CN110672849A - 一种s100蛋白的检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检验技术领域，特别涉及一种S100蛋白的检测试剂盒。该S100蛋白的检测试剂盒包括包被有S100抗体的磁微粒混悬液、样品稀释液、酶结合物、校准品和质控品；样品稀释液为含有螯合剂、防腐剂、蛋白质类稳定剂、分散剂、表面活性剂、阻断剂的Bis‑Tris缓冲液；螯合剂为EGTA，阻断剂为肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3或肿瘤清洁抗体4中的一种或两种以上混合物。该S100蛋白的检测试剂盒具有较宽的线性范围，灵敏度和特异性高，实现S100蛋白的快速、自动化检测。

Description

一种S100蛋白的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，特别涉及一种S100蛋白的检测试剂盒。
背景技术
恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3％～5％。2018年全球黑色素瘤新发病例287723例(占比1.6％)，死亡例数为60712例(占比0.6％)。据统计，2015年我国黑色素瘤新发病例8000例(占比0.2％)，死亡例数为3200例(占比0.1％)。黑色素瘤在我国虽然是少见恶性肿瘤，但病死率高，发病率也在逐年增加，因此，黑色素瘤已经成为严重危及我国人民健康的疾病之一。
我国黑色素瘤与欧美白种人差异较大，两者在发病机制、生物学行为、组织学形态、治疗方法以及预后等方面差异较大。在亚洲人和其他有色人种中，原发于肢端的黑色素瘤约占50％，常见的原发部位多见于足底、足趾、手指末端及甲下等肢端部位，原发于黏膜，如直肠、肛门、外阴、眼、口鼻咽部位的黑色素瘤约占20％～30％；而对于白种人来说，原发于皮肤的黑色素瘤约占90％，原发部位常见于背部、胸腹部和下肢皮肤；原发于黏膜的黑色素瘤只占1％～5％。
近些年在寻找恶性黑色素瘤的生物标志物方面已经做了大量工作，检测了多种生物分子，如黑色素瘤相关抗原、细胞因子、金属蛋白酶、血管形成因子、黏附分子、细胞生长因子、免疫调节分子和黑色素合成中的代谢物。在所有这些分子中，S100β是目前在恶性黑色素瘤中应用最广泛的生物标志分子，特别是在转移性黑色素瘤，S100β水平的升高与预后相关。升高的血清S100β水平强烈提示预后不良。S100β在恶性黑色素瘤的临床分期方面也具有预测价值。惟一不足的是，血清S100β水平的升高并不是恶性黑色素瘤所特有的，还见于肝、肾损伤，以及各种炎症和感染性疾病。
S100是由Moore从牛脑中分离到的一种神经系统特有的组分，由于这种组分在中性条件下可以很好地溶解于100％饱和硫酸铵中，因此命名为S100。S100含有两个多肽S100A1和S100β，它们的分子量接近于10KD，且含有两个结合Ca2+的EF-hand结构域。自从这两种S100蛋白被发现和定性以来，根据氨基酸序列和蛋白结构的相似性，已有20种该家族成员被发现，它们氨基酸序列的同源性达到25％～60％。绝大多数S100蛋白无论在Ca2+结合或非结合的状态下都以非共价键形成同源或异源二聚体，S100蛋白表达有组织和细胞特异性，这就决定了S100蛋白功能的多样性。血清S100β对各期恶性黑色素瘤患者都具有重要的临床意义。据报道，S100β在Ⅰ期和Ⅱ期(原发和局部)皮肤恶性黑色素瘤的诊断敏感性分别为15％或者更低，远低于Ⅳ期恶性黑色素瘤的60％～85％的敏感性。对局部淋巴结转移(Ⅲ期)，敏感性从10％～50％不等。最近一项研究采用了更低的S100β阈值(0.12μg/L)，发现S100β的敏感性在Ⅱ期大约为30％，在Ⅲ期患者为50％。逆转录-聚合酶链反应检测Ⅲ和Ⅳ期恶性黑色素瘤患者的多种生物标志物[酪氨酸酶、Melan-A(又名被T细胞识别的黑色素瘤抗原，MART-1)、黑色素瘤抗原3、糖蛋白100和p97]和S100β，结果显示S100β在发现转移方面具有最高的敏感性，并且这些生物标志的逆转录-聚合酶链反应结果和S100β的区别非常显著，在Ⅲ期疾病分别为18.2％和45.5％，Ⅳ期分别为45％和80％。
已有研究表明，血清中的S100还可以作为神经系统损伤的指标。各种脑补病变后，脑脊中S100水平升高并释放到外周血中。在一些事件造成的脑损伤中，如创伤性脑损伤或中风，可以检出S100。
目前S100蛋白检测试剂盒在CFDA上已取得文号的进口厂家仅有罗氏(电化学发光法)一家；而国内使用化学发光技术的仅2家，为长光华医(化学发光免疫分析法)和新产业(化学发光法)，均为磁微粒化学发光法，此外南京美宁康诚(量子点荧光免疫层析法)、广州一步(免疫荧光层析法)、沈阳优宁(荧光免疫层析法)、北京泰杰伟业(胶体金免疫层析法)和西安金磁纳米生物(金磁微粒免疫层析法)等均为免疫层析法。
在公开的专利CN201310572894(免疫比浊法)、CN201320598281(酶联免疫法)、CN201710917761(免疫比浊法)中公开了分别采用免疫比浊法或酶联免疫法用于检测S100蛋白。
但上述现有产品及专利产品均普遍存在线性范围不够宽的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种S100蛋白的检测试剂盒。该S100蛋白的检测试剂盒具有较宽的线性范围，灵敏度和特异性高，实现S100蛋白的快速、自动化检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种S100蛋白的检测试剂盒，包括包被有S100抗体的磁微粒混悬液、样品稀释液、酶结合物、校准品和质控品；
样品稀释液为含有螯合剂、防腐剂、蛋白质类稳定剂、分散剂、表面活性剂、阻断剂的Bis-Tris缓冲液；螯合剂为EGTA，阻断剂为肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3或肿瘤清洁抗体4中的一种或两种以上混合物。
作为优选，样品稀释液中各组分的浓度为：螯合剂0.1％～10％(w/v)，防腐剂0.1‰～10‰(w/v)，蛋白质类稳定剂1％～10％(w/v)，分散剂0.5‰～5‰(w/v)，表面活性剂0.5‰～5‰(w/v)，阻断剂10～300μg/mL。
优选地，样品稀释液中各组分的浓度为：螯合剂5％(w/v)，防腐剂1‰(w/v)，蛋白质类稳定剂2％(w/v)，分散剂1‰(w/v)，表面活性剂1‰(w/v)，阻断剂200μg/mL。
作为优选，样品稀释液中Bis-Tris缓冲液的浓度为0.01～0.1M，pH值为7.0～8.0。
在本发明提供的具体实施例中，样品稀释液中Bis-Tris缓冲液的浓度为0.05M，pH值为7.4。
作为优选，防腐剂为Proclin150、Proclin200、Proclin300或Proclin5000中的一种或两种以上的混合物；但防腐剂种类并非限定于此，本领域技术人员认为可行的防腐剂种类均在本发明的保护范围之内。
作为优选，蛋白质类稳定剂为酪蛋白、去激素人血清、牛血清白蛋白或小牛血清中的一种或两种以上的混合物；但蛋白质类稳定剂种类并非限定于此，本领域技术人员认为可行的蛋白质类稳定剂种类均在本发明的保护范围之内。
作为优选，分散剂为十二烷基磺酸钠、聚乙二醇中的一种或两种的混合物；但分散剂种类并非限定于此，本领域技术人员认为可行的分散剂种类均在本发明的保护范围之内。
作为优选，表面活性剂为Tween 20、CHAPS或OP中的一种或两种以上的混合物。但表面活性剂种类并非限定于此，本领域技术人员认为可行的表面活性剂种类均在本发明的保护范围之内。
作为优选，样品稀释液中还包括0.1‰～1‰的惰性色素。
在本发明提供的具体实施例中，样品稀释液中惰性色素的浓度为0.5‰。
在本发明提供的具体实施例中，惰性色素为惰性果绿色素、惰性胭脂红色素、惰性日落黄色素中的一种。但色素种类并非限定于此，本领域技术人员认为可行的色素种类均在本发明的保护范围之内。
以下内容中所用防腐剂、蛋白质类稳定剂、分散剂、表面活性剂、惰性色素的种类同上。
作为优选，包被有S100抗体的磁微粒混悬液为含0.1～1μg/T包被有S100抗体的磁微粒的封闭液；封闭液为含有0.1‰～10‰(w/v)防腐剂、1％～10％(w/v)蛋白质类稳定剂、0.1％～10％(w/v)蔗糖、1％～10％(w/v)甘油的Tris缓冲液。
优选地，包被有S100抗体的磁微粒混悬液为含0.2μg/T包被有S100抗体的磁微粒的封闭液。
优选地，封闭液为含有1‰(w/v)防腐剂、2％(w/v)蛋白质类稳定剂、1％(w/v)蔗糖、5％(w/v)甘油的Tris缓冲液。
作为优选，封闭液中Tris缓冲液的浓度为0.05～0.15M，pH值为7.0～8.0。
在本发明提供的具体实施例中，封闭液中Tris缓冲液的浓度为0.1M，pH值为7.2。
作为优选，酶结合物为含有酶标记S100抗体的酶结合物稀释液，酶结合物稀释液为含有0.1‰～10‰(w/v)防腐剂、0.5‰～5‰(w/v)表面活性剂、1％～10％(w/v)蛋白质类稳定剂、0.1％～10％(w/v)蔗糖、1％～10％(w/v)甘油的Bis-Tris缓冲液。
优选地，酶结合物为含有酶标记S100抗体的酶结合物稀释液，酶结合物稀释液为含有1‰(w/v)防腐剂、1‰(w/v)表面活性剂、2％(w/v)蛋白质类稳定剂的Bis-Tris缓冲液。
酶结合物稀释液还包括0.1‰～1‰(w/v)的惰性色素。
在本发明提供的具体实施例中，酶结合物稀释液中惰性色素的浓度为0.5‰(w/v)。
在本发明提供的具体实施例中，惰性色素为惰性果绿色素、惰性胭脂红色素、惰性日落黄色素中的一种。但各试剂中惰性色素种类不同。
作为优选，酶结合物稀释液中Bis-Tris缓冲液的浓度为0.01～0.1M，pH值为7.0～8.0。
在本发明提供的具体实施例中，酶结合物稀释液中Bis-Tris缓冲液的浓度为0.05M，pH值为7.4。
在本发明中，校准品或质控品为含有S100蛋白的校准品稀释液，校准品稀释液为含有0.1‰～10‰(w/v)防腐剂、1％～10％(w/v)蛋白质类稳定剂的MES缓冲液。
优选地，校准品稀释液为含有1‰(w/v)防腐剂、2％(w/v)蛋白质类稳定剂的MES缓冲液。
作为优选，校准品稀释液还包括0.1‰～1‰(w/v)的惰性色素。
在本发明提供的具体实施例中，校准品稀释液中惰性色素的浓度为0.5‰(w/v)。
在本发明提供的具体实施例中，校准品稀释液中惰性色素为惰性果绿色素、惰性胭脂红色素、惰性日落黄色素中的一种。但各试剂中惰性色素种类不同。
作为优选，校准品稀释液中MES缓冲液的浓度为0.05～0.15M，pH值为5.5～6.5。
在本发明提供的具体实施例中，校准品稀释液中MES缓冲液的浓度为0.1M，pH值为6.0。
在本发明中，校准品为一系列浓度在0～200ng/mL的S100蛋白稀释液，质控品为一系列浓度在0.5～10ng/mL的S100蛋白稀释液。
本发明提供了一种S100蛋白的检测试剂盒。该S100蛋白的检测试剂盒包括包被有S100抗体的磁微粒混悬液、样品稀释液、酶结合物、校准品和质控品；样品稀释液为含有螯合剂、防腐剂、蛋白质类稳定剂、分散剂、表面活性剂、阻断剂的Bis-Tris缓冲液；螯合剂为EGTA，阻断剂为肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3或肿瘤清洁抗体4中的一种或两种以上混合物。本发明具有的技术效果为：
本发明样品稀释液中加入10～300μg/mL阻断剂可有效降低抗原-抗体反应过程中的非特异性吸附，提高产品检测灵敏度，使得试剂盒能够达到更低的检测下限；配方中加入0.1％～10％(w/v)的螯合剂EGTA可显著提升试剂盒检测范围的上限。与现有方法相比，本发明试剂盒线性范围更宽：本发明试剂盒检测范围为0.02-200ng/mL，罗氏检测范围为0.005-39ng/mL，长光华医检测范围为0.1-20ng/mL，新产业检测范围0.05-50.0ng/mL；
与众多免疫层析法产品相比，本发明开发的S100蛋白检测试剂盒(磁微粒化学发光法)采用成熟的磁微粒化学发光平台技术实现了S100的自动化检测，出结果仅需40min，缩短了检测时间，并且具有更高的灵敏度和特异性。
附图说明
图1示本发明试剂盒与长光华医产品临床相关性。
具体实施方式
本发明公开了一种S100蛋白的检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种用于黑色素瘤诊断的S100蛋白检测试剂盒，该试剂盒基于磁微粒化学发光法平台制备而成，配套安图生物的全自动免疫测定仪(AutoLumo A1000、AutoLumo A2000系列)可实现S100的快速、自动化检测，40min即可出结果，使用方便，操作简单；
样品稀释液中添加了10～300μg/mL阻断剂(采用肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3、肿瘤清洁抗体4中的一种或两种以上混合物)，降低了抗原-抗体反应过程中普遍存在的非特异性吸附情况，从而提升了试剂盒的分析灵敏度；
样品稀释液的使用使得待测样品进行了系统内稀释，减少了检测过程中钩状效应(HOOK效应)的发生，样品稀释液中添加了0.1％～10％(w/v)的螯合剂EGTA，可以显著提升试剂盒检测范围的上限。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于黑色素瘤诊断的S100蛋白检测试剂盒，包括S100校准品，包被有S100第一抗体的磁微粒混悬液，样品稀释液，辣根过氧化物酶标记的S100第二抗体的酶结合物。
所述包被抗体与酶标抗体均为单克隆抗体或多克隆抗体，分别针对S100的不同识别位点。
所述S100校准品是由S100抗原配制成的浓度在0～200ng/mL之间的6个不同浓度点的校准品溶液。
所述磁微粒混悬液中的磁微粒是由S100抗体按照0.1～1.0μg/T包被而成。
所述S100酶结合物是由辣根过氧化物酶标记的S100抗体与酶结合物稀释液按照0.01％～0.1％(w/v)的比例稀释制成。所述酶结合物稀释液为pH7.4的Bis-Tris缓冲液；所述Bis-Tris缓冲液中包括防腐剂、表面活性剂和蛋白质类稳定剂，其中防腐剂为Proclin150、Proclin200、Proclin300或Proclin5000中的一种或两种以上混合物，表面活性剂为Tween 20、CHAPS或OP中的一种或两种以上混合物，蛋白质类稳定剂为酪蛋白、去激素人血清、牛血清白蛋白或小牛血清中的一种或两种以上混合物。
所述样品稀释液为pH7.4的Bis-Tris缓冲液；所述Bis-Tris缓冲液中包括螯合剂、防腐剂、蛋白质类稳定剂、分散剂、表面活性剂和阻断剂；其中螯合剂为0.1％～10％(w/v)的EGTA，防腐剂为Proclin150、Proclin200、Proclin300或Proclin5000中的一种或两种以上混合物，蛋白质类稳定剂为酪蛋白、去激素人血清、牛血清白蛋白或小牛血清中的一种或两种以上混合物，分散剂为十二烷基磺酸钠、聚乙二醇中的一种或两种混合物，表面活性剂为Tween 20、CHAPS或OP中的一种或两种以上混合物，阻断剂为肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3或肿瘤清洁抗体4中的一种或两种以上混合物，并且最终浓度为10～300μg/mL。
所述校准品稀释液为0.1M的pH值为6.0的MES缓冲液；所述MES缓冲液中包括防腐剂和蛋白质类稳定剂；其中防腐剂为Proclin150、Proclin200、Proclin300或Proclin5000中的一种或两种以上混合物，蛋白质类稳定剂为酪蛋白、去激素人血清、牛血清白蛋白或小牛血清中的一种或两种以上混合物。
本发明试剂盒的制备方法为：
1、制备校准品：将S100抗原分别按照一定的浓度溶解在校准品稀释液中，配制成浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL的校准品溶液，分别记为S0、S1、S2、S3、S4、S5。
2、制备磁微粒混悬液：选择合适的磁微粒原液，分别将S100抗体按照0.1～1.0μg/T的浓度包被到磁微粒表面，制成S100混悬液备用。
3、制备样品稀释液：向pH7.4的Bis-Tris缓冲体系中加入0.1％～10％(w/v)的螯合剂、1‰(w/v)防腐剂、2％(w/v)蛋白质类稳定剂、1‰(w/v)分散剂、1‰(w/v)表面活性剂和10～300μg/mL的阻断剂配制成样品稀释液。
4、制备酶结合物：向pH7.4的Bis-Tris缓冲体系中加入1‰(w/v)防腐剂、1‰(w/v)表面活性剂和2％(w/v)蛋白质类稳定剂配制成酶结合物稀释液，将酶标抗体用酶结合物稀释液按照0.01％～0.1％(w/v)的比例进行稀释配制成酶结合物。
经测试，本发明试剂盒的线性范围在0.02～200ng/mL。本发明采用双抗体夹心法原理进行S100蛋白的检测。用S100抗体包被磁微粒，辣根过氧化物酶标记S100抗体制备酶结合物；通过免疫反应形成抗体—抗原—抗体—酶复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与S100的含量成正比。
提升灵敏度方面可能会有其他技术方案，如将试剂盒所用的抗体进行修饰，切去抗体可能产生非特异性吸附的片段，以提升灵敏度，但该方案已经初步进行验证，暂未起到改善效果；
对检测范围上限也可能会有其他技术方案，如将待测样品进行检测后发现其超出线性范围上限，此时进行系统外稀释后再次检测(即试剂盒最大可稀释倍数，见实施例5)，但该方法会造成检测不便利，一份样本需2次以上检测才能得到结果，此外还有可能因钩状效应(HOOK效应)产生的假性低值样本(实际超限但直接检测结果在线性范围以内，甚至得到假阴性结果)从而导致临床误判(这也是各厂家试剂盒追求更高的检测上限的原因)。
本发明提供的S100蛋白的检测试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3、肿瘤清洁抗体4购自郑州伊美诺生物技术有限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1制备用于黑色素瘤诊断的S100蛋白检测试剂盒
一、试剂盒制备
1、配制封闭液
封闭液是由0.1M的pH7.2的Tris缓冲液配制而成，其中含有1‰(w/v)的防腐剂Proclin150，2％(w/v)的蛋白质类稳定剂去激素人血清，1％(w/v)的蔗糖和5％(w/v)的甘油。
2、配制酶结合物稀释液
酶结合物稀释液是由0.05M的pH 7.4的Bis-Tris缓冲液配制而成，其中含有1‰(w/v)防腐剂Proclin150，1‰(w/v)表面活性剂Tween 20，2％(w/v)蛋白质类稳定剂去激素人血清及0.5‰(w/v)的惰性胭脂红色素。
3、配制样品稀释液
样品稀释液是由0.05M的pH 7.4的Bis-Tris缓冲液配制而成，其中含有5％(w/v)的螯合剂EGTA，1‰(w/v)的防腐剂Proclin150，2％(w/v)的蛋白质类稳定剂去激素人血清，1‰(w/v)分散剂十二烷基磺酸钠、1‰(w/v)表面活性剂Tween 20和200μg/mL的阻断剂肿瘤清洁抗体1及0.5‰(w/v)的惰性果绿色素。
4、制备校准品稀释液
校准品稀释液是由0.1M的pH6.0的MES缓冲液配制而成，其中含有1‰(w/v)防腐剂Proclin150，2％(w/v)蛋白质类稳定剂去激素人血清以及0.5‰(w/v)的惰性日落黄色素。
5、制备磁微粒混悬液
a、取30μL混匀后的磁微粒原液用300μLPBS缓冲液(浓度0.1M，pH值为7.2)洗涤5次；
b、用20mg/mL的EDC和20mg/mL的NHS对磁微粒活化1小时；
c、用0.1M的pH为4.0的MES缓冲液将活化后的磁微粒洗涤2次；
d、按照0.2μg/测试的量加入抗体，包被2小时；
e、用1mol/L的乙醇胺终止反应30min；
f、用封闭液封闭4次；
g、加入3mL封闭液保存。
6、配制酶结合物
将S100酶标抗体按照0.05％的比例稀释到酶结合物缓冲液中，混匀后分装备用。
7、配制校准品和质控品
用校准品稀释液将S100纯品稀释为浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL，分别记为校准品S0、S1、S2、S3、S4、S5；另外再稀释0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL三个浓度，记为质控品Q1、Q2、Q3。
二、检测方法
检测原理：本发明试剂盒采用双抗体夹心法检测抗原。
反应过程：反应过程为两步法，第一步50μL校准品/质控品/待测标本、20μL磁微粒混悬液、50μL样品稀释液混匀后37℃温育反应15分钟，洗涤5遍；第二步加入100μL酶结合物于37℃温育反应17分钟，洗涤5遍，加入发光底物检测信号值。
量值回算：本试剂盒推荐采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为x轴，以校准品发光值的log值为y轴建立定标曲线，根据待测样本的发光值回算相应的浓度值。
实施例2本发明试剂盒精密性考核
取三批试剂盒进行精密性实验，将Q1、Q2、Q3各测20次计算浓度的变异，试剂盒分析内精密性及批间精密性测定结果如表1、表2所示。
表1试剂盒分析内精密性
Figure BDA0002269444430000101
Figure BDA0002269444430000111
表2试剂盒批间精密性
Figure BDA0002269444430000112
Figure BDA0002269444430000121
从表1数据可以看出，三批试剂盒低、中、高三个浓度质控品分析内变异系数均小于6％，从表2数据可以看出三批试剂盒低、中、高三个浓度质控品批间变异均小于5％，说明本发明试剂盒的精密性较好。
实施例3试剂盒灵敏度考核
空白限LoB考核方法：准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；检出限LoD考核方法：准备5份浓度范围为1-5倍LoB的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；功能灵敏度FS考核方法：采用LoD实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、SD和CV％，最接近20％的浓度为功能灵敏度。试剂选用不含阻断剂样品稀释液和含有200μg/mL阻断剂肿瘤清洁抗体1的样品稀释液两种，考核结果如表3、表4。
表3试剂盒分析灵敏度考核-不含阻断剂
指标 第1批(ng/mL) 第2批(ng/mL) 第3批(ng/mL)
LoB 0.102 0.093 0.105
LoD 0.387 0.306 0.419
FS 0.525 0.478 0.584
表4试剂盒分析灵敏度考核-含有阻断剂
指标 第1批(ng/mL) 第2批(ng/mL) 第3批(ng/mL)
LoB 0.001 0.001 0.002
LoD 0.009 0.007 0.009
FS 0.011 0.010 0.013
从表3和表4对比可以看出，含有200μg/mL阻断剂肿瘤清洁抗体1的样品稀释液试剂盒LoB、LoD、FS三个指标结果均远低于不含样品稀释液的结果，不含阻断剂试剂盒的功能灵敏度(FS约为0.60ng/mL)结果比含有阻断剂试剂盒的功能灵敏度(FS约为0.02ng/mL)高出30倍左右，由此可见样品稀释液中阻断剂的使用可大大减少抗原-抗体反应过程中的非特异性吸附，从而提升产品的分析灵敏度。
实施例4试剂盒线性范围考核
取9例高值样本H(＞200ng/mL)，1例低值样本L(＜0.02ng/mL)，分别按照如下比例混合成10个浓度样本(10H、8H+2L、6H+4L、4H+6L、2H+8L、1H+9L、0.5H+9.5L、0.25H+9.75L、0.125H+9.875L、10L)，每个浓度样本检测4次，计算均值。将理论值与实测均值使用EXCEL软件进行一次方程y＝ax+b回归分析，统计方程因子斜率a和相关性R2，要求a＝1±0.1，R2＞0.99。试剂选用三种不同样品稀释液，分别为不含螯合剂的样品稀释液、含有5％螯合剂EGTA的样品稀释液和含有5％螯合剂EDTA的样品稀释液，结果如表5、表6、表7所示。
由表5、表6可以看出，样品稀释液不含螯合剂时，试剂盒线性范围为0.02～60ng/mL，而当样品稀释液加入0.1％～10％螯合剂EGTA后，试剂盒线性范围可扩宽至0.02～200ng/mL，由此可见本发明试剂盒中由于样品稀释液中螯合剂EGTA的引入，显著提升了试剂盒检测范围上限。
由表7可以看出，样品稀释液中螯合剂使用EDTA时试剂盒线性范围为2.0～90ng/mL，虽然可在一定程度上扩宽线性范围上限至90ng/mL，但其线性范围下限为2ng/mL，远高于样品稀释液不含螯合剂或样品稀释液含螯合剂EGTA时的线性范围下限0.02ng/mL，说明样品稀释液中加入EDTA后对试剂盒低值区0.02-2ng/mL区段线性有明显影响，使其不能成为线性关系，而该试剂盒具有临床意义的参考值约为0.1ng/mL，因此含EDTA的样品稀释液不能满足试剂盒的需求。
表5试剂盒线性范围考核-不含螯合剂
Figure BDA0002269444430000131
Figure BDA0002269444430000141
表6试剂盒线性范围考核-含螯合剂EGTA
Figure BDA0002269444430000142
表7试剂盒线性范围考核-含螯合剂EDTA
Figure BDA0002269444430000152
实施例5本发明试剂盒试剂盒最大可稀释倍数考核
取5例浓度值为140～200ng/mL的高值样本，将高值样本与样本稀释液(安图生物检测试剂盒通用稀释液)分别按照如下比例进行稀释成5个浓度样本(1:1、1:3、1:7、1:15、1:31)，即将原高值样本稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，每个浓度样本检测3次，计算均值。将实测值乘以稀释倍数与原倍比较，每份样本同时满足三批试剂偏差＜10％的最大倍数设定为最大可稀释倍数。结果如表8所示，可以看出本发明试剂盒最大可稀释倍数为4倍，即本发明试剂盒可报告范围为0.02～800ng/mL。
表8试剂盒最大稀释倍数考核
Figure BDA0002269444430000161
Figure BDA0002269444430000171
实施例6本发明试剂盒与同类产品临床比对
采用本发明试剂盒和苏州长光华医生物试剂有限公司在售的同类产品“S100蛋白测定试剂盒(化学发光免疫分析法)”同时考核368例临床样本，符合率见表9。
表9本发明试剂盒与长光华医产品符合率
Figure BDA0002269444430000181
从上表结果看出，本发明试剂盒与苏州长光华医生物试剂有限公司同类产品阳性符合率为96.05％、阴性符合率为98.61％，总符合率为97.55％。考核的368例临床样本与长光华医产品相关性r＝0.9917，具体见附图1，说明本发明试剂盒与市场在售同类产品有良好的符合率和相关性，可以满足临床使用需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种S100蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括包被有S100抗体的磁微粒混悬液、样品稀释液、酶结合物、校准品和质控品；
所述样品稀释液为含有螯合剂、防腐剂、蛋白质类稳定剂、分散剂、表面活性剂、阻断剂的Bis-Tris缓冲液；所述螯合剂为EGTA，所述阻断剂为肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3或肿瘤清洁抗体4中的一种或两种以上混合物。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中各组分的浓度为：螯合剂0.1％～10％(w/v)，防腐剂0.1‰～10‰(w/v)，蛋白质类稳定剂1％～10％(w/v)，分散剂0.5‰～5‰(w/v)，表面活性剂0.5‰～5‰(w/v)，阻断剂10～300μg/mL。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中各组分的浓度为：螯合剂5％(w/v)，防腐剂1‰(w/v)，蛋白质类稳定剂2％(w/v)，分散剂1‰(w/v)，表面活性剂1‰(w/v)，阻断剂200μg/mL。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中Bis-Tris缓冲液的浓度为0.01～0.1M，pH值为7.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中防腐剂为Proclin150、Proclin200、Proclin300或Proclin5000中的一种或两种以上的混合物；
所述蛋白质类稳定剂为酪蛋白、去激素人血清、牛血清白蛋白或小牛血清中的一种或两种以上的混合物；
所述分散剂为十二烷基磺酸钠、聚乙二醇中的一种或两种的混合物；
所述表面活性剂为Tween 20、CHAPS或OP中的一种或两种以上的混合物。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中还包括0.1‰～1‰(w/v)的惰性色素。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述包被有S100抗体的磁微粒混悬液为含0.1～1μg/T包被有S100抗体的磁微粒的封闭液；所述封闭液为含有0.1‰～10‰(w/v)防腐剂、1％～10％(w/v)蛋白质类稳定剂、0.1％～10％(w/v)蔗糖、1％～10％(w/v)甘油的Tris缓冲液。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物为含有酶标记S100抗体的酶结合物稀释液，所述酶结合物稀释液为含有0.1‰～10‰(w/v)防腐剂、0.5‰～5‰(w/v)表面活性剂、1％～10％(w/v)蛋白质类稳定剂、0.1％～10％(w/v)蔗糖、1％～10％(w/v)甘油的Bis-Tris缓冲液。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述校准品或质控品为含有S100蛋白的校准品稀释液，所述校准品稀释液为含有0.1‰～10‰(w/v)防腐剂、1％～10％(w/v)蛋白质类稳定剂的MES缓冲液。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述校准品为一系列浓度在0～200ng/mL的S100蛋白稀释液，所述质控品为一系列浓度在0.5～10ng/mL的S100蛋白稀释液。
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