待测标准元素的全血质控品是全血无机元素测定用固态质控品：低、中、高三个浓度等级，该质控品的作用是：评价或验证测量精密度和测量准确度。

本发明第三原理在于：在上述原理的基础上，通过设计末梢血取血量筛选实验(40μL，60μL，80μL，100μL)和末梢血保存时间评估实验(24小时，48小时，72小时)，对于末梢血的采集和存储条件进行了确认。通过招募38例志愿者同时采集末梢血与静脉血，分别检测10种元素的含量，通过对比同一志愿者末梢血与静脉血的检测结果，对末梢血检测多种(10种)元素的一致性进行充分验证。

因此，本发明第一目的是提供一种ICP-MS检测末梢血多种微量元素的方法，所述方法包括步骤：

(1)样本采集：使用75％乙醇或异丙醇进行皮肤表面消毒，采用触压式末梢采血器进行采血，采用一次性微量采血管取血，并采用玻璃毛细管乳胶吸头对采集末梢血进行定量转移；

(2)样本待测液制备：按(1)的方法取(80μL)末梢血样本与1.9mL样本稀释液在2.5mL的离心管中进行混合，然后置于旋涡震荡混匀器上混匀30秒，其中所述的样本稀释液是含有0.1％(v/v)曲拉通溶液、0.1％(v/v)HNO₃和2％(v/v)异丙醇的混合溶液，余量为纯净水；

(3)空白样本制备：取装有1.9mL样本稀释液的2.5mL离心管，不向其中加入任何溶液，然后置于旋涡震荡混匀器上混匀30秒；

(4)质控检测液制备：按(1)的方法取复溶后的全血无机元素质控品与1.9mL样本稀释液在2.5mL的离心管中进行混合，然后置于旋涡震荡混匀器上混匀30秒，其中所述全血无机元素质控品是全血无机元素质控品含有肝素抗凝牛全血和国家标准标准溶液的混合固态质控品，其有高、中、低三个浓度，其各元素的浓度见下所示：

(5)样本待测液存储：稀释后的样本置于2-8℃冰箱内保存，存储时间(≤72小时)上机检测；

(6)配置相应浓度待测元素校准曲线的外标校准品和校准仪器漂移的内标校准品，其中所述的内标校准品是2％硝酸配制的含有锗Ge、钇Y、铟In、铽Tb元素的混合溶液，各元素浓度均为40μg/L；

(7)上机检测：

依次将空白样本、外标校准品0-5、质控检测液、样品待测液引入仪器进行测定，在线加入内标校准品，其中样品溶液和内标液以1:1进样；以外标校准品中待测元素信号和内标校准品中元素信号的比值为Y轴，外标校准品中待测元素的浓度为X轴，绘制校准曲线y＝ax+b，当各元素校准曲线的相关系数r²>0.999以上时，方可进行质控检测液的检测；当质控检测液检测结果的误差在95％置信区间以内，方可继续检测样品待测液；

其中，所述的外标校准品是用2％硝酸配制的含有Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Cd、Pb元素的混合的6种浓度梯度溶液，其各元素的梯度浓度如下所示：

(8)结果处理

软件自动根据(7)中回归方程计算出样本待测液中各待测元素含量的质量浓度(μg/L)，末梢血样本中微量元素浓度的计算为：

ρ_(X)＝(C_X-C₀)×K…………………………(1)

式中：

ρ_(X)—末梢血样本中微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

C_X—由标准曲线查得的样本待测液中微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

C₀—由标准曲线查得的空白样本中微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

K—全血稀释倍数；

V_X—末梢血的取血量，单位为毫升(mL)。

在一个实施方案中，所述步骤(1)中采集前需用肥皂水或洗手液清洗双手，尽可能减低外源性污染，随后使用75％乙醇或异丙醇进行消毒，避免使用碘伏/聚维酮碘进行消毒，因其可污染血液样本并对检测结果带来影响。

在另一实施方案中，所述步骤(2)中取样量(40μL，60μL，80μL，100μL)检测结果与靶值进行对比，同时取样量对比实验的样本数量为30例。在一个优选实施方案中，所述步骤(2)中末梢血中镁、钙、铜、硒、铅、镉最小采血量为60μL，锌、铁、锰和砷的最小采血量为80μL，故80μL为最小采血量。

应当指出的是，由于人体内镉和砷含量极低，采用质控品评估镉和砷的不同采血量。以质控品标示值或100μL结果为靶值，镁、锰、铜、硒、锌5种元素按照1/2室间质评允许总误差确定(＜12.5％)；铁元素按照1/2室间质评允许总误差确定(＜10％)，钙元素按照1/2室间质评允许总误差确定(靶值±0.125)，铅元素按照1/4室间质评允许总误差确定(靶值±10)，满足上述标准时，认定该取样量可作为最小取样量。

在另一实施方案中，所述步骤(5)中，将样本待测液存储时间24小时、48小时、72小时的检测结果与采集后立即检测的结果进行对比，同时末梢血存储时间对比实验的样本数量为20。在一个优选实施方案中，其中所述步骤(5)中对全血中钙，镁，锰，铁，铜，锌，硒，砷，镉和铅样本存储时间最长为72小时。

应当指出的是，由于人体内镉和砷含量极低。采用质控品进行评估，砷镉元素0h检测结果为质控品标示值，以0h检测结果为靶值，计算0h检测结果与不同保存时间结果之间的偏差，判定标准镁、锰、铜、硒、锌5种元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(＜12.5％)，铁元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(＜10％)，钙元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(靶值±0.125)，铅元素按照1/4室间质评允许总误差进行判断(靶值±10)，满足上述标准时，认定该保存时间可作为最长保存时间。

在另一实施方案中，所述步骤(4)中所述质控品是全血无机元素质控品含有肝素抗凝牛全血和国家标准标准溶液的混合固态质控品，其有高、中、低三个浓度。在一个优选实施方案中，其中10种元素浓度的计算通过(样本待测液-空白样本)×稀释倍数得到，其中稀释倍数的计算通过(样本量+1.9)/样本量得到。

在另一实施方案中，所述的方法还包括步骤：在步骤(7)用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行检测之前，用调谐液对ICP-MS仪器进行调试矫正。在一个优选实施方案中，其中所述的调谐液的配制：使用质量浓度为2％的硝酸溶液，稀释电感耦合等离子体质谱仪调谐使用的储备液，将其配制成含有锂元素、钴元素、铟元素、铀元素、铈元素、钡元素，质量浓度为10μg/L的调谐液备用，所述调谐液中的各元素选自：国家标准物质研究中心的编码号为GSB 04-1734-2004的锂元素、编码号为GSB 04-1722-2004的钴元素、编码号为GSB 04-1731-2004的铟元素、编码号为GBW(E)080173的铀元素、编码号为GSB 04-1775-2004的铈元素、编码号为GSB 04-1717-2004的钡元素。

在上述任一实施方案中，所述步骤(2)-(5)为用于ICP-MS检测微量元素的全血样本前处理方法。

在上述任一实施方案中，所述血样包括健康成年人、儿童和孕妇的血样，以及疑似中毒人群的血样。

在其他实施方案中，所述检测方法用于检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测或鉴定。

本发明第二目的是提供一种用于上述ICP-MS法检测末梢血多种微量元素的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(1)样本稀释液：所述的样本稀释液是含有0.1％(v/v)曲拉通溶液、0.1％(v/v)HNO₃和2％(v/v)异丙醇的混合溶液，余量为纯净水；

(2)内标校准品：所述的内标校准品是2％硝酸配制的含有锗Ge、钇Y、铟In、铽Tb元素的混合溶液，各元素浓度均为40μg/L，

(3)外标校准品：所述的外标校准品是用2％硝酸配制的含有Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Cd、Pb元素的混合的6种浓度梯度溶液，其各元素的梯度浓度如下所示：

(4)全血无机元素质控品：所述全血无机元素质控品是全血无机元素质控品含有肝素抗凝牛全血和国家标准标准溶液的混合固态质控品，其有高、中、低三个浓度，其各元素的浓度见下所示：

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括消毒液和采血装置，其中消毒液为75％乙醇或异丙醇，采血装置包括触压式末梢采血器、一次性微量采血管(100μL)、玻璃毛细管乳胶吸头。

在一个实施方案中，所述内标校准品的内标元素选自：国家标准物质研究中心的编码号为GSB 04-1728-2004的锗元素、编码号为GSW 08657的钇元素、编码号为GSB04-1731-2004的铟元素、编码为GSB 04-1781-2004的铽元素。

在另一实施方案中，所述外标校准品STD0为校准空白，各元素浓度均为0μg/L，外标校准品STD1-5由混合标准溶液稀释(32、16、8、4、2倍)得到。。

还在一个实施方案中，步骤(3)中用于通过稀释而制备外标校准品的梯度浓度溶液的标准混合溶液由16mg/L镁、32mg/L钙、32μg/L锰、160mg/L铁、480μg/L铜、2400μg/L锌、32μg/L砷、64μg/L硒、32μg/L镉和64μg/L铅组成。在一个优选实施方案中，所述外标校准品中的外标元素选自：国家标准物质研究中心的编码号为GNM-SMG-001-2013的镁元素、编码号为GNM-SCA-001-2013的钙元素、编码号为GSB04-1736-2004的锰元素、编码号为GNM-SFE-001-2013的铁元素、编码号为GSB04-1725-2004的铜元素、编码号为GSB04-1761-2004的锌元素、编码号为GSB04-1714-2004的砷元素、编码号为GSB04-1751-2004的硒元素、编码为GSB 04-1721-2004的镉元素、编码号为GSB04-1742-2004的铅元素。

在上述任一实施方案中，全血无机元素质控品中所用固态质控品(高、中、低)在使用前需要按规定准确取用5mL超纯水溶解，溶解过程中避免剧烈震动，致使气泡产生；溶解后的液态质控品需摇匀，冷藏条件下，有效保存时长30天。在一个优选实施方案中，在室温条件下，至少取两瓶不同浓度的含有肝素抗凝牛全血和国家标准溶液的混合固态质控品，每瓶中准确加入5mL超纯水，混匀30min直至完全溶解后，取复溶后的质控品80μL加入1.9mL样本稀释液，并置于旋涡震荡混匀器上混匀30秒，标记为质控样本。

本发明第三目的是提供上述试剂盒用于检测全血中微量元素的用途。

在一个实施方案中，所述用途是检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测或鉴定，以及人体微量元素含量评估。

技术效果

1.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中，建立了一种适用于末梢血多元素高灵敏度、高特异性、高抗干扰性、高精密度、高重复性的检测方法，该方法可用于非疾病诊断的检测用途，例如检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测或鉴定，以及人体微量元素含量评估。

2.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中检测精密度好，其中批内精密度＜10％，批间精密度<15％。

3.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中在ICP-MS的检测平台上，检出限普遍低于或等同于现有技术，各元素的检出限为：镁为0.001μg/L、钙为0.0122μg/L、锰为0.0443μg/L、铁为0.0015μg/L、铜为0.0335μg/L、锌为0.3368μg/L、砷为0.059μg/L、硒为0.0244μg/L、镉为0.0009μg/L、铅为0.0034μg/L。

4.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中所测元素特异性强：ICP-MS检测是基于元素的质荷比，因此本发明对于末梢血中的微量元素检测特异性强，定量准确。

5.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中，采用末梢血，与静脉采血相比，患者的体验感更好，样本量更少，前处理方法更为简单便捷，适合大量样本的采集与检测。

6.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中，样本制备采用稀释法，稀释法操作便捷，成本低，不易引入干扰，适合大量样本的快速处理。

7.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中，样本取血量(40μL，60μL，80μL)经过对比实验验证全血中镁、钙、铜、硒、铅、镉最小采血量为60μL，锌、铁、锰和砷的最小采血量为80μL，故最终采血量为80μL。

8.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中，稀释后的样本存储时间(0小时、24小时、48小时、72小时)经过对比实验验证最长可达72小时，非常适合无法当场提供检测仪器的医疗机构，有充分的样本保存和转运时间，同时保存样本的质量有可靠保证。

9.本发明提供的末梢血中多种(10种及以上)元素电感耦合等离子体质谱检测方法中，通过电感耦合等离子体质谱法对静脉血和末梢血中镁，钙，锰，铁，铜，锌，砷，硒，镉和铅10种元素进行检测，结果显示该方法末梢血中微量元素结果与静脉血具有可比性。

原理与定义

1.本发明的检测原理在于，质谱系统的电感耦合等离子体源由高能的射频能量激发形成等离子体，含待测元素的外标校准品在高温等离子体的作用下，经过蒸发、解离、原子化和电离等过程，形成的一价正离子依次经过锥接口和离子传输系统进入高真空的四级杆快速扫描质谱检测部分。软件中根据混合元素外标校准品中待测元素信号和内标信号的比值及混合元素外标校准品中待测元素的浓度绘制标准曲线，以此对仪器进行校准。

2.术语“元素”指具有相同的核电荷数(即核内质子数)的一类原子的总称。在人体中，同一元素存在着不同质子数的情况，例如C12、C14。本发明中对于检测元素同位素的选择，参考以下2个标准：选择相对丰度较高的同位素，选择相对干扰(氧化物，多原子等质谱干扰)较小的同位素。以Se元素为例，Se存在同位素77、78、80、82，相对丰度较高的是78和80两个同位素，而80同位素存在Ar双原子的干扰，会严重影响检测结果，因此，选择78同位素作为检测对象。

3.术语“标准品”，即标准物质/标准样品，是一种材料或物质，其一种或多种特性值足够均匀和稳定并被良好确定，用于校准测量系统、评价测量程序或为材料赋值。

4.术语“校准品”，即：校准物是在校准函数中其值被用作自变量的标准物质，用于校准测量系统或为材料赋值；正确性质控物质是用于评价一种测量系统的测量偏差的标准物质。

5.标准物质有校准和评价测量系统两个主要功能，具有溯源性，可溯源至国家标准物质。一种标准物质在一个测量程序或测量系统中即可以用作校准物质，也可以用作正确性质控物质，但不可以同时用作校准物质和正确性质控物质。一般情况下标准物质是指较高级别的标准物质，它们多数是有证标准物质。有证标准物质是附有证书的标准物质，其一种或多种特性值用可建立溯源性的程序确定，使之可溯源至准确复现的表示该特性值的测量单，每种确定的特性值都有给定置信水平的不确定度。可见有证标准物质和标准物质的区别是前者有明确的溯源性和不确定度要求。2007年8月1日我国正式发布和实施的《标准物质标准样品生产者能力认可准则》中对标准物质生产者的组织生产管理、标准物质的赋值及统计方法、不确定度评定、标准物质所须达到的性能指标等提出了较高的要求。

6.术语“检测产品”，指用于检测人体血清中元素的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片(如固体芯片、液体芯片等)、检测载体，以及检测试剂盒等。

7.非质谱干扰：由于血液样品中含有大量的蛋白质混合物、碳水化合物及无机盐等，成分复杂，造成待测元素的信号抑制或增敏等基体效应；物理效应是因为血液溶液中盐浓度本底较高，随着进样时间的增加，基体氧化物粉末沉积导致锥孔出现堵塞，待测离子流信号稳定性变差而发生漂移。

附图说明

图1-图10为10种元素所建立的标准曲线，α：曲线的测量结果。根据试验设计，预期各曲线应当达到：

(1)误差的绝对值越小，检测点越接近拟合曲线，表示线性拟合越好。

(2)选用更严格的判断指标，线性拟合系数R，国标(GB/T 26124-2011临床化学体外诊断试剂(盒))5.5规定，线性相关系数R≥0.990。而本发明的R²>0.9996-0.9997-0.9998。

(3)标准浓度配置准确，带来高度拟合；整体说明远远超出国家标准规定的精度。也说明了该元素所选用的内标元素是合适准确的。

(4)本曲线数据点分布较均匀，说明该曲线延伸合理。

图1为元素镁的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且未知样本(实际检测患者的实施例)的检测结果在该曲线的中断，证明曲线的范围合理。

图2为元素钙的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且未知样本(实际检测患者的实施例)的检测结果在该曲线的中断，证明曲线的范围合理。

图3为元素锰的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且未知样本(实际检测患者的实施例)的检测结果在该曲线的中断，证明曲线的范围合理。

图4为元素铁的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且未知样本(实际检测患者的实施例)的检测结果在该曲线的中断，证明曲线的范围合理。

图5为元素铜的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且未知样本(实际检测患者的实施例)的检测结果在该曲线的中断，证明曲线的范围合理。

图6为元素锌的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且未知样本(实际检测患者的实施例)的检测结果在该曲线的中断，证明曲线的范围合理。

图7为元素砷的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且此元素为有毒元素，未知样本的检测结果在该曲线的下段，该元素的检测上限为15.9μg/L，证明曲线的范围合理。

图8为元素硒的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且未知样本(实际检测患者的实施例)的检测结果在该曲线的中断，证明曲线的范围合理。

图9为元素镉的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且此元素为有毒元素，未知样本的检测结果在该曲线的下段，该元素的检测上限为15.8μg/L，证明曲线的范围合理。

图10为元素铅的标准曲线，结果显示达到以上预期效果，并且此元素为有毒元素，未知样本的检测结果在该曲线的下段，该元素的检测上限为32.1μg/L，证明曲线的范围合理。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1、仪器工作参数

采用微量元素分析仪(Clin-ICP-QMS-I)进行微量元素分析，其基本的工作参数如下表所示：

表1仪器参数设置

实施例2、不同稀释液筛选实验

2.1样本处理

2.1.1复溶

将1瓶冻干全血质控品用5mL的纯化水复溶，轻轻盖上瓶盖，通过缓慢连续滚动30分钟左右来确保粉末完全溶液，不能摇晃混匀，避免产生大量气泡，形成全血质控品复溶液。

2.1.2稀释

取全血质控品复溶液100uL,溶于1.9mL样本稀释液中，充分混匀，形成质控待测液，等待上机检测。

2.1.3样本稀释液

样本稀释液A：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+0.1％异丙醇(v/v)

样本稀释液B：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+0.5％异丙醇(v/v)

样本稀释液C：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+1％异丙醇(v/v)

样本稀释液D：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+2％异丙醇(v/v)

样本稀释液E：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+5％异丙醇(v/v)

样本稀释液F：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+2％1,4-丁二醇(v/v)

样本稀释液G：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+2％乙醇(v/v)

样本稀释液H：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+2％丙酮(v/v)

样本稀释液I：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+2％甲醇(v/v)

样本稀释液J：0.1％硝酸(v/v)+0.1％曲拉通(v/v)+2％正丁醇(v/v)

2.1.4外标校准品

利用2％硝酸配制10元素6个梯度浓度，10种元素的浓度如下表所示：

表2外标校准品10种元素的浓度

表3外标校准品中10元素原材料的信息

2.1.5内标校准品

利用2％硝酸配制钪Se、锗Ge、铑Rh、钇Y、铟In、镥Lu、铋Bi元素，浓度40μg/L。

表4内标校准品中4元素原材料的信息

2.1.6质控品

全血无机元素质控品是含有肝素抗凝牛全血和国家标准溶液的混合固态质控品，其有高、中、低三个浓度，其浓度见下表所示。

表5全血无机元素质控品标示值

2.2样本测定

使用调谐液(10μg/L锂Li、钴Co、铟In、铀U、铈Ce、钡Be)将仪器的信号调至最强，利用He模式将仪器干扰调至最低。所述调谐液中的各元素选自：国家标准物质研究中心的编码号为GSB 04-1734-2004的锂元素、编码号为GSB 04-1722-2004的钴元素、编码号为GSB04-1731-2004的铟元素、编码号为GBW(E)080173的铀元素、编码号为GSB04-1775-2004的铈元素、编码号为GSB 04-1717-2004的钡元素。

将外标校准品和内标校准品同时进样，仪器会根据外标校准品中6个点的浓度自动建立校准曲线(以外标校准品中各元素的浓度为横坐标，以外标校准品和内标校准品各元素的信号的比值为纵坐标)。校准曲线需满足R²≥0.999。然后依次对样本稀释液和质控待测液进行9元素检测。每个样本连续检测3次，计算每种样本稀释液稀释后的质控品的相对偏差。

表6 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+0.1％异丙醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

31.9％

2.4％

7.6％

6.7％

10.2％

5.6％

21.8％

1.2％

6.0％

表7 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+0.5％异丙醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

24.9％

0.8％

9.0％

6.7％

12.0％

4.6％

3.3％

3.8％

7.2％

表8 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+1％异丙醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

19.1％

3.3％

6.4％

6.2％

13.6％

5.0％

4.0％

2.2％

8.4％

表9 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

2.3％

4.5％

4.3％

8.4％

7.3％

2.0％

0.2％

7.2％

6.5％

表10 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+5％异丙醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

26.8％

5.3％

0.9％

3.7％

9.3％

3.1％

22.4％

29.9％

6.1％

表11 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％1,4-丁二醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

39.0％

5.3％

6.8％

15.1％

7.9％

0.6％

4.7％

4.9％

5.0％

表12 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％乙醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

21.5％

4.8％

5.3％

10.5％

9.4％

0.7％

5.7％

0.5％

7.0％

表13 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％丙醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

42.3％

3.2％

1.0％

3.0％

11.5％

4.3％

35.1％

44.6％

5.8％

表14 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％甲醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

34.9％

3.9％

3.8％

14.2％

8.2％

1.0％

9.6％

9.1％

4.9％

表15 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％正丁醇稀释后的质控品的相对偏差

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

8.8％

3.6％

9.4％

11.1％

11.5％

1.9％

5.5％

6.8％

8.4％

2.3结论

在使用样本稀释液(0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇)稀释的质控品，对于以上9种元素的相对偏差都≤10％，效果最好。因此，选用该成分和比例的稀释液，可以预计检测10种元素也具有最好的相对偏差。

实施例3、内标、外标校准品用2％硝酸制备与用样本稀释液(0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇)制备的区别实验

操作方法和仪器参数同上述，依次用2％硝酸制备的内标和外标校准品进样，作出校准曲线(R²>0.999)后，进样用样本稀释液(0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇)稀释的质控品3次，再用样本稀释液(0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇)制备的内标和外标校准品进样，作出校准曲线(R²>0.999)后，进样用样本稀释液(0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇)稀释的质控品3次。两种方法的相对偏差如下表所示。

表16 2％硝酸配制的内标和外标校准品

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

2.3％

4.5％

4.3％

8.4％

7.3％

2.0％

0.2％

7.2％

6.5％

表17 0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇配制的内标和外标校准品

待测元素

Mg

Ca

Mn

Fe

Cu

Zn

As

Se

Pb

相对偏差(％)

2.1％

4.4％

2.5％

1.0％

0.8％

0.4％

3.8％

1.5％

0.8％

结论：内标校准品、外标校准品和样本在使用相同稀释液时，其检测结果的相对偏差更加小。

实施例4、确定采血量和相对偏差

4.1质控品初步确定采血量

使用调谐液(10μg/L锂Li、钴Co、铟In、铀Μ、铈Ce、钡Be)将仪器的信号调至最强，利用He模式将仪器干扰调至最低。

将外标校准品和内标校准品同时进样，仪器会根据外标校准品中6个点的浓度自动建立校准曲线(以外标校准品中各元素的浓度为横坐标，以外标校准品和内标校准品各元素的信号的比值为纵坐标)。校准曲线需满足R²≥0.999。然后依次对样本空白和质控待测液进行10元素检测。每个样本连续检测10次，计算不同稀释倍数稀释后的质控品与标示值的相对偏差(％)和精密度RSD(％)(结果见下表)。

相对偏差计算公式：

其中：

X——检测结果

T——质控品的标示值

精密度计算公式：

其中：

式中：

——n组测量数据的平均值；

x_i——第i组测量数据(3次扫描的平均值)；

s——标准偏差；

n——测量组数。

表18全血质控品不同采血量相对偏差

4.2临床样本确定采血量

上述4.1质控品不同采血量检测结果显示(见上表)，当取样量40μL时，其相对偏差较大，因此在临床样本确定采血量实验中仅评估60μL和80μL取样量。随机采取肝素抗凝静脉血30例，用加样枪准确移取符合上述要求的样本，每份样本同时吸取60μL、80μL、100μL静脉血，置于装有1.9mL的样本稀释液中，充分混匀标记待测。每份样本重复检测3次计算均值。以100μL静脉血结果作为靶值，分别比较60μL和80μL检测结果的偏差(结果见下表)。由于人体内镉和砷含量较低，采用质控品标示值评估镉和砷的不同采血量。镁、锰、铜、硒、锌5种元素按照1/2室间质评允许总误差确定(＜12.5％)；铁元素按照1/2室间质评允许总误差确定(＜10％)，钙元素按照1/2室间质评允许总误差确定(靶值±0.125)，铅元素按照1/4室间质评允许总误差确定(靶值±10)，满足上述标准时，认定该取样量可作为最小取样量(数据未显示)。

表19临床样本不同采血量平均相对/绝对偏差(n＝30例)¹

¹注：由于人体内砷和镉含量极低，因此未对其采血量进行计算。

²注：由于篇幅的限制，“平均绝对/相对偏差”为30例临床标本平均偏差，各样本十种元素不同采血量的具体偏差数据未显示。

4.3结论

镉和砷元素采血量用质控品进行评估，结果显示镉最小采血量为40uL，砷采血量为80μL；其余元素采用临床样本进行评估，结果显示镁、钙、铜、硒、铅5种元素最小采血量为60ul；锌、铁和锰3种元素最小采血量为80μL(详细结果数据未显示)，因此80μL为最小采血量。

实施例5：确定最长保存时间与相对偏差

5.1前处理

5.1.1样本处理

随机采取肝素抗凝静脉血20例，用加样枪准确移取80μL置于1.9mL的样本稀释液中，充分混匀标记待测。每份样本重复检测3次计算均值，以0h结果作为基准，分别比较24h、48h、72h检测结果的偏差(结果见表20)

5.1.2外标校准品

用2％硝酸配制10元素6个梯度浓度的外标校准品，10种元素的浓度及原材料信息同实施例2。

4.1.3内标校准品

用2％硝酸配制内标校准品，包含锗Ge、钇Y、铟In、铽Tb等4种元素，浓度均为40μg/L。内标校准品原材料信息同实施例2。

4.2质控品和静脉血样本保存时间的测定

使用调谐液(10μg/L的锂Li、钴Co、铟In、铀Μ、铈Ce及钡Be)将仪器的信号调至最强，利用He模式将仪器干扰调至最低。

将外标校准品和内标校准品同时进样，仪器会根据外标校准品中6个点的浓度自动建立校准曲线(以外标校准品中各元素的浓度为横坐标，以外标校准品和内标校准品各元素的信号的比值为纵坐标)。校准曲线需满足R²≥0.999。然后依次对样本空白、质控待测液和样本进行10元素检测。质控品24h、48h、72h检测结果与标示值进行比较；临床样本24h、48h、72h检测结果和0h的结果进行比较，计算偏差％。判定标准：镁、锰、铜、硒、锌5种元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(＜12.5％)，铁元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(＜10％)，钙元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(靶值±0.125)，铅元素按照1/4室间质评允许总误差进行判断(靶值±10)，满足上述标准时，认定该保存时间可作为最长保存时间。(检测结果见下表)。

表20质控品保存24h、48h、72h检测结果相对偏差

表21临床样本保存24h、48h、72h检测结果的平均相对/绝对偏差(n＝20例)¹

¹注：由于人体内砷和镉含量极低，因此未对其保存时间进行计算。

²注：由于篇幅的限制，“平均绝对/相对偏差”为20例临床标本平均偏差，各样本十种元素不同保存时间的具体偏差数据未显示。

5.3结论

镉和砷元素最长保存时间采用质控品进行评估，结果显示镉和砷最长保存时间为72h；其余元素采用临床样本进行评估，结果显示镁、钙、铜、硒、铅、锌、铁和锰八种元素最长保存时间为72h(数据未显示)，因此72h为最长保存时间。

实施例6：仪器检出限

6.1仪器检出限

混合溶液：利用2％硝酸配制镁Mg、钙Ca、锰Mn、铁Fe、铜Cu、锌Zn、砷As、硒Se、镉Cd、铅Pb元素，浓度10μg/L。

根据《GBT-34826-2017-四极杆电感耦合等离子体质谱仪性能的测定方法》将超纯水连续进样20次检测10元素的CPS值，计算20组数据的标准偏差SD，将混合溶液连续进样20次检测10元素的CPS值，计算20组数据的灵敏度S。仪器检出限＝3SD/S。

6.2方法检出限

根据《GB/T-27415-2013分析方法检出限和定量限的评估》将低浓度质控品多倍稀释后，按样本检测方法检测10元素，直至检测结果低于仪器检出限，取上一个稀释倍数的检测结果即为方法检出限(见下表)。

表22检出限结果

实施例7：加标回收率

7.1加标液的制备

用2％硝酸配制Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Cd、Pb元素的混合溶液取浓度分别为(320mg/L、640mg/L、1280μg/L、3200mg/L、9600μg/L、48000μg/L、1280μg/L、1280μg/L、1280μg/L、1280μg/L)。

7.2加标样本制备

样本及加标样本的配制方法如下表所示。

表23样本及加标样本的配制方法

7.3上机检测

操作方法和仪器参数同上述，用样本稀释液(0.1％硝酸+0.1％曲拉通+2％异丙醇)制备的内标和外标校准品进样，作出校准曲线(R²>0.999)后，一次进样样本1和样本2每个样本检测3次，计算其加标回收率如下表所示。

表24各元素加标回收率

结论：十种元素加标回收率均满足80％-120％的要求。

实施例8：精密度

8.1前处理

8.1.1复溶

将高、中、低三种浓度质控品各取1瓶，用5mL的超纯水复溶，轻轻盖上瓶盖，通过缓慢连续滚动30分钟左右来确保粉末完全溶液，形成全血质控品复溶液。注意混匀时不能剧烈震荡，避免产生大量气泡。

8.1.2稀释

样本1：取高浓度全血质控品复溶液80μL，溶于1.9mL样本稀释液中，充分混匀，形成质控待测液，等待上机检测。

样本2：取中浓度全血质控品复溶液80μL,溶于1.9mL样本稀释液中，充分混匀，形成质控待测液，等待上机检测。

样本3：取低浓度全血质控品复溶液80μL,溶于1.9mL样本稀释液中，充分混匀，形成质控待测液，等待上机检测。

8.1.4外标校准品

利用2％硝酸配制10元素6个梯度浓度的外标校准品，10种元素的浓度及原材料信息同实施例2。

8.1.5内标校准品

利用2％硝酸配制内标校准品，包含锗Ge、钇Y、铟In、铽Tb等4种元素，浓度均为40μg/L。内标校准品原材料信息同实施例2。

8.2样本测定

使用调谐液(10μg/L锂Li、钴Co、铟In、铀U、铈Ce、钡Be)将仪器的信号调至最强，利用He模式将仪器干扰调至最低。

将外标校准品和内标校准品同时进样，仪器会根据外标校准品中6个点的浓度自动建立校准曲线(以外标校准品中各元素的浓度为横坐标，以外标校准品和内标校准品各元素的信号的比值为纵坐标)。校准曲线需满足R²≥0.999。然后依次对样本稀释液和质控待测液进行10元素检测。批内精密度评估：每个样本连续检测10次；批间精密度评估：每个样本分别测量3组数据，每天检测2次，连续检测5天，计算不同浓度质控品的精密度RSD(见下表)。

8.3末梢血精密度测定

按照(1)中采血标准流程，对10位受试者采集末梢血，每份标本采集80μL，置于1.9mL样本稀释液中，将10份样本混和，标记待测。计算不同元素的精密度RSD(见下表)。

表25质控品低、高浓度批内和批间精密度RSD(％)

表26末梢样本精密度RSD¹(％)

¹注：由于人体内砷和镉含量极低，因此未对其精密度进行计算。

²注：精密度越小表示，测量结果的再现性越高，说明仪器检测该样本的结果稳定性越高。

8.4质控品批间精密度评估

按照上述操作流程，每天每批次跟随样本进行质控品检测，累计30天，计算平均值

和标准差，评估批间精密度RSD％(见下表)判断标准为＜15％。

表27 30天累计质控品日间精密度

8.5结论：此方法检测高、低浓度质控品中10种元素的批内精密度都均＜10％。末梢血批内精密度均＜10％，质控品批间精密度＜15％。

实施例9：静脉血与末梢血的比对

9.1样本采集

(1)采血器具：肝素抗凝采血管及静脉采血针；一次性触压式末梢血采血器，一次性末梢采血管、微量采血吸管及乳胶吸头；

(2)受试者：38位表观健康志愿者；

(3)采集方法：同一位志愿者，在相同时间分别采静脉血(2mL)和末梢血(80μL)，分别标记为末-1和静-1。

9.2上机检测

利用ICP-MS检测方法，在线添加内标校准品，按照如下顺序进样，外标校准品0-5，空白样本，质控样本，静脉血(静-1～静38)，末梢血(末-1～末-38)。

9.3结果计算：稀释倍数＝(样本量+1.9)/样本量；浓度＝(检测结果-空白)×稀释倍数。以静脉血检测结果为靶值，镁、锰、铜、硒、锌5种元素按照3/4室间质评允许总误差进行判断(＜18.75％)，铁元素按照3/4室间质评允许总误差进行判断(＜15％)，钙元素按照3/4室间质评允许总误差进行判断(靶值±0.188)，铅元素按照1/4室间质评允许总误差进行判断(靶值±10)。(见下表)

9.4结论：镁、钙、铁、硒、铜、锌、铅、镉8中元素果具有可比性(结果见下表)。

表28静脉血和末梢血比对结果(38例)

¹室间质评允许总误差±25％，3/4TEa±18.75％，1/2允许总误差±12.5％

²室间质评允许总误差±20％，3/4TEa±15％，1/2允许总误差±10％

³室间质评允许总误差±0.25，3/4TEa±0.188，1/2允许总误差±0.125

⁴室间质评允许总误差±40，1/4允许总误差±10

实施例10：实际检测20例患者样本

根据以上实施例的方法，临床抽取20例患者的血样，进行检测。数据结果如下。

表29实际检测20例患者样本

表30 10种微量元素的参考范围

综上所述，利用本发明建立的方法，结合本实施例的试验数据，证明可以准确区分和鉴定阳性样本和阴性样本。

Claims (10)

1.一种ICP-MS检测末梢血多种微量元素的方法，所述方法包括步骤：

(1)样本采集：使用75％乙醇或异丙醇进行皮肤表面消毒，采用触压式末梢采血器进行采血，采用一次性微量采血管取血，并采用玻璃毛细管乳胶吸头对采集末梢血进行定量转移；

(2)样本待测液制备：按(1)的方法取(80μL)末梢血样本与1.9mL样本稀释液在2.5mL的离心管中进行混合，然后置于旋涡震荡混匀器上混匀30秒，其中所述的样本稀释液是含有0.1％(v/v)曲拉通溶液、0.1％(v/v)HNO₃和2％(v/v)异丙醇的混合溶液，余量为纯净水；

(3)空白样本制备：取装有1.9mL样本稀释液的2.5mL离心管，不向其中加入任何溶液，然后置于旋涡震荡混匀器上混匀30秒；

(4)质控检测液制备：按(1)的方法取复溶后的全血无机元素质控品与1.9mL样本稀释液在2.5mL的离心管中进行混合，然后置于旋涡震荡混匀器上混匀30秒，其中所述全血无机元素质控品是全血无机元素质控品含有肝素抗凝牛全血和国家标准标准溶液的混合固态质控品，其有高、中、低三个浓度，其各元素的浓度见下所示：

(5)样本待测液存储：稀释后的样本置于2-8℃冰箱内保存，存储时间(≤72小时)上机检测；

(6)配置相应浓度待测元素校准曲线的外标校准品和校准仪器漂移的内标校准品，其中所述的内标校准品是2％硝酸配制的含有锗Ge、钇Y、铟In、铽Tb元素的混合溶液，各元素浓度均为40μg/L；

(7)上机检测：

依次将空白样本、外标校准品0-5、质控检测液、样品待测液引入仪器进行测定，在线加入内标校准品，其中样品溶液和内标液以1:1进样；以外标校准品中待测元素信号和内标校准品中元素信号的比值为Y轴，外标校准品中待测元素的浓度为X轴，绘制校准曲线y＝ax+b，当各元素校准曲线的相关系数r²>0.999以上时，方可进行质控检测液的检测；当质控检测液检测结果的误差在95％置信区间以内，方可继续检测样品待测液；

其中，所述的外标校准品是用2％硝酸配制的含有Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Cd、Pb元素的混合的6种浓度梯度溶液，其各元素的梯度浓度如下所示：

(8)结果处理

软件自动根据(7)中回归方程计算出样本待测液中各待测元素含量的质量浓度(μg/L)，末梢血样本中微量元素浓度的计算为：

ρ_(X)＝(C_X-C₀)×K…………………………(1)

式中：

ρ_(x)—末梢血样本中微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

C_X—由标准曲线查得的样本待测液中微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

C₀—由标准曲线查得的空白样本中微量元素的质量浓度，单位为微克每升(μg/L)；

K—全血稀释倍数；

V_X—末梢血的取血量，单位为毫升(mL)。

2.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(2)中取样量(40μL，60μL，80μL，100μL)检测结果与靶值进行对比，同时取样量对比实验的样本数量为30例，优选所述步骤(2)中末梢血中镁、钙、铜、硒、铅、镉最小采血量为60μL，锌、铁、锰和砷的最小采血量为80μL，故80μL为最小采血量。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(2)以质控品标示值或100μL结果为靶值，镁、锰、铜、硒、锌5种元素按照1/2室间质评允许总误差确定(＜12.5％)；铁元素按照1/2室间质评允许总误差确定(＜10％)，钙元素按照1/2室间质评允许总误差确定(靶值±0.125)，铅元素按照1/4室间质评允许总误差确定(靶值±10)，满足上述标准时，认定该取样量可作为最小取样量。

4.权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(5)中，将样本待测液存储时间24小时、48小时、72小时的检测结果与采集后立即检测的结果进行对比，同时末梢血存储时间对比实验的样本数量为20，优选所述步骤(5)中对全血中钙，镁，锰，铁，铜，锌，硒，砷，镉和铅样本存储时间最长为72小时。

5.权利要求5所述的方法，其中所述步骤(5)中，采用质控品进行评估，砷镉元素0h检测结果为质控品标示值，以0h检测结果为靶值，计算0h检测结果与不同保存时间结果之间的偏差，判定标准镁、锰、铜、硒、锌5种元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(＜12.5％)，铁元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(＜10％)，钙元素按照1/2室间质评允许总误差进行判断(靶值±0.125)，铅元素按照1/4室间质评允许总误差进行判断(靶值±10)，满足上述标准时，认定该保存时间可作为最长保存时间。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述步骤(4)中所述质控品的10种元素浓度的计算通过(样本待测液-空白样本)×稀释倍数得到，其中稀释倍数的计算通过(样本量+1.9)/样本量得到。

7.权利要求7的方法，其中在步骤(7)用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行检测之前，用调谐液对ICP-MS仪器进行调试矫正，其中所述的调谐液的配制：使用质量浓度为2％的硝酸溶液，稀释电感耦合等离子体质谱仪调谐使用的储备液，将其配制成含有锂元素、钴元素、铟元素、铀元素、铈元素、钡元素，质量浓度为10μg/L的调谐液备用，所述调谐液中的各元素选自：国家标准物质研究中心的编码号为GSB 04-1734-2004的锂元素、编码号为GSB04-1722-2004的钴元素、编码号为GSB 04-1731-2004的铟元素、编码号为GBW(E)080173的铀元素、编码号为GSB 04-1775-2004的铈元素、编码号为GSB 04-1717-2004的钡元素。

8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)-(5)为用于ICP-MS检测微量元素的全血样本前处理方法。

9.权利要求8所述的方法，其中所述血样包括健康成年人、儿童和孕妇的血样，以及疑似中毒人群的血样。

10.权利要求9的方法，其中所述检测方法用于检测环境微量毒素污染、检测微量兴奋剂成分、人体或尸体的法医毒物检测或鉴定，以及人体微量元素含量评估。

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