CN109307776A

CN109307776A - 一种改良的胃泌素17检测试剂盒

Info

Publication number: CN109307776A
Application number: CN201811365661.9A
Authority: CN
Inventors: 周金龙; 史小芹; 渠文涛; 刘雅奇; 冉盼盼; 马雷; 乔晓芳; 李晓霞; 付光宇; 吴学炜
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2019-02-05

Abstract

本发明公开了一种改良的胃泌素17检测试剂盒，包括包被有G‑17单抗的磁微粒混悬液，含有HRP标记G‑17单抗的酶结合物，样品稀释液和校准品四个组分；其样品稀释液是由0.01~0.2mol/L的缓冲液、0.1%~0.5%（w/v）的防腐剂、1%~10%（w/v）的保护蛋白、1%~10%（w/v）的EDTA、0.1%~0.5%（w/v）的十二烷基磺酸钠、0‑500 ug/mL的阻断剂和0.001%（g/v）的色素配制而成。本发明试剂盒基于磁微粒化学发光法制备而成，配合Auto Lumo A2000系列全自动免疫测定仪使用，可实现自动化检测，操作简便，检测速度快。本试剂盒采用了一种独特的样品稀释液，不仅可以消除新旧样本差异，而且有效地降低了HAMA引起的假阳或漏检概率，大大提高了胃泌素17的检测准确度。

Description

一种改良的胃泌素17检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，尤其是涉及一种改良的胃泌素17检测试剂盒。

背景技术

慢性胃炎是各种病理因素引起的胃黏膜的慢性炎性病变，表现为胃黏膜层淋巴细胞和浆细胞浸涧。长期的炎症反应及粘膜损伤修复过程，可导致黏膜萎缩、肠化生、上皮内瘤变等癌前病变。慢性胃炎的发病率在各种胃病中排第一位，根据2012年中华消化病学会的《中国慢性胃炎共识》，将慢性胃炎分为慢性非萎缩性胃炎和慢性萎缩性胃炎两大基本类型；中华医学会消化病分会的一项大规模的流行病学调查指出，目前我国慢性胃炎发病中，最常见的慢性胃炎类型是慢性非萎缩性胃炎，然后是慢性萎缩性胃炎，以及胆汁反流性胃炎伴糜烂等型。

据估计，每年大约有1.8%的萎缩性胃炎、10%肠上皮化生、73%异型增生的患者可能发展为胃癌。因此，寻找一种简便、非侵入性的大规模筛查早期胃癌及萎缩性胃炎的方法对于提升全民健康显得尤为重要。利用血清学诊断萎缩性胃炎及胃癌的研究已开展多年，尤其在日本、芬兰等国家。慢性萎缩性胃炎是指胃黏膜固有腺体减少的一类慢性胃炎，病变组织常被纤维组织代替，或出现肠上皮化生。2011年一项多中心临床流行病学研究表明，中国人群慢性萎缩性胃炎的发病率约为35.1％。慢性萎缩性胃炎是一种癌前疾病，Correa提出渐进式致癌模式，即慢性胃炎—萎缩—肠化—异型增生—胃癌的病变过程已被普遍接受，萎缩性胃炎患者中有相当一部分患者发展成胃癌。

胃泌素（gastrins）是由胃窦与十二指肠黏膜G细胞分泌的多肽类激素，1906年由英国学者Edkins发现并命名。人类胃泌素基因是单拷贝基因，位于染色体17q23区，全长4.1kb。G细胞转录产生单一且长度为0.7 kb的胃泌素mRNA，在粗面内质网中翻译生成含101个氨基酸残基的前胃泌素原。胃泌素翻译后加工是一个典型的由前激素原加工成激素原，再由激素原加工成具有不同作用的生物活性体过程，其种类包括酰胺化胃泌素34、甘氨酸延伸型胃泌素34、酰胺化胃泌素17、甘氨酸延伸型胃泌素17、胃泌素原，其中酰胺化胃泌素17为主要产物。G-17仅由胃窦部G细胞分泌，主要生理功能为刺激胃酸分泌、促进胃黏膜细胞增殖和分化，G-17在人体中的含量占有生物活性胃泌素总量的90%以上，因此，G-17 是反映胃窦内分泌功能的敏感指标之一，可提示胃窦黏膜萎缩状况是否存在异常增殖，血清 G-17 水平取决于胃内酸度和胃窦 G 细胞数量，G-17 本身在胃癌的发生、发展过程中亦有促进作用。研究表明，血清 G-17 水平升高可提示存在胃癌发生风险。此外，《中国早期胃癌筛查流程专家共识意见（草案）（2017，上海）》推荐联合检测 G-17 、 PG 及幽门螺杆菌检测可提高早期胃癌的检出率。

目前已上市的G-17检测试剂盒主要为Biohit公司生产的G-17测定试剂盒(酶联免疫法)，该试剂盒不仅操作繁琐，检测时间长（2.5h），而且线性范围偏窄（0.043-40 pmol/L），临床上遇到＞40pmol/L的样本需要稀释后才能准确检测。此外，文献报道的G-17检测试剂盒存在新旧样本差的问题，血清样本在25℃仅能稳定保存4h，在4℃仅能稳定保存20h（麦涛等，《实用医院临床杂志》 , 2018 (2)：26-29）。这些问题给胃泌素17项目的临床使用带来了很大的不便。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种改良的胃泌素17检测试剂盒，本发明试剂盒可实现自动化检测且操作简便，检测速度快。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的改良的胃泌素17检测试剂盒，包括包被有G-17单抗的磁微粒混悬液，含有HRP标记G-17单抗的酶结合物，样品稀释液和校准品四个组分；所述样品稀释液是由0.01~0.2mol/L的缓冲液、0.1%~0.5%（w/v）的防腐剂、1%~10%（w/v）的保护蛋白、1%~10%（w/v）的EDTA、0.1% ~0.5%（w/v）的十二烷基磺酸钠、0-500 ug/mL的阻断剂和0.001%（g/v）的色素配制而成。

所述样品稀释液中的阻断剂为中和HAMA干扰的人抗鼠抗体。

所述样品稀释液中的EDTA包括乙二胺四乙酸二钠或/和乙二胺四乙酸二钾。

本发明四个组分所用的缓冲液为PBS、Tris-HCl、MES、Taps、MOPS中的任一种，pH=6.0~8.0。

四个组分所用的稀释液中的保护蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、酪蛋白中的一种和/或两种以上组合。

四个组分所用的稀释液中的防腐剂为P300、Bro、MIT、NaN₃中的两种或两种以上组合。

本发明所用的磁微粒为表层覆盖有高分子材料的Fe₃O₄或Fe₂O₃磁性粒子，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。

本发明试剂盒基于磁微粒化学发光法制备而成，配合Auto Lumo A2000系列全自动免疫测定仪使用，可实现自动化检测，操作简便，检测速度快。与已上市的胃泌素17检测试剂盒相比，本发明提供的试剂盒具有较宽的检测范围（0.5-100pmol/L），免去了高值样本需要稀释才能准确检测的麻烦，更便于临床应用。另外，本试剂盒采用了一种独特的样品稀释液，不仅可以消除新旧样本差异，而且有效地降低了HAMA引起的假阳或漏检概率，大大提高了胃泌素17的检测准确度。

其作用原理如下：

补体是存在与血液中经钙镁离子激活后具有酶活性的蛋白质，可能对样本中的胃泌素17有一定降解作用。样本中加入EDTA可以鳌和血液中的钙镁离子，阻断补体经典激活途径，从而阻断血液中的补体激活，达到发挥消除新旧样本差的作用。

嗜异性抗体是由已知或未知的抗原刺激人体产生的一类能够与多种动物免疫球蛋白发生相对弱结合的多重特异性免疫球蛋白。目前免疫检测试剂盒所用的抗体大多数来源于实验动物，嗜异性抗体可与多种动物的免疫球蛋白的Fc和Fab表位发生非特异性结合，从而干扰检测结果出现假阳或漏检。针对此问题，本试剂盒的样品稀释液中添加了阻断剂，专门用于消除嗜异性抗体对检测结果的干扰，提高了胃泌素17检测结果的准确性。

附图说明

图1是本发明试剂盒与对照试剂盒的相关性对比。

图2是本发明试剂盒的线性范围考核。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的检测试剂和检测仪器均为本领域常规使用产品，本发明所用的检测方法为本领域常规使用的方法。

实施例1 配制PBS缓冲液（按1000 mL量）

称取0.592g NaH₂PO₄.2H₂O，5.80g Na₂HPO₄.12H₂O及9.0g NaCl加入到1000mL纯化水中，加入HCl调节pH至7.4±0.05，加入防腐剂P300 1g、MIT 1g，混合均匀，2-8℃保存待用。

实施例2 制备改良的胃泌素17检测试剂盒

1、制备磁微粒混悬液

首先配制封闭液（按1000 mL量）：取100mL PBS缓冲液，加入2.5%的牛血清白蛋白（BSA），混合均匀、分装，2-8℃保存待用。

将磁微粒原液30ul充分混匀、用磷酸盐缓冲液300ul洗涤3次，加入偶联活化剂100ul，混匀震荡2h，然后，按照0.1 ug/T的浓度加入G-17抗体，混匀震荡2 h，最后用封闭液封闭4次，定容至3ml，2-8℃保存待用。

2、制备酶结合物

将HRP标记G-17抗体按体积比1:1000加入到含有2% BSA的PBS缓冲液中，然后混合均匀、分装，2-8℃保存待用。

3、制备样品稀释液

PBS缓冲液中加入0.1%的防腐剂，2%牛血清白蛋白（BSA），1%的EDTA ，0.1%的十二烷基磺酸钠，500 ug/mL的阻断剂和0.001%的色素，混合均匀、分装，2-8℃保存待用。

4、制备校准品

向PBS缓冲液中添加1%的BSA保护蛋白，然后用该校准品稀释液将G-17抗原稀释成六个浓度点S0-S5(理论浓度分别是0 pmol/L、5 pmol/L、10 pmol/L、25 pmol/L、50 pmol/L、100pmol/L)，混匀、分装，2-8℃保存待用。

实施例3 本发明试剂盒的检测方法

在反应容器中一次加入校准品和样本，加样量均为25ul/孔。每孔分别加入磁微粒混悬液20ul，样品稀释液50ul，混匀后37℃温育15min，洗液洗涤5次。每孔加入酶结合物100ul，混匀后37℃温育17min，洗液洗涤5次，每孔分别加入底物A液和底物B液各50ul，混匀后1-5min内检测发光值，通过校准品曲线回算出G-17的浓度值。

本发明试剂盒通过样品稀释液中的EDTA和样本混合后起到发挥消除新旧样本差的作用。

实施例4 本发明试剂盒的临床性能评价

采用本发明试剂盒与Biohit Oyj.公司生产的G-17测定试剂盒(酶联免疫法)平行考核梯度样本198例，含阴性样本103份，浓度范围为0.5-98.13 pmol/L，Biohit试剂盒对超过40pmol/L的样本采用其说明书中方法稀释测定，检测结果进行临床相关性分析和符合率分析。符合率结果如表1所示，相关性如图1所示。

表1本发明试剂盒与对照试剂盒符合率比对

从表1结果可以看出，本发明试剂盒的灵敏度可达98.95%，特异性达99.02%，总符合率为98.99%。

从图1可以看出，本发明试剂盒和BIOHIT试剂盒有较好的相关性，R²=0.9964，且量值偏差较小。

实施例5 本发明试剂盒的精密性评价

取两批本发明的试剂盒进行精密度实验，分别检测高、中、低值样本各测20次，计算测定浓度的变异，测定结果如表2示。

表2本发明试剂盒精密性检测

表2结果表明变异系数均小于7%。

实施例6 本发明试剂盒的线性范围考核

取1例高值样本H（＞100 pmol/L），1例低值样本L（＜0.5 pmol/L）,分别按照如下比例进行混合成7个浓度样本（6H、5H+1L、4H+2L、3H+3L、2H+4L、1H+5L、6L），每个浓度样本检测3次，计算均值。将理论值与实测均值使用EXCEL软件进行一次方程y=ax+b回归分析，统计方程因子斜率a和相关性r，要求a=1±0.1，r＞0.99。结果如图2所示，可以看出本发明试剂盒线性范围可达0.5-100 pmol/L。

实施例7 本发明试剂盒的样本保存条件考核

取胃泌素17梯度新鲜样本10例，分别在0h、1h、4h、8h、16h、24h、2d、3d、5d进行检测，各时间检测结果与0h结果进行比较，考核样本稳定性。实验期间样本在2~8℃保存。结果如下：

表3本发明试剂盒样本保存时间研究

结果显示，本发明试剂盒在2～８℃的样本保存时间最长为３天。

Claims

1.一种改良的胃泌素17检测试剂盒，其特征在于：包括包被有G-17单抗的磁微粒混悬液，含有HRP标记G-17单抗的酶结合物，样品稀释液和校准品四个组分；所述样品稀释液是由0.01~0.2mol/L的缓冲液、0.1%~0.5%的防腐剂、1%~10%的保护蛋白、1%~10%的EDTA、0.1%~0.5%的十二烷基磺酸钠、0-500 ug/mL的阻断剂和0.001%的色素配制而成。

2.根据权利要求1所述的改良的胃泌素17检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液中的阻断剂为中和HAMA干扰的人抗鼠抗体。

3.根据权利要求1所述的改良的胃泌素17检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液中的EDTA包括乙二胺四乙酸二钠或/和乙二胺四乙酸二钾。

4.根据权利要求1所述的改良的胃泌素17检测试剂盒，其特征在于：所述四个组分所用的缓冲液为PBS、Tris-HCl、MES、Taps、MOPS中的任一种，pH=6.0~8.0。

5.根据权利要求1所述的改良的胃泌素17检测试剂盒，其特征在于：所述四个组分所用的稀释液中的保护蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、酪蛋白中的一种和/或两种以上组合。

6.根据权利要求1所述的改良的胃泌素17检测试剂盒，其特征在于：所述四个组分所用的稀释液中的防腐剂为P300、Bro、MIT、NaN₃中的两种或两种以上组合。

7.根据权利要求1所述的改良的胃泌素17检测试剂盒，其特征在于：所述磁微粒为表层覆盖有高分子材料的Fe₃O₄或Fe₂O₃磁性粒子，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。